申请/专利权人：河南师范大学

申请日：2024-01-19

公开（公告）日：2024-04-30

公开（公告）号：CN117947145A

主分类号：C12Q1/6844

分类号：C12Q1/6844;C12Q1/6888;C12N15/11

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2024.05.17#实质审查的生效;2024.04.30#公开

摘要：本发明公开了一种基于RPA‑CRISPRCas12a的咖啡短体线虫的快速检测方法，采集疑似感染线虫病害的植物组织为材料进行线虫DNA粗提取得到线虫DNA粗制提取液，再将线虫DNA粗制提取液加入到RPA扩增体系中进行RPA扩增反应，待扩增反应结束后将RPA扩增反应产物和TaqMan荧光探针加入到CRISPRCas12a反应体系内进行反应，再将反应体系置于蓝光LED灯下照射，如有荧光则为阳性结果，无发光则为阴性结果。本发明的检测方法快速高效，操作简单，并且不依赖于离心机、PCR仪等大型仪器，能够实现对咖啡短体线虫的快速检测。

主权项：1.一种基于RPA-CRISPRCas12a的咖啡短体线虫的快速检测方法，其特征在于具体过程为：采集疑似感染线虫病害的植物组织为材料进行线虫DNA粗提取得到线虫DNA粗制提取液，再将线虫DNA粗制提取液加入到RPA扩增体系中进行RPA扩增反应，待扩增反应结束后将RPA扩增反应产物和TaqMan荧光探针加入到CRISPRCas12a反应体系内进行反应，再将反应体系置于蓝光LED灯下照射，如有荧光则为阳性结果，无发光则为阴性结果；所述RPA扩增体系中RPA引物序列为：PcRF：5’-CCGATGAGATGGAAACGGACAGAGCTAGCGTATC-3’PcRR：5’-CAAAGCCTTGCCCCAATGTGGTGAACACCCAGAA-3’；所述CRISPRCas12a反应体系的组成为：NEBuffer42μL、crRNA0.75μM、Cas12a重组蛋白0.375μM和RNaseinhibitor10U，RNasefreeddH2O补至16.2μL，将混合组分于37℃加热5min，促进crRNA与Cas12a形成二元复合物即形成CRISPRCas12a反应体系；其中crRNA的全长核苷酸序列为：Pc-crRNA：UAAUUUCUACUAAGUGUAGACAGGUGGAGUGCGUUGAGGCAUCC； TaqMan荧光探针的序列为5’-FAM-TTATT-BHQ-3’。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 河南师范大学 一种基于RPA-CRISPR/Cas12a的咖啡短体线虫的快速检测方法

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