申请/专利权人：湖北嫦娥生物股份有限公司

申请日：2021-01-28

公开（公告）日：2024-04-19

公开（公告）号：CN112877390B

主分类号：C12P21/06

分类号：C12P21/06;C07K1/16;C07K1/20;C07K5/103;C07K7/06;A61K38/07;A61K38/08;A61K35/60;A61P29/00

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.04.19#授权;2024.04.02#专利申请权的转移;2024.03.29#专利申请权的转移;2021.06.18#实质审查的生效;2021.06.01#公开

摘要：本发明属于水产品高值化利用领域，涉及一种功能性醇溶鲟鱼软骨制剂的制备方法；本发明通过前处理、高温液化、双酶分步酶解及醇提手段从鲟鱼软骨中得到具有醇溶性的软骨水解产物，以其对NO释放的抑制效果为分离评价指标，采用SephadexG‑15凝胶柱、ODS疏水层析柱对此水解产物进一步分离纯化，得到活性强、纯度高的醇溶性鲟鱼软骨抗炎肽；该肽组分对细胞活力未表现出明显影响，并能显著抑制LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞中NO的释放；本发明在不完全破坏鲟鱼软骨原有加工路线的同时，有助于实现鲟鱼副产物高值化利用，具有广阔的市场前景。

主权项：1.一种功能性醇溶鲟鱼软骨制剂的制备方法，其特征在于，步骤如下：（1）将鲟鱼的软骨通过加热煮沸处理，去除肉、脂质和筋膜，洗净沥干，利用低温真空斩拌机将软骨斩碎，得到鲟鱼软骨颗粒；（2）取步骤（1）中鲟鱼软骨颗粒于去离子水中进行液化处理，使软骨中的蛋白迁移到液体中，冷却后经均质处理，得到鲟鱼软骨热压提取物；（3）用去离子水调整步骤（2）得到的鲟鱼软骨热压提取物的可溶性固体含量，得到混合溶液；混合溶液中可溶性固体含量的质量分数为1%-6%；在混合溶液中加入胰蛋白酶进行酶解，根据混合液中可溶性固体含量的含量加入胰蛋白酶，每1g可溶性固体含量加入0.13g胰蛋白酶，设定胰蛋白酶的酶解温度、pH进行振荡酶解，酶解后得到混合液E；所述胰蛋白酶的酶解温度为37℃，酶解pH为7.0；所述振荡酶解的具体操作是：在恒温摇床中200rpm振荡酶解2h；然后在混合溶液E中加入木瓜蛋白酶进行酶解，酶解条件如下：根据混合液中可溶性固体的含量加入木瓜蛋白酶，每1g可溶性固体加入0.1g木瓜蛋白酶，设定木瓜蛋白酶的酶解温度、pH，进行振荡酶解；酶解结束后，得到酶解液加热至90℃，灭活酶的时间为20min，然后冷却至室温，离心后收集上清液进行抽滤，经抽滤后得到的溶液进行低温冷冻干燥，得到的产物即为鲟鱼软骨酶解产物；所述木瓜蛋白酶的酶解温度为60℃，酶解pH为7.0；所述振荡酶解的具体操作是：在恒温摇床中200rpm振荡酶解2h；（4）将步骤（3）中得到的鲟鱼软骨酶解产物用去离子水复溶，搅拌均匀得到混合溶液A，随后加入无水乙醇，得到混合溶液B，经静置、离心后，取上清液进行低压旋蒸以去除乙醇，收集溶液，经冷冻干燥处理后，得到的产物即为鲟鱼软骨醇溶性水解物；所述混合溶液A中酶解产物的浓度为20-200mgmL，混合溶液B中乙醇的体积浓度为85%-95%；（5）利用SephadexG-15凝胶柱对步骤（4）中鲟鱼软骨醇溶性水解物进行纯化，以去离子水为洗脱液，使用HD-A电脑采集器在280nm下实时监测吸光值，收集纯化后的组分并冻干，得到冻干的组分；所述纯化时上样的样品为醇溶性鲟鱼软骨水解物与去离子水的混合溶液，样品浓度为10-30mgmL；所述柱规格为1.2cm×50cm-1.2cm×70cm，流速为0.8-1.2mLmin，上样体积为1-2mL；（6）利用ODS疏水层析柱对步骤（5）中冻干的组分进一步纯化，以乙醇为流动相进行线性梯度洗脱，使用HD-A电脑采集器在280nm下实时监测吸光值，收集纯化后的组分，经低压旋蒸、冻干，得到的产物即为含有抗炎活性肽的醇溶鲟鱼软骨制剂；所述纯化时上样的样品为冻干的组分与去离子水的混合溶液，样品浓度为5~10mgmL；所述柱规格为1.2cm×50cm，流速为0.6-0.8mLmin，上样体积为1-2mL，洗脱液包括洗脱液A和洗脱液B，所述洗脱液A为10%乙醇水溶液，洗脱液B为纯乙醇溶液；所述醇溶鲟鱼软骨制剂包括两种具有抗炎潜能的多肽，其氨基酸序列如下：SEQIDNo.1：Leu-Thr-Gly–Pro；SEQIDNo.2：Val-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro。

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