申请/专利权人：岭南现代农业科学与技术广东省实验室肇庆分中心

申请日：2022-06-20

公开（公告）日：2024-04-16

公开（公告）号：CN115197961B

主分类号：C12N15/85

分类号：C12N15/85;C12N15/34;C12N5/10;G01N33/569;C12R1/91

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.04.16#授权;2022.11.04#实质审查的生效;2022.10.18#公开

摘要：本发明公开了一种非洲猪瘟病毒B602L重组蛋白稳定表达细胞系及其构建方法和应用，在将B602L重组蛋白完成序列改造后，将其克隆至真核表达载体，进行真核表达，经过筛选能得到稳定表达B602L重组蛋白的CHO细胞株。利用本发明的构建方法能在1个月内筛选获得表达非洲猪瘟病毒B602L重组蛋白的CHO细胞株，并在没有G418筛选压力下，细胞系传至20代，仍可检测到外源重组蛋白，具有试验周期短、成功率高和表达成本低的优点。

主权项：1.一种非洲猪瘟病毒B602L重组蛋白稳定表达细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1）构建载体：分析非洲猪瘟B602L重组蛋白的基因序列的信号肽和酶切位点信息，B602L重组蛋白的核苷酸序列如SEQ.IDNO：1所示；在起始密码子ATG之前添加如SEQ.IDNO:2所示Kozac序列，在序列N端连接如SEQ.IDNO:3所示的小鼠IgGκ链信号肽序列；再在肽链C端连接组氨酸标签体以融合蛋白与目的蛋白相连接得到完成序列改造后的目的蛋白，完成序列改造后的目的蛋白的核苷酸序列如SEQ.IDNO：4所示，将完成序列改造后的目的蛋白克隆至真核表达载体；2）将步骤1）的克隆完成后的真核表达载体以脂质体方式转染到经过培养的CHO细胞，进行培养，收集上清和细胞，选取一半上清和细胞进行蛋白检测，另一半进行筛选；蛋白检测：将上清和细胞采用蛋白质印迹法进行蛋白检测，第一抗体为抗His标签鼠单克隆抗体，第二抗体为山羊抗小鼠的辣根过氧化物酶酶标抗体，最后用显色液避光显色，在凝胶成像仪上拍照，观察着色情况；筛选：将上清和细胞进行润洗，换新培养基进行培养，再加入抗性筛选试剂进行筛选培养，以有限稀释法筛选出若干个单克隆细胞株，经观察及鉴定正确后，扩大培养并冻存CHO细胞；将冻存的细胞复苏，连续传代，检测重组蛋白B602L能否表达。

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