申请/专利权人：南开大学

申请日：2019-06-26

公开（公告）日：2024-04-30

公开（公告）号：CN110195044B

主分类号：C12N9/02

分类号：C12N9/02

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.04.30#授权;2019.09.27#实质审查的生效;2019.09.03#公开

摘要：本发明涉及一组可提高SOD稳定性和活性的氨基酸序列及其应用，它是一种来源于Paenibacillus属FeMn‑SOD的N端氨基酸序列。这组氨基酸序列具有以下特征：1）位于FeMn‑SOD蛋白的sodA功能域之前，序列长度为60‑296个氨基酸；2）其相互之间具有75‑100%的同源性；3）这组氨基酸序列可特异性结合金属离子Fe和Mg，并可将其结合的金属离子转移至SODA功能域，对Paenibacillus属的FeMn‑SOD的稳定性和活性具有决定性作用，可广泛应用于其它SOD（特别是常温SOD）的改造，显著提高其稳定性和活性。

主权项：1.一种N端氨基酸序列在用于提高大宝SOD蜜护肤品中的SOD的活性和稳定性中的应用，其中，所述的N端氨基酸序列如SEQIDNO:2所示；所述的N端氨基酸序列的应用是指将编码所述的氨基酸序列为SEQIDNO:2的核苷酸与编码B.subtilisBSn5的sodA功能域的核苷酸的N端连接后，经过克隆表达和金属离子重构的步骤，获得改造后的重组SOD，并将改造后的重组SOD添加于大宝SOD蜜护肤品中。

全文数据：一组可提高SOD活性和稳定性的氨基酸序列及其应用技术领域本发明涉及一组可提高SOD活性和稳定性的氨基酸序列及其应用。背景技术超氧化物歧化酶（Superoxidedismutase，简称SOD），是唯一能够特异性清除自由基O2·ˉ的抗氧化金属酶，是生物体防御氧毒性的关键。该酶广泛存在于自然界的生物体内，自1969年从牛红细胞发现并正式命名以来，科学家已从细菌、真菌、原生动物、藻类、昆虫、鱼类、植物和哺乳动物等生物体内都分离得到了SOD。由于SOD的特殊功效，其在医药、日用化工、食品、农业以及环保等领域具有广泛的应用价值。目前，SOD临床应用主要集中在抗炎症方面（以类风湿以及放射治疗后引起的炎症病人为主），此外对某些自身免疫性疾病（如红斑狼疮、皮肌炎）、肺气肿、抗癌和氧中毒等都有一定疗效；在食品工业主要用作食品添加剂和重要的功能性基料；在化妆品行业里主要用作抗炎、抗衰老的重要功能性成分。基于金属辅基不同，该酶可分为CuZn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD、Ni-SOD四种类型。Mn-SOD与Fe-SOD主要存在于原核生物中，二者序列及结构同源性很高，进化上相近；而CuZn-SOD存在于真核生物中，属于进化上的另一个分支。目前已开发的SOD产品绝大部分都是CuZn-SOD，最早是从动物的血、肝中分离提取的，近年来植物来源的SOD也有了大量相关报道。微生物来源的SOD，尤其嗜热菌中分离的SOD由于具有耐高温、稳定性好的特点，使其在化工应用中比常温酶具有更好的适用性，而越来越受到更多关注。嗜热SOD具有极高的热稳定性、耐受物理、化学变性剂的优良特性，在工农业生产中具有巨大的应用价值，主要来源与自然界分离，原料受限，难以满足工业化需要。目前对SOD进行生产加工以提高其热稳定性的方法主要有基因工程方法、研究SOD模拟物、化学修饰、酶固定化等，但普遍存在改造手段技术繁琐，操作困难，适应性差，且其效果并不太明显等弊端和局限性，这些问题已严重影响到了嗜热SOD的工业化进程。本专利涉及的一组可提高SOD耐热温度和热稳定性的氨基酸序列为实现SOD的耐热性改造提供了一种全新思路和方法，该方法操作简便、可行性强、适应性好，可实现传统工业用SOD的升级换代，具有重要的应用价值和前景。发明内容本发明的一个目的是提供一组来源于Paenibacillus属的13个特殊嗜热FeMn-SOD的N端氨基酸序列，这13个N端氨基酸序列具有以下特征：（1）位于FeMn-SOD蛋白的sodA功能域之前，序列长度为60-296个氨基酸，不能独立行使SOD的功能；（2）其相互之间具有75-100%的同源性；（3）都包含特殊的金属离子结合结构域。本发明的另一目的是提供一组来源于Paenibacillus属的13个特殊嗜热FeMn-SOD的N端氨基酸序列，这一组N端氨基酸序列对Paenibacillus属的FeMn-SOD的活性和稳定性具有决定性作用，除去这一组N端氨基酸序列后的Paenibacillus属的FeMn-SOD活性和稳定性大幅降低（具体详见实施例1所示）。本发明的另一目的是提供一种能表达重组超氧化物歧化酶（N端氨基酸序列添加到其它SOD的N端）的重组质粒pET-SODM1。本发明的再一目的是提供一种能产生上述重组超氧化物歧化酶（N端氨基酸序列添加到其它SOD的N端或sodA功能域的N端）的重组菌SODM1-BL21。本发明的再一目的是提供了SEQIDNO:1-13氨基酸序列在提高SOD的活性、提高SOD的稳定性方面的应用。实验结果证明：改组氨基酸序列的存在可显著提高SOD的活性和稳定性。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：本发明提供一组来源于Paenibacillus属的13个特殊嗜热FeMn-SOD的N端氨基酸序列，如SEQIDNO:1-13所示。上述一组来源于Paenibacillus属的13个特殊嗜热FeMn-SOD的N端氨基酸序列，其特征在于：（1）位于FeMn-SOD蛋白的sodA功能域之前，序列长度为159-296个氨基酸；（2）其相互之间具有75-100%的同源性；（3）都包含特殊金属离子结合结构域。上述一组来源于Paenibacillus属的13个特殊嗜热FeMn-SOD的N端氨基酸序列，其具有与SEQIDNO:1-13所示的氨基酸序列至少75%的同源性。上述一组来源于Paenibacillus属的13个特殊嗜热FeMn-SOD的N端氨基酸序列，其具有SEQIDNO:1-13所示的氨基酸序列中缺失、替换、或插入的多个氨基酸序列为2-100个。上述一组来源于Paenibacillus属的13个特殊嗜热FeMn-SOD的N端氨基酸序列，其特征在于，这组N端氨基酸序列可广泛应用于其它SOD，如本实施例中的枯草芽孢杆菌的Mn-SOD，通过一定方法，将这段N端氨基酸序列添加到其它SOD的N端或sodA功能域的N端，可以显著提高SOD的活性和稳定性。本发明提供的SEQIDNO:1-13氨基酸序列如下：PaenibacilluspolymyxaM1SEQIDNO:1MLSTYGSFLPLRVLEEIRHWKQQESWHVEVIKSATEGLEPAYVRLLDDWRTVFEQTERAAIELLEEQRSALDPVEQAWQHQEKKASSAPQAHTHQLDESSAHSRGSDASATGEKPLSESGLNSQPASQELNRRLDDLLQTANRQSQEYVRQLGLLTEHSHALRQQPKSAGVVIHAAHESQYFLISTTPFQEPGSIARATGLYHVAAEGEDYPEQAFRERHASMRGEGSGATKGVQSGQTQPSAAEKSLVGRPVPIGGPaenibacillusalveiA6-6i-xSEQIDNO:2MQLIYGPLMPVRVLEESAYWKQQEKKHTEVIRAIVPQLEPEYVQLLAQWEQVLSQTEDAARGQLRTALQQPDVLQPDQLQQLQELLRASVYQSEQFVQQLDAIKHNSQAVQHTEHAPVVFDHITERSQYFLKAIKPVFYPAVDPPGSNHNTRSNSSSSPPARIHAAGNEPSSHWPQHQYQPQQHQYPYPQQSIQGIHAHIGNTRSAQPEQDDETDGESFVPIGGPaenibacillusalveiDSM29SEQIDNO:3MQLIYGPLMPVRVLEESTYWKQQEKRNTEVIRAAVPQLEPEYVQLLAQWEQVLSQTEAAAKAQLRTALQRPDALQPEQLQQLQELLRASVYQSEQFVQHLEAIKHSSQAVQLTEHAPVVLDHIAERSQYFLQAIKPVFYPAQEQGSSSPVRSSHNTEPPARIHSTDVNEPSSNWPPYPPHQHQQYPQHQHQQYSMQGIHAFIGNSRSSQFEHSEESDDESFVPIGGPaenibacillusalveiTS-15SEQIDNO:4MQLIYGPLMPVRVLEESAYWKQQEKKHTEVIRAIVPQLEPEYVQLLAQWEQVLSQTEDAARGQLRTALQQPDVLQPDQLQQLQELLRASVYQSEQFVQQLDAIKHNSQAVQHTEQAPVVFDHITERSQYFLNAIKPVFYPAVESPGSNNNTRSSSSSSPPVRIHAAGNEPSAHWPQHQYQPQQHQYPYQQQSIQGIHAHIGNTRSAQPEQEQDDETDGESFVPIGGPaenibacillusassamensisSEQIDNO:5MLLIYGPYMPIRILEAIQDWKNQEKEHAVLIRSVVPELEPSFSQVLTEWEHVFAKTEETARGWLHNCISSDTRWDNSLLTQIDQLLGASVQQSEHFIQQLEHIKQYSQAVRYTSAAPLLCAHVVRESYVFVSVTKSLTSTPLAEAQANAAAYGQGPAAAYHSAAVRPNDVTAAIGSRPAQSQACAAGEAIPPQSERPPNGAGAMQHGTAHAPHAAALQHGSPYSPQAAASQHNSPYSPQGSPYAPQTAASAQPAAASEPQLRQAAPEEARPADNVYVPPGGPaenibacillusbarengoltziiSEQIDNO:6MLFVYGPFLPVRILEEIRFWKQQEAEHTEVIQAIVPSLEADYVKLLEEWKPIFERTEAAADKLLQYALATPHAATSHEVIRQTERLLRASCQQSQEFIRHLEYMLKHSAAVKSVPLAPVVLLHIIRESAYFLEVLERLNRPGEIAGSMAAAPPYPDPYHAAGAQPFYREEEAQELAAPPTSEHPELTDDASPAITDELNRFETSEVANPPEEPDGIETADISEASLEVEAEQEHKQEEQEQDELSLRQEPSADDNTETTTARVPERSVPIGGPaenibacilluscurdlanolyticusYK9SEQIDNO:7MLFVYGPQTPIRLLEEIRDWKRQEIEHAAMIRRFTPTLEPEFKWLLNEWEQPLRAAERVADRCLNEALTRSDNAGDGSSSAMTQAQADLLLQASAYQSQKLVEHLLHLMERSASLASAPAARSFILHAVRESNGFLGLQETYRYSYSPEQALAQSAEALRNADRSSHAGTQDIANAGDDPQGGSDADADRAPVAQVPIGGPaenibacillusdaejeonensisSEQIDNO:8MTQVQEQSESQRRLEQIERWKRREEEQTAQLLQVLPQLEPPLISVLQEWRPILRLTSRYAADWQQTRPFQSARPEPHTEIQVEWLTSEAVRQTEEWSRQLGVLLQHSRALAADPEASELVRQFIRESQETIGVQFTADPAAPPTFAAIEQYEEENRTIDGDTPSPDKPVNSAEADGEHSRAEEEPPNAPDMNGGAVGTDNHMSDDKPVPIGGPaenibacillusdarwinianusSEQIDNO:9MLFVDGPYVQLRLLEELQSWKKREKEHAAVLRAISPGSDPGFVRTLEEWESVFADTERCAEWWLNASLERPGLLPASAGPQLAALVHAARAQSEAFVRQLHDYRTHSADLRAAPVTSVIIGLMLRESQYLLDRSVGFDALQGERGEARARPPAAVPVGGPaenibacillusdendritiformisC454SEQIDNO:10MEYIYGSLMPVRVLEEIVFWKKQEREHIEVILAIVPQLEPEYVQVLREWEPVFTKTEEAASAWLQFILSQGGSTPSDTMHKIELLLKASVYQSEQFVKHLETMKQYSRAVQSVPLAPIVFDHIASESVYFLNVVHALKDKPLSSFAPPDAPGAHAVQPKAFIHEAPPVDSGSSSGAPAEAEYPLTAYDSESEEDSHSPAATAPQSPAPGILAYIGSAQTPQAAQAAQAAQGIQPVQPVQEHGEARSSREDAPFGSLPYRELPYTLPEGWPAGHPQHQPPVPEYYLRAEPASVPIGGPaenibacillusehimensisSEQIDNO:11MLYVYGSLMPLRVLEEIRFWKMQEREHTVVIRELVPKLEPEYAALLQQWEGVLAQTEAASQQWIEAVLRTKPPVGPYIIDKVNELLYASIAQSQEFIRQLFLILERSRPVRANPVVQTVFMHIIRESEYFLGVLHAVQNTPEGYEEFRAEEEADPSTQTRAPDEEQAHIHLWRSESESHPVDLNQLTATQEGTWSGERPPSPYARPVPIGPaenibacilluselgiiSEQIDNO:12MLYVYGSLMPLRVLEEIRFWKTQEREHTVVIRELVPTLEPEYAALLQQWEGVLAQTESASQQWIEAVLRAKHPVSPYIIDKVNELLYASIAQSKEFIRHLFLILERSRPVRANPVVQTVFLHIIRESEYFLGVLHAVQSSECYEEPRDEEAAETRSPGEEQAHIHLWRGESESAPVDLNQLTATQEGTWTGDRPQAPFSKPVPIGGPaenibacillusfonticolaSEQIDNO:13MLLVYGPYLPVRILEEIRFWKQQEAEHTDVIKAIVPGLEPYYVQLLNDWKRVFEETTLAANQLLQYATSSQHAACDPKLIHETEKLLNTAFRQSHEFVRQLYTILDCSHAVKAVPLAKTVLLHIIRESEYFLGVLETLNSPGAIKRNSEQFPSTPDLQQIAGDPHQLLGNGFPDSSPDLSDFGPDFDSKPRTEPWSESWSEPKLKIAAYEEEMTINDNRDKDDAVPIGG一种表达上述的超氧化物歧化酶（N端氨基酸序列添加到其它SOD的N端或sodA功能域的N端）的重组质粒pET-SODM1该质粒至少包括SEQIDNO:1-13所示的基因。上述表达重组超氧化物歧化酶（N端氨基酸序列添加到其它SOD的N端或sodA功能域的N端）的重组质粒的载体为pET-28a+（实验室常用已知载体）。一种产生上述的重组超氧化物歧化酶（N端氨基酸序列添加到其它SOD的N端或sodA功能域的N端）的重组菌，SODM1-BL21该重组菌导入了超氧化物歧化酶。上述产生重组超氧化物歧化酶（N端氨基酸序列添加到其它SOD的N端或sodA功能域的N端）的重组菌为大肠杆菌。上述产生重组超氧化物歧化酶（N端氨基酸序列添加到其它SOD的N端或sodA功能域的N端）的重组菌的大肠杆菌为大肠杆菌BL21菌株（购买后，保存在实验室）。上述的重组超氧化物歧化酶（N端氨基酸序列添加到其它SOD的N端或sodA功能域的N端）应用于催化超氧阴离子自由基，发生歧化反应生成氧气和双氧水。对本发明的重组超氧化物歧化酶（N端氨基酸序列添加到其它SOD的N端或sodA功能域的N端）基因所表达的酶分子的氨基酸进行一个或多个氨基酸替换、插入或缺失所得到的蛋白质也能达到本发明的目的。因而本发明还包括与SEQIDNO:1-13所示的氨基酸序列具有至少75%的同源性，优选具有至少90%的同源性，但同时具有重组超氧化物歧化酶活性的蛋白质。上面使用的术语“多个”可以是小于100的数目，优选为小于10的数目。本发明提出的上述重组超氧化物歧化酶（N端氨基酸序列添加到其它SOD的N端或sodA功能域的N端）的性能不同于已知的超氧化物歧化酶，将这段N段序列添加到其它SOD的N端或sodA功能域的N端，可以提高其它SOD的耐热温度和热稳定性，可高效催化超氧阴离子自由基O2·ˉ发生歧化反应生成氧气O2和双氧水H2O2。上述的重组超氧化物歧化酶（N端氨基酸序列添加到其它SOD的N端或sodA功能域的N端）改造后的重组超氧化物歧化酶主要应用于医药、卫生保健、食品或化妆品加，例如，将改造后的SOD添加于大宝SOD密后可显著提高其活性和稳定性：从上面的比较可以看出添加了重组超氧化物歧化酶的大宝SOD密其活性和稳定性均有显著提高。本发明公开的一组可提高SOD活性和稳定性的氨基酸序列所具有的积极效果在于：（1）阐明了一种提高SOD活性和稳定性的新方法。利用添加本专利中氨基酸序列的基因重组方法进行其他SOD的稳定性和活性改造和高效表达，具有重要应用价值，也为其高稳定性工业酶的改造提供新思路。（2）通过添加本专利中氨基酸序列所获得的SOD酶可在金属离子匮乏的环境下保持极好的稳定性，克服了其他不含该类特殊金属离子结合结构域的SOD在应用过程中出现的化学性质不稳定现象，有利于其在食品、化妆品、药品及保健品等领域的工业应用。（3）通过添加本专利中氨基酸序列提高SOD活性和稳定性的方法操作简单，成本低廉，重复性好，具有重要的工业应用前景和实际意义。附图说明图1为金属离子重构后SOD与SODA的活性恢复趋势。具体实施方式下面通过具体实施例并结合附图对本发明作进一步的详细说明。以下各实施例仅仅是用于说明而不是限制本发明。需要特别说明的是实施例中所用到的试剂均由市售，类芽胞杆菌PaenibacilluspolymyxaM1（分离自大港油田）。实施例1构建编码M1的FeMn-SOD全序列基因（sodM1）的克隆，并且构建编码SODM1的结构域sodA的DNA序列（sodAM1）的克隆，并且测定表达蛋白的最适活性及稳定性。1.类芽孢杆菌PaenibacilluspolymyxaM1总DNA的提取在本实施例中，采用从中国天津大港油田油井地层水分离获得的类芽孢杆菌PaenibacilluspolymyxaM1，取其过夜培养的新鲜培养物3mL，离心收集菌体，菌体悬于250μL50mMTris缓冲液中（pH8.0），加入10μL0.4MEDTA（pH8.0），混匀后37℃保温20min，之后加入30μL20mgL溶菌酶，混匀后37℃再保温20min，再加入5μL20mgL蛋白酶K，温柔混匀后，再加入20μL10%SDS，50℃保温至溶液澄清，分别用等体积酚:氯仿:异戊醇抽提两次，氯仿:异戊醇抽提一次，最后一次的上清溶液，加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，回收DNA，用70%乙醇洗，沉淀溶于100μLTE缓冲液（pH8.0，10mMTris，1mMEDTA），加入10mgLRNase2μL，65℃保温30min，分别用酚:氯仿:异戊醇、氯仿:异戊醇各抽提一次，上清液加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，回收DNA，用70%乙醇洗，真空干燥，沉淀溶于50μLTE缓冲液。DNA溶液的紫外分光光度计测定结果为A260A280=1.95，A260=0.73。2.超氧化物歧化酶基因的克隆和筛选2.1扩增M1的FeMn-SOD全序列基因（sodM1），取前面所述的总DNA溶液0.5μL（约10ng）作为模板，以下列寡核苷酸序列作为引物，并按下述设定的PCR循环参数进行25个循环PCR。设定的PCR循环参数如下：95℃，3min；95℃，30s；55℃，45s；72℃，2min；72℃，10min；4℃，2hr上游引物：5'-CGGGATCCCGCTGAGTACTTATGGGTCTTT-3'下游引物：5'-CCCAAGCTTGGAGGCTTGAGCATAGC-3'2.2扩增M1的FeMn-SOD的结构域sodA的DNA序列（sodAM1），取前面所述的总DNA溶液0.5μL（约10ng）作为模板，以下列寡核苷酸序列作为引物，并按下述设定的PCR循环参数进行25个循环PCR。设定的PCR循环参数如下：95℃，3min；95℃，30s；55℃，45s；72℃，2min；72℃，10min；4℃，2hr上游引物：5'CATCGGCTCCCTCCGCTTCC3'下游引物：5'CCCAAGCTTGGAGGCTTGAGCATAGC3'2.3扩增M1的N端DNA序列sodN，取前面所述的总DNA溶液0.5μL（约10ng）作为模板，以下列寡核苷酸序列作为引物，并按下述设定的PCR循环参数进行25个循环PCR。设定的PCR循环参数如下：95℃，3min；95℃，30s；55℃，45s；72℃，2min；72℃，10min；4℃，2hr上游引物：5'CGGGATCCCGCTGAGTACTTATGGGTCTTT3'下游引物：5'CCCAAGCTTTCCCCCAATAGGGACCGGG3'上述三组PCR产物纯化后都用NdeI和HindIII双酶切，分别与经同样限制型内切酶酶解并切胶回收的质粒pET-28a+连接，转化感受态大肠杆菌DH5α（购买后，保存在实验室）后，涂于含50μgmLKan（卡拉霉素）的LB固体培养基（Tryptone:1%；YeastExtract:0.5%;NaCl:1%。）上。37℃培养16～18小时，挑取单克隆菌落鉴定，插入有sodM1编码的DNA序列的pET-28a+质粒为重组质粒pLW01，含有该质粒的重组大肠杆菌DH5α为DH01。插入有sodAM1编码的序列的pET-28a+质粒为重组质粒pLW02，含有该质粒的重组大肠杆菌DH5α为DH02。采用Sanger双脱氧法对此DNA片段进行了测序，测序结果显示插入的DNA序列正确。然后将重组质粒pLW01和pLW02分别转化入大肠杆菌BL21中，此大肠杆菌BL21分别命名为BL01和BL02。3.重组超氧化物歧化酶的纯化和特性将上述重组菌BL01和BL02单克隆分别接入20mL含50μgmLKan的LB培养基中，37℃，180rpmmin培养12小时，然后将培养物按1%（VV）接种量接入200mL含50μgmLKan的LB培养基（共2个摇瓶），37℃，220rpmmin培养A600为0.6时，加入IPTG至终浓度为0.1mM,37℃,180rpmmin诱导3小时。离心收集菌体，悬于50mMTris-Cl（pH8.0）缓冲液中，利用超声波破碎细胞，离心上清液为重组超氧化物歧化酶的粗提液。此上清液经螯合琼脂糖凝胶（ChelatingSepharose）镍亲合柱层析纯化，得到的酶制剂在SDS-PAGE上显示一条带。理论上推算SOD-M1和SODA-M1的分子量分别为54.0kD和26.6kD，与SDS-PAGE检测结果一致。4.金属离子转移测定实验通过电感耦合等离子发光色谱仪对SOD的N端进行金属离子含量测定（表1）：5.重组超氧化物歧化酶（SOD）活性测定3mL反应混合液中14.5mML-甲硫氨酸加入2.7mL，30μLEDTA-Na2加入10ul，2.25mMNBT加入100uL，60mM核黄素加入100μL，PBS加入90μL，加入10μL的样品酶液。各试剂加完后充分混匀，取1管置于暗处，560nm比色时调零。另取1管不加蛋白酶，用磷酸钠缓冲液代替作为空白对照。其余几管待测样品置于一定温度光强为4000Lux条件下光照15min，然后立刻避光终止反应。在560nm波长处比色时，用置于黑暗处的样品液调零，测定各样品管光吸收并记录结果。在一定测定条件下将NBT光还原反应抑制到对照的50%时的酶量作为一个酶活力单位（U）6.NTD金属离子转移机制分别将M1SOD野生型与M1SODA功能区进行Fe金属离子重构，使得两种蛋白均处于离子空载状态。随后按照proteinmetal比例为1:1往蛋白溶液添加Fe，每隔一段时间取出蛋白样品，测定酶活，得到如下活性恢复趋势。可以看出，不含N端的SODA蛋白活性在很短的时间内恢复到了最大值，而含有N端的SOD野生型则表现出较慢的活性恢复趋势，这就表明N端与SODA功能区存在离子竞争关系，N端可以首先结合上金属离子，随着时间的推移，其所结合的金属离子逐步转移到SODA功能区，使得其酶活得以恢复，并最终达到最高活性。我们对60min时SOD和SODA的Fe含量进行测定，也验证了这一结论（图1）。实施例2构建编码B.subtilisBSn5的Mn-SOD全序列基因（sod-BSn5）的克隆，并且构建编码SOD-BSn5的结构域sodA的DNA序列（sodA-BSn5）的克隆，最后还要构建编码重组SOD（SOD-GTNG_2215的N端序列和B.subtilisBSn5的SODA重组结合成重组SOD）全序列基因（sod-combinant）的克隆。并且测定表达蛋白的酶活性及热稳定性。1.B.subtilisBSn5总DNA的提取在本实施例中，取其过夜培养的新鲜培养物3mL，离心收集菌体，菌体悬于250μL50mMTris缓冲液中（pH8.0），加入10μL0.4MEDTA（pH8.0），混匀后37℃保温20min，之后加入30μL20mgL溶菌酶，混匀后37℃再保温20min，再加入5μL20mgL蛋白酶K，温柔混匀后，再加入20μL10%SDS，50℃保温至溶液澄清，分别用等体积酚:氯仿:异戊醇抽提两次，氯仿:异戊醇抽提一次，最后一次的上清溶液，加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，回收DNA，用70%乙醇洗，沉淀溶于100μLTE缓冲液（pH8.0，10mMTris，1mMEDTA），加入10mgLRNase2μL，65℃保温30min，分别用酚:氯仿:异戊醇、氯仿:异戊醇各抽提一次，上清液加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，回收DNA，用70%乙醇洗，真空干燥，沉淀溶于50μLTE缓冲液。DNA溶液的紫外分光光度计测定结果为A260A280=1.96，A260=0.72。2.超氧化物歧化酶（SOD）基因的克隆和筛选2.1扩增BSn5的Mn-SOD全序列基因（sod-BSn5），取前面所述的总DNA溶液0.5μL（约10ng）作为模板，以下列寡核苷酸序列作为引物，并按下述设定的PCR循环参数进行25个循环PCR。设定的PCR循环参数如下：95℃，3min；95℃，30s；55℃，45s；72℃，2min；72℃，10min；4℃，2hr上游引物：5'GGAATTCATGAAACGTGAATCTTATCAAACG3'下游引物：5'CCGCTCGAGTTAATAGAGCTTCCAAACGACTTC3'2.2扩增BSn5的Mn-SOD的结构域sodA的DNA序列（sodA-BSn5），取前面所述的总DNA溶液0.5μL（约10ng）作为模板，以下列寡核苷酸序列作为引物，并按下述设定的PCR循环参数进行25个循环PCR。设定的PCR循环参数如下：95℃，3min；95℃，30s；55℃，45s；72℃，2min；72℃，10min；4℃，2hr上游引物：5'GGAATTCCATATGAAACAcGTGCTGCCAAAGCT3'下游引物：5'CGCGGATCCTTAATAGAGCTTCCAAACGACTTC3'2.3扩增重组SOD的DNA序列（sod-combinant）2.3.1扩增M1SOD的N端序列基因（sod_N-M1），取前面所述的总DNA溶液0.5μL（约10ng）作为模板，以下列寡核苷酸序列作为引物，并按下述设定的PCR循环参数进行25个循环PCR。设定的PCR循环参数如下：95℃，3min；95℃，30s；55℃，45s；72℃，2min；72℃，10min；4℃，2hr上游引物：5'GGAATTCCATATGGACGACCAAACGTTGTTTGC3'下游引物：5'GCACATGTTTCGAAACCGCC3'2.3.2扩增BSn5SOD的C端序列基因（sod_C-BSn5），取前面所述的总DNA溶液0.5μL（约10ng）作为模板，以下列寡核苷酸序列作为引物，并按下述设定的PCR循环参数进行25个循环PCR。设定的PCR循环参数如下：95℃，3min；95℃，30s；55℃，45s；72℃，2min；72℃，10min；4℃，2hr上游引物：5'GGCGGTTTCGAAACATGTGC3'下游引物：5'CGCGGATCCTTAATAGAGTTTCCAAACGACTTC3'2.3.3扩增重组SOD的DNA序列（sod-combinant），sod_N-M1和sod_C-BSn5各取0.25μL（约10ng）作为模板，以下列寡核苷酸序列作为引物，并按下述设定的PCR循环参数进行25个循环PCR。设定的PCR循环参数如下：95℃，3min；95℃，30s；55℃，45s；72℃，2min；72℃，10min；4℃，2hr上游引物：5'GGAATTCCATATGGACGACCAAACGTTGTTTGC3'下游引物：5'CGCGGATCCTTAATAGAGcTTCCAAACGACTTC3'sod-BSn5的PCR产物纯化后用EcoRIXhoI双酶切，sodA-BSn5和sod-combinant的PCR产物纯化后用NdeIBamH双酶切，以上酶切产物分别与经同样限制型内切酶酶解并切胶回收的质粒pET-28a+连接，转化感受态大肠杆菌DH5α（本实验室保存）后，涂于含50μgmLKan（卡拉霉素）的LB固体培养基上。37℃培养16～18小时，挑取单克隆菌落鉴定，插入有sod-BSn5编码的DNA序列的pET-28a+质粒为重组质粒pLW03，含有该质粒的重组大肠杆菌DH5α为DH03。插入有sodS-BSn5编码的DNA序列的pET-28a+质粒为重组质粒pLW04，含有该质粒的重组大肠杆菌DH5α为DH104。插入有sod-combinant编码的DNA序列的pET-28a+质粒为重组质粒pLW05，含有该质粒的重组大肠杆菌DH5α为DH05。采用Sanger双脱氧法对此DNA片段进行了测序，测序结果显示插入的DNA序列正确。将上述重组质粒pLW03、pLW04和pLW05分别转化入大肠杆菌BL21中，此大肠杆菌BL21分别命名为BL03、BL04和BL05。3.重组超氧化物歧化酶的纯化和特性将上述重组菌BL03、BL04和BL05单克隆分别接入20mL含50μgmLKan的LB培养基中，37℃，180rpmmin培养12小时，然后将培养物按1%（VV）接种量接入200mL含50μgmLKan的LB培养基（共2个摇瓶），37℃，220rpmmin培养A600为0.6时，BL03加入IPTG至终浓度为0.05mM,25℃,180rpmmin诱导3小时。BL04加入IPTG至终浓度为0.05mM,25℃,180rpmmin诱导3小时。BL05加入IPTG至终浓度为0.1mM,30℃,180rpmmin诱导3小时。诱导完后离心收集菌体，悬于50mMTris-Cl（pH8.0）缓冲液中，利用超声波破碎细胞，离心上清液为重组超氧化物歧化酶的粗提液。此上清液经螯合琼脂糖凝胶（ChelatingSepharose）镍亲合柱层析纯化，得到的酶制剂在SDS-PAGE上显示一条带。理论上推算SOD-BSn5、SODA-BSn5和SOD-combinant的分子量分别为37.28099kD、26.28290kD和53.61853kD，与SDS-PAGE检测结果一致。4.重组超氧化物歧化酶活性测定3mL反应混合液中14.5mML-甲硫氨酸加入2.7mL，30μLEDTA-Na2加入10μL，2.25mMNBT加入100μL，60μM核黄素加入100μL，PBS加入90μL，加入10μL的样品酶液。各试剂加完后充分混匀，取1管置于暗处，560nm比色时调零。另取1管不加蛋白酶，用磷酸钠缓冲液代替作为空白对照。其余几管待测样品置于一定温度光强为4000Lux条件下光照15min，然后立刻避光终止反应。在560nm波长处比色时，用置于黑暗处的样品液调零，测定各样品管光吸收并记录结果。在一定测定条件下将NBT光还原反应抑制到对照的50%时的酶量作为一个酶活力单位（U）5.重组超氧化物歧化酶金属离子稳定性测定蛋白酶结合金属离子分为两种方式：一种是在机体内补充金属离子，蛋白翻译后修饰；一种是在机体外补充金属离子，蛋白表达后进行金属离子重构。（1）蛋白翻译后修饰（制备Mn-medium-added和Fe-medium-addedSODM1和rSODM1-N）取重组菌株5μL接种于20mLLB培养基含50μgmLKan中，37℃，150rmin振荡培养过夜。将过夜培养的菌液按1%转接到200mLLB培养基含50μgmLKan中，37℃，150rmin振荡培养直至OD600在0.6～0.8之间。在培养基中加入一定量的IPTG，使其终浓度为0.05～0.2mM，同时加入MnSO4或FeSO4，终浓度为1mM。16℃～37℃，150rmin诱导表达3h后纯化。（2）金属离子重构（制备Mn-reconstituted和Fe-reconstitutedSODM1和rSODM1-N）1、将纯化好的SOD在含有50mM醋酸缓冲液（pH3.8），6M盐酸胍，10mMEDTA的溶液中30℃透析16h，使SOD充分变性并释放金属离子成为脱辅基蛋白。2、将脱辅基蛋白在50mM醋酸缓冲液（pH3.8），6M盐酸胍中30℃透析5h除去EDTA。3、将以上蛋白在50mM醋酸缓冲液（pH3.8），6M盐酸胍，10mMMgSO4或FeSO4中室温透析4h，结合金属离子,每隔五分钟取出一次蛋白样品。4、将以上蛋白在50mMTris-HCl缓冲液（pH7.5），6M盐酸胍，10mMMgSO4或FeSO4中室温透析4h，结合金属离子，每隔五分钟取出一次样品。5、将以上蛋白在50mMTris-HCl缓冲液（pH7.5），1mMMgSO4或FeSO4中室温透析4h除去盐酸胍。6、将以上蛋白在50mMTris-HCl缓冲液（pH7.5），0.5mMEDTA中室温透析12h除去未结合到蛋白活性中心的金属离子。7、最终在50mMTris-HCl缓冲液（pH7.5）室温透析5h去除EDTA，得到金属离子重构蛋白，将分次取出的样品分别测定酶活。以上金属结合蛋白以10%的硝酸进行消解后，用IRISIntrepidIIXSP型电感耦合等离子体发射光谱仪测定金属含量。配制浓度为1.0mgL,2.0mgL,和4.0mgL的Mg2+和Fe2+溶液来测定离子含量标准曲线。计算时将50mMTris-HCl缓冲液（pH7.5）及10%硝酸的离子含量作为空白对照。结论：融合了N端的SODA其会随着时间的推移缓慢恢复活性，说明在金属离子匮乏的情况下N端可向除M1以外的其他SODA功能域转移金属离子并维持其活性和稳定性。6.重组超氧化物歧化酶稳定性测定测定SOD对酸碱的耐受性，将纯化的SOD分别置于25℃下pH3-10的缓冲液中温育90min后，用上述标准反应（pH7.8，25℃）测定SOD的剩余活性。将最高的酶活力定义为100%，分别计算不同pH条件下SOD的剩余酶活性与最高酶活性的比值。缓冲液分别为50mM柠檬酸钠（pH3.0-8.0），50mMTris-Hcl（pH8.0-9.0），50mM甘氨酸-氢氧化钠（pH9.0-10.0）。测定抑制剂、清洁剂和变性剂对SOD活性的影响，将纯化的SOD分别置于终浓度为1mM或10mM的变性剂（乙二胺四乙酸（EDTA）和β-巯基乙醇（β-ME））、0.1%wv或vv或1%wv或vv的清洁剂（十二烷基磺酸钠（SDS））和2.5M的变性剂（尿素和盐酸胍）中，25℃保温30分钟，用上述标准反应（pH7.8，25℃）测定SOD的剩余活性。将不加变性剂、清洁剂、变性剂的反应作为对照，测得的酶活力定义为100%。分别计算不同条件下SOD的剩余酶活性。抗逆性实验证明N端对SOD的稳定性起到了一定的保护作用，我们推测N端的主要作用依然是在金属离子饥饿的情况下向SODA功能域转移金属离子，从而保证SOD能够正常行使功能。结论：N端氨基酸序列添加到SODA-BSn5的N端，可以显著提高常温SOD的稳定性和抗逆性。SEQUENCELISTING南开大学一组可提高SOD活性和稳定性的氨基酸序列及其应用13PatentInversion3.51257PRTPaenibacilluspolymyxaM11MetLeuSerThrTyrGlySerPheLeuProLeuArgValLeuGluGlu151015IleArgHisTrpLysGlnGlnGluSerTrpHisValGluValIleLys202530SerAlaThrGluGlyLeuGluProAlaTyrValArgLeuLeuAspAsp354045TrpArgThrValPheGluGlnThrGluArgAlaAlaIleGluLeuLeu505560GluGluGlnArgSerAlaLeuAspProValGluGlnAlaTrpGlnHis65707580GlnGluLysLysAlaSerSerAlaProGlnAlaHisThrHisGlnLeu859095AspGluSerSerAlaHisSerArgGlySerAspAlaSerAlaThrGly100105110GluLysProLeuSerGluSerGlyLeuAsnSerGlnProAlaSerGln115120125GluLeuAsnArgArgLeuAspAspLeuLeuGlnThrAlaAsnArgGln130135140SerGlnGluTyrValArgGlnLeuGlyLeuLeuThrGluHisSerHis145150155160AlaLeuArgGlnGlnProLysSerAlaGlyValValIleHisAlaAla165170175HisGluSerGlnTyrPheLeuIleSerThrThrProPheGlnGluPro180185190GlySerIleAlaArgAlaThrGlyLeuTyrHisValAlaAlaGluGly195200205GluAspTyrProGluGlnAlaPheArgGluArgHisAlaSerMetArg210215220GlyGluGlySerGlyAlaThrLysGlyValGlnSerGlyGlnThrGln225230235240ProSerAlaAlaGluLysSerLeuValGlyArgProValProIleGly245250255Gly2224PRTPaenibacillusalveiA6-6i-x2MetGlnLeuIleTyrGlyProLeuMetProValArgValLeuGluGlu151015SerAlaTyrTrpLysGlnGlnGluLysLysHisThrGluValIleArg202530AlaIleValProGlnLeuGluProGluTyrValGlnLeuLeuAlaGln354045TrpGluGlnValLeuSerGlnThrGluAspAlaAlaArgGlyGlnLeu505560ArgThrAlaLeuGlnGlnProAspValLeuGlnProAspGlnLeuGln65707580GlnLeuGlnGluLeuLeuArgAlaSerValTyrGlnSerGluGlnPhe859095ValGlnGlnLeuAspAlaIleLysHisAsnSerGlnAlaValGlnHis100105110ThrGluHisAlaProValValPheAspHisIleThrGluArgSerGln115120125TyrPheLeuLysAlaIleLysProValPheTyrProAlaValAspPro130135140ProGlySerAsnHisAsnThrArgSerAsnSerSerSerSerProPro145150155160AlaArgIleHisAlaAlaGlyAsnGluProSerSerHisTrpProGln165170175HisGlnTyrGlnProGlnGlnHisGlnTyrProTyrProGlnGlnSer180185190IleGlnGlyIleHisAlaHisIleGlyAsnThrArgSerAlaGlnPro195200205GluGlnAspAspGluThrAspGlyGluSerPheValProIleGlyGly2102152203226PRTPaenibacillusalveiDSM293MetGlnLeuIleTyrGlyProLeuMetProValArgValLeuGluGlu151015SerThrTyrTrpLysGlnGlnGluLysArgAsnThrGluValIleArg202530AlaAlaValProGlnLeuGluProGluTyrValGlnLeuLeuAlaGln354045TrpGluGlnValLeuSerGlnThrGluAlaAlaAlaLysAlaGlnLeu505560ArgThrAlaLeuGlnArgProAspAlaLeuGlnProGluGlnLeuGln65707580GlnLeuGlnGluLeuLeuArgAlaSerValTyrGlnSerGluGlnPhe859095ValGlnHisLeuGluAlaIleLysHisSerSerGlnAlaValGlnLeu100105110ThrGluHisAlaProValValLeuAspHisIleAlaGluArgSerGln115120125TyrPheLeuGlnAlaIleLysProValPheTyrProAlaGlnGluGln130135140GlySerSerSerProValArgSerSerHisAsnThrGluProProAla145150155160ArgIleHisSerThrAspValAsnGluProSerSerAsnTrpProPro165170175TyrProProHisGlnHisGlnGlnTyrProGlnHisGlnHisGlnGln180185190TyrSerMetGlnGlyIleHisAlaPheIleGlyAsnSerArgSerSer195200205GlnPheGluHisSerGluGluSerAspAspGluSerPheValProIle210215220GlyGly2254226PRTPaenibacillusalveiTS-154MetGlnLeuIleTyrGlyProLeuMetProValArgValLeuGluGlu151015SerAlaTyrTrpLysGlnGlnGluLysLysHisThrGluValIleArg202530AlaIleValProGlnLeuGluProGluTyrValGlnLeuLeuAlaGln354045TrpGluGlnValLeuSerGlnThrGluAspAlaAlaArgGlyGlnLeu505560ArgThrAlaLeuGlnGlnProAspValLeuGlnProAspGlnLeuGln65707580GlnLeuGlnGluLeuLeuArgAlaSerValTyrGlnSerGluGlnPhe859095ValGlnGlnLeuAspAlaIleLysHisAsnSerGlnAlaValGlnHis100105110ThrGluGlnAlaProValValPheAspHisIleThrGluArgSerGln115120125TyrPheLeuAsnAlaIleLysProValPheTyrProAlaValGluSer130135140ProGlySerAsnAsnAsnThrArgSerSerSerSerSerSerProPro145150155160ValArgIleHisAlaAlaGlyAsnGluProSerAlaHisTrpProGln165170175HisGlnTyrGlnProGlnGlnHisGlnTyrProTyrGlnGlnGlnSer180185190IleGlnGlyIleHisAlaHisIleGlyAsnThrArgSerAlaGlnPro195200205GluGlnGluGlnAspAspGluThrAspGlyGluSerPheValProIle210215220GlyGly2255281PRTPaenibacillusassamensis5MetLeuLeuIleTyrGlyProTyrMetProIleArgIleLeuGluAla151015IleGlnAspTrpLysAsnGlnGluLysGluHisAlaValLeuIleArg202530SerValValProGluLeuGluProSerPheSerGlnValLeuThrGlu354045TrpGluHisValPheAlaLysThrGluGluThrAlaArgGlyTrpLeu505560HisAsnCysIleSerSerAspThrArgTrpAspAsnSerLeuLeuThr65707580GlnIleAspGlnLeuLeuGlyAlaSerValGlnGlnSerGluHisPhe859095IleGlnGlnLeuGluHisIleLysGlnTyrSerGlnAlaValArgTyr100105110ThrSerAlaAlaProLeuLeuCysAlaHisValValArgGluSerTyr115120125ValPheValSerValThrLysSerLeuThrSerThrProLeuAlaGlu130135140AlaGlnAlaAsnAlaAlaAlaTyrGlyGlnGlyProAlaAlaAlaTyr145150155160HisSerAlaAlaValArgProAsnAspValThrAlaAlaIleGlySer165170175ArgProAlaGlnSerGlnAlaCysAlaAlaGlyGluAlaIleProPro180185190GlnSerGluArgProProAsnGlyAlaGlyAlaMetGlnHisGlyThr195200205AlaHisAlaProHisAlaAlaAlaLeuGlnHisGlySerProTyrSer210215220ProGlnAlaAlaAlaSerGlnHisAsnSerProTyrSerProGlnGly225230235240SerProTyrAlaProGlnThrAlaAlaSerAlaGlnProAlaAlaAla245250255SerGluProGlnLeuArgGlnAlaAlaProGluGluAlaArgProAla260265270AspAsnValTyrValProProGlyGly2752806272PRTPaenibacillusbarengoltzii6MetLeuPheValTyrGlyProPheLeuProValArgIleLeuGluGlu151015IleArgPheTrpLysGlnGlnGluAlaGluHisThrGluValIleGln202530AlaIleValProSerLeuGluAlaAspTyrValLysLeuLeuGluGlu354045TrpLysProIlePheGluArgThrGluAlaAlaAlaAspLysLeuLeu505560GlnTyrAlaLeuAlaThrProHisAlaAlaThrSerHisGluValIle65707580ArgGlnThrGluArgLeuLeuArgAlaSerCysGlnGlnSerGlnGlu859095PheIleArgHisLeuGluTyrMetLeuLysHisSerAlaAlaValLys100105110SerValProLeuAlaProValValLeuLeuHisIleIleArgGluSer115120125AlaTyrPheLeuGluValLeuGluArgLeuAsnArgProGlyGluIle130135140AlaGlySerMetAlaAlaAlaProProTyrProAspProTyrHisAla145150155160AlaGlyAlaGlnProPheTyrArgGluGluGluAlaGlnGluLeuAla165170175AlaProProThrSerGluHisProGluLeuThrAspAspAlaSerPro180185190AlaIleThrAspGluLeuAsnArgPheGluThrSerGluValAlaAsn195200205ProProGluGluProAspGlyIleGluThrAlaAspIleSerGluAla210215220SerLeuGluValGluAlaGluGlnGluHisLysGlnGluGluGlnGlu225230235240GlnAspGluLeuSerLeuArgGlnGluProSerAlaAspAspAsnThr245250255GluThrThrThrAlaArgValProGluArgSerValProIleGlyGly2602652707200PRTPaenibacilluscurdlanolyticusYK97MetLeuPheValTyrGlyProGlnThrProIleArgLeuLeuGluGlu151015IleArgAspTrpLysArgGlnGluIleGluHisAlaAlaMetIleArg202530ArgPheThrProThrLeuGluProGluPheLysTrpLeuLeuAsnGlu354045TrpGluGlnProLeuArgAlaAlaGluArgValAlaAspArgCysLeu505560AsnGluAlaLeuThrArgSerAspAsnAlaGlyAspGlySerSerSer65707580AlaMetThrGlnAlaGlnAlaAspLeuLeuLeuGlnAlaSerAlaTyr859095GlnSerGlnLysLeuValGluHisLeuLeuHisLeuMetGluArgSer100105110AlaSerLeuAlaSerAlaProAlaAlaArgSerPheIleLeuHisAla115120125ValArgGluSerAsnGlyPheLeuGlyLeuGlnGluThrTyrArgTyr130135140SerTyrSerProGluGlnAlaLeuAlaGlnSerAlaGluAlaLeuArg145150155160AsnAlaAspArgSerSerHisAlaGlyThrGlnAspIleAlaAsnAla165170175GlyAspAspProGlnGlyGlySerAspAlaAspAlaAspArgAlaPro180185190ValAlaGlnValProIleGlyGly1952008212PRTPaenibacillusdaejeonensis8MetThrGlnValGlnGluGlnSerGluSerGlnArgArgLeuGluGln151015IleGluArgTrpLysArgArgGluGluGluGlnThrAlaGlnLeuLeu202530GlnValLeuProGlnLeuGluProProLeuIleSerValLeuGlnGlu354045TrpArgProIleLeuArgLeuThrSerArgTyrAlaAlaAspTrpGln505560GlnThrArgProPheGlnSerAlaArgProGluProHisThrGluIle65707580GlnValGluTrpLeuThrSerGluAlaValArgGlnThrGluGluTrp859095SerArgGlnLeuGlyValLeuLeuGlnHisSerArgAlaLeuAlaAla100105110AspProGluAlaSerGluLeuValArgGlnPheIleArgGluSerGln115120125GluThrIleGlyValGlnPheThrAlaAspProAlaAlaProProThr130135140PheAlaAlaIleGluGlnTyrGluGluGluAsnArgThrIleAspGly145150155160AspThrProSerProAspLysProValAsnSerAlaGluAlaAspGly165170175GluHisSerArgAlaGluGluGluProProAsnAlaProAspMetAsn180185190GlyGlyAlaValGlyThrAspAsnHisMetSerAspAspLysProVal195200205ProIleGlyGly2109159PRTPaenibacillusdarwinianus9MetLeuPheValAspGlyProTyrValGlnLeuArgLeuLeuGluGlu151015LeuGlnSerTrpLysLysArgGluLysGluHisAlaAlaValLeuArg202530AlaIleSerProGlySerAspProGlyPheValArgThrLeuGluGlu354045TrpGluSerValPheAlaAspThrGluArgCysAlaGluTrpTrpLeu505560AsnAlaSerLeuGluArgProGlyLeuLeuProAlaSerAlaGlyPro65707580GlnLeuAlaAlaLeuValHisAlaAlaArgAlaGlnSerGluAlaPhe859095ValArgGlnLeuHisAspTyrArgThrHisSerAlaAspLeuArgAla100105110AlaProValThrSerValIleIleGlyLeuMetLeuArgGluSerGln115120125TyrLeuLeuAspArgSerValGlyPheAspAlaLeuGlnGlyGluArg130135140GlyGluAlaArgAlaArgProProAlaAlaValProValGlyGly14515015510296PRTPaenibacillusdendritiformisC45410MetGluTyrIleTyrGlySerLeuMetProValArgValLeuGluGlu151015IleValPheTrpLysLysGlnGluArgGluHisIleGluValIleLeu202530AlaIleValProGlnLeuGluProGluTyrValGlnValLeuArgGlu354045TrpGluProValPheThrLysThrGluGluAlaAlaSerAlaTrpLeu505560GlnPheIleLeuSerGlnGlyGlySerThrProSerAspThrMetHis65707580LysIleGluLeuLeuLeuLysAlaSerValTyrGlnSerGluGlnPhe859095ValLysHisLeuGluThrMetLysGlnTyrSerArgAlaValGlnSer100105110ValProLeuAlaProIleValPheAspHisIleAlaSerGluSerVal115120125TyrPheLeuAsnValValHisAlaLeuLysAspLysProLeuSerSer130135140PheAlaProProAspAlaProGlyAlaHisAlaValGlnProLysAla145150155160PheIleHisGluAlaProProValAspSerGlySerSerSerGlyAla165170175ProAlaGluAlaGluTyrProLeuThrAlaTyrAspSerGluSerGlu180185190GluAspSerHisSerProAlaAlaThrAlaProGlnSerProAlaPro195200205GlyIleLeuAlaTyrIleGlySerAlaGlnThrProGlnAlaAlaGln210215220AlaAlaGlnAlaAlaGlnGlyIleGlnProValGlnProValGlnGlu225230235240HisGlyGluAlaArgSerSerArgGluAspAlaProPheGlySerLeu245250255ProTyrArgGluLeuProTyrThrLeuProGluGlyTrpProAlaGly260265270HisProGlnHisGlnProProValProGluTyrTyrLeuArgAlaGlu275280285ProAlaSerValProIleGlyGly29029511210PRTPaenibacillusehimensis11MetLeuTyrValTyrGlySerLeuMetProLeuArgValLeuGluGlu151015IleArgPheTrpLysMetGlnGluArgGluHisThrValValIleArg202530GluLeuValProLysLeuGluProGluTyrAlaAlaLeuLeuGlnGln354045TrpGluGlyValLeuAlaGlnThrGluAlaAlaSerGlnGlnTrpIle505560GluAlaValLeuArgThrLysProProValGlyProTyrIleIleAsp65707580LysValAsnGluLeuLeuTyrAlaSerIleAlaGlnSerGlnGluPhe859095IleArgGlnLeuPheLeuIleLeuGluArgSerArgProValArgAla100105110AsnProValValGlnThrValPheMetHisIleIleArgGluSerGlu115120125TyrPheLeuGlyValLeuHisAlaValGlnAsnThrProGluGlyTyr130135140GluGluPheArgAlaGluGluGluAlaAspProSerThrGlnThrArg145150155160AlaProAspGluGluGlnAlaHisIleHisLeuTrpArgSerGluSer165170175GluSerHisProValAspLeuAsnGlnLeuThrAlaThrGlnGluGly180185190ThrTrpSerGlyGluArgProProSerProTyrAlaArgProValPro195200205IleGly21012206PRTPaenibacilluselgii12MetLeuTyrValTyrGlySerLeuMetProLeuArgValLeuGluGlu151015IleArgPheTrpLysThrGlnGluArgGluHisThrValValIleArg202530GluLeuValProThrLeuGluProGluTyrAlaAlaLeuLeuGlnGln354045TrpGluGlyValLeuAlaGlnThrGluSerAlaSerGlnGlnTrpIle505560GluAlaValLeuArgAlaLysHisProValSerProTyrIleIleAsp65707580LysValAsnGluLeuLeuTyrAlaSerIleAlaGlnSerLysGluPhe859095IleArgHisLeuPheLeuIleLeuGluArgSerArgProValArgAla100105110AsnProValValGlnThrValPheLeuHisIleIleArgGluSerGlu115120125TyrPheLeuGlyValLeuHisAlaValGlnSerSerGluCysTyrGlu130135140GluProArgAspGluGluAlaAlaGluThrArgSerProGlyGluGlu145150155160GlnAlaHisIleHisLeuTrpArgGlyGluSerGluSerAlaProVal165170175AspLeuAsnGlnLeuThrAlaThrGlnGluGlyThrTrpThrGlyAsp180185190ArgProGlnAlaProPheSerLysProValProIleGlyGly19520020513229PRTPaenibacillusfonticola13MetLeuLeuValTyrGlyProTyrLeuProValArgIleLeuGluGlu151015IleArgPheTrpLysGlnGlnGluAlaGluHisThrAspValIleLys202530AlaIleValProGlyLeuGluProTyrTyrValGlnLeuLeuAsnAsp354045TrpLysArgValPheGluGluThrThrLeuAlaAlaAsnGlnLeu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权利要求：1.一组可提高包含特殊N端金属离子结合结构域的SOD氨基酸序列，其特征在于它是来源于属Paenibacillus的13个特殊FeMn-SOD的氨基酸序列，如SEQIDNO:1-13所示。2.一组可提高包含特殊N端金属离子结合结构域的SOD氨基酸序列在用于金属离子匮乏的情况下维持SOD较好的活性和稳定性方面的应用。3.权利要求1所述的一组可提高SOD活性和稳定性的N端氨基酸序列，其特征在于：（1）这组N端氨基酸序列相互之间具有75-100%的同源性；（2）这组N端氨基酸序列都包含特殊的金属离子结合结构域。4.权利要求3所述的一组可提高SOD活性和稳定性的N端氨基酸序列，其中所述N端多肽序列具有与SEQIDNO:1-13所示的氨基酸序列至少70%的同源性；SEQIDNO:1-13所示的氨基酸序列中缺失、替换或插入一个或多个氨基酸后的氨基酸序列，并且具有该序列的蛋白质有对所有Paenibacillus属的FeMn-SOD的活性和稳定性具有决定性作用，此外，利用此N端序列改造枯草芽孢杆菌B.subtilisBSn5的Mn-SOD后，其活性和稳定性均得到较好的提升。5.根据权利要求1至3中任一项所述的一组可提高SOD活性和稳定性的氨基酸序列，其特征在于，这组N端氨基酸序列可广泛应用于其它SOD，通过一定方法，将这段N端氨基酸序列添加到其它SOD的N端。6.根据权利要求1至3中任一项所述的一组可提高SOD稳定性和活性的氨基酸序列，其特征在于将编码N端氨基酸序列的核苷酸与编码其它SOD或sodA功能域的核苷酸连接后经过克隆表达重组SOD，可显著提高SOD的稳定性和活性。7.权利要求1所述的SEQIDNO:1-13氨基酸序列在提高SOD的活性、稳定性方面的应用。

百度查询： 南开大学 一组可提高SOD活性和稳定性的氨基酸序列及其应用

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