申请/专利权人：中国海洋大学

申请日：2023-09-06

公开（公告）日：2024-04-26

公开（公告）号：CN117929740A

主分类号：G01N33/68

分类号：G01N33/68;G01N33/50;C12Q1/6888;C12Q1/686

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2024.05.14#实质审查的生效;2024.04.26#公开

摘要：一种检测梭子蟹血细胞自噬水平的方法，包括通过环境胁迫激活梭子蟹血细胞自噬并采集血淋巴；制备环境胁迫前后梭子蟹血细胞悬液；鉴定环境胁迫前后的梭子蟹血细胞悬液自噬体超微结构；测定梭子蟹血细胞自噬相关蛋白水平；实时荧光定量分析梭子蟹血细胞自噬相关基因表达水平变化；定性检测环境胁迫前后的血细胞悬液中血细胞自噬水平；对环境胁迫前后的血细胞悬液进行流式细胞检测；定量检测环境胁迫后的梭子蟹血细胞自噬水平；结合溶酶体活性检测梭子蟹血细胞自噬的效果。本发明首次提出检测梭子蟹血细胞自噬水平的方法，首次发现梭子蟹血细胞亚群分为透明细胞和颗粒细胞，为后续研究各种条件下自噬对血细胞的结构、形态及功能的影响奠定基础。

主权项：1.一种检测梭子蟹血细胞自噬水平的方法，包括以下步骤：步骤1，通过环境胁迫激活梭子蟹血细胞自噬并采集血淋巴；不少于其特征是还包括以下步骤：步骤2，制备环境胁迫前后梭子蟹血细胞悬液；步骤3，利用透射电镜鉴定环境胁迫前后的梭子蟹血细胞悬液自噬体超微结构；步骤4，酶联免疫吸附测定梭子蟹血细胞自噬相关蛋白水平；步骤5，实时荧光定量分析梭子蟹血细胞自噬相关基因表达水平变化，包括以下步骤：使用TransZolUpRNA试剂盒提取血细胞悬液样品中总RNA，每组中的样品均进行采样；通过1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整度，设置参数为电压150V、时间20min；超微量分光光度计NanoDrop2000测定RNA的纯度和浓度，RNA260280值在1.8~2.2之间视为合格；取800ngRNA，用EvoM-MLV逆转录试剂盒构建cDNA文库；利用引物设计软件设计基因引物序列，自噬相关基因包括LC3A，p62，BECN1，mTOR，AMPK，LAMP，β-actin作为内参基因；通过CFX96Touch实时荧光定量系统，用SYBR®GreenProTaqHS预混型荧光定量PCR试剂盒检测自噬相关基因相对表达量；步骤6，利用激光共聚焦显微镜定性检测环境胁迫前后的血细胞悬液中血细胞自噬水平；步骤7，基于前向散射光和侧向散射光指标，对环境胁迫前后的血细胞悬液进行流式细胞检测，圈定不同细胞亚群并构建回归模型；步骤8，利用流式细胞术定量检测环境胁迫后的梭子蟹血细胞自噬水平；步骤9，结合溶酶体活性检测梭子蟹血细胞自噬的效果。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 中国海洋大学 一种检测梭子蟹血细胞自噬水平的方法

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