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申请/专利权人:广州栋方生物科技股份有限公司
摘要:本发明涉及一种重组人源胶原蛋白的制备方法及其产品与应用。所述重组人源胶原蛋白的制备方法包括培养菌体、诱导表达重组人源胶原蛋白、离心收集菌体、破碎菌体、离心收集上清液、过镍琼脂糖凝胶柱层析、过葡聚糖凝胶柱层析、洗脱等步骤,工艺简单,制备得到的重组人源胶原蛋白纯度高、稳定性好,活性保持时间长,能够显著地促进细胞增殖及迁移,在护肤类产品领域具有重要的应用价值。
主权项:1.一种重组人源胶原蛋白的制备方法,其特征在于,所述重组人源胶原蛋白的制备方法包括如下步骤:(1)培养菌体,诱导表达重组人源胶原蛋白,得发酵液;(2)离心收集菌体、破碎菌体、离心收集上清液;(3)步骤(2)所得上清液过镍琼脂糖凝胶柱层析、洗脱,得洗脱液;(4)步骤(3)所得洗脱液过葡聚糖凝胶柱层析、洗脱,得所述重组人源胶原蛋白;步骤(1)所述培养菌体中使用的培养基包括浓度为20-30gL的蛋白胨、浓度为20-30gL的酵母提取物、浓度为1-3gL的葡萄糖、浓度为0.8-1.2gL的消泡剂、浓度为4-6gL的氯化钠、浓度为0.8-1.2gL的硫酸镁、浓度为0.4-0.6gL的硫酸铵、浓度为0.015-0.025gL的氯化钙、浓度为8-12mmolL的磷酸盐和水;步骤(1)所述诱导是指当菌体长至对数生长中期时进行,使用的诱导剂包括IPTG,IPTG在培养基中的终浓度为0.3-0.5mmolL;所述诱导的温度为33-35℃,所述诱导的时间为3-5h;步骤(1)所述菌体为大肠杆菌工程菌;步骤(1)所述培养的温度为36-38℃;步骤(3)所述过镍琼脂糖凝胶柱层析前还包括用A液平衡镍琼脂糖凝胶柱,所述A液包括浓度为15-25mM的磷酸缓冲液、浓度为0.15-0.25M的氯化钠和质量浓度为0.03-0.07%的吐温80,所述A液的pH范围为6.0-7.5;所述平衡镍琼脂糖凝胶柱是指平衡5-10个柱体积;步骤(3)所述洗脱前还包括用B液洗杂蛋白,所述B液包括浓度为15-25mM的磷酸缓冲液、浓度为0.15-0.25M的氯化钠、质量浓度为0.03-0.07%的吐温80和浓度为40-100mM的咪唑,所述B液的pH范围为6.0-7.5;所述洗杂蛋白是指洗5-10个柱体积;步骤(3)所述洗脱是指用C液洗脱,所述C液包括浓度为15-25mM的磷酸缓冲液、浓度为0.15-0.25M的氯化钠、质量浓度为0.03-0.07%的吐温80和浓度为300-480mM的咪唑,所述C液的pH范围为6.0-7.5;所述洗脱是指洗5-7个柱体积;步骤(4)所述过葡聚糖凝胶柱层析前还包括用A’液平衡葡聚糖凝胶柱;所述A’液包括浓度为15-25mM的磷酸缓冲液、浓度为0.15-0.25M的氯化钠和质量浓度为0.03-0.07%的吐温80,所述A’液的pH范围为6.0-7.5;步骤(4)所述洗脱是指用A’液洗脱一个柱体积;所述重组人源胶原蛋白可用于制备重组人源胶原蛋白保存液,所述重组人源胶原蛋白保存液由牛血清白蛋白、EDTA-2Na和所述的重组人源胶原蛋白的制备方法制备的重组人源胶原蛋白组成;所述牛血清白蛋白在重组人源胶原蛋白保存液中的质量百分含量为0.03-0.07%;所述EDTA-2Na在重组人源胶原蛋白保存液中的浓度为1.5-2.5mM。
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