申请/专利权人：郑州轻工业大学

申请日：2022-03-24

公开（公告）日：2024-05-17

公开（公告）号：CN114525352B

主分类号：C12Q1/689

分类号：C12Q1/689;C12Q1/686;C12N15/11;G01N33/543;G01N33/52;G01N33/58;G01N33/68;C12R1/01;C12R1/42;C12R1/19;C12R1/445;C12R1/63;C12R1/385

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.05.17#授权;2022.06.10#实质审查的生效;2022.05.24#公开

摘要：本发明公开了一种多重PCR与胶体金试纸条联合高通量检测致病菌的方法：根据三种不同致病菌的特异性基因片段分别设计一对上、下游引物，且上游引物5'端修饰巯基，下游引物5'端分别修饰生物素、荧光素和地高辛；将三种致病菌样品用PBS洗涤并重悬于PBS中，煮沸8‑15min后冷却至室温，离心，分别取上清DNA并进行多重PCR扩增，获得PCR产物；PCR产物与胶体金结合，封闭后滴加至试纸条上，肉眼观察结果。本发明利用PCR扩增技术来提高检测食源性致病菌的灵敏度，具有高通量检测、灵敏度高、特异性强、耗时短等优点，适用于致病菌的检测。

主权项：1.一种非疾病诊断目的多重PCR与胶体金试纸条联合高通量检测致病菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：a）根据三种不同致病菌的特异性基因片段分别设计一对上、下游引物，且上游引物5'端修饰巯基，下游引物5'端分别修饰生物素、荧光素和地高辛；b）将三种致病菌样品用PBS洗涤并重悬于PBS中，煮沸8-15min后冷却至室温，离心，分别取上清DNA并利用步骤a）中的引物进行多重PCR扩增，获得PCR产物；PCR扩增程序为：先在95℃预变性5min，开始循环过程，首先95℃变性30s、53℃退火30s、72℃延伸30s，共进行32个循环；最后，在72℃下继续伸展10分钟即得PCR产物；c）PCR产物与胶体金结合，离心、弃上清，用含10%BSA的PBS封闭后滴加至试纸条上，肉眼观察结果；步骤a）中，所述致病菌为单核细胞增生李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7；单核细胞增生李斯特菌的扩增引物：上游引物LM-hlyF序列为5'-TGAATGCAATTTCGAGCCTA-3'，下游引物LM-hlyR序列为5'-CGCCGAAGTTTACATTCAAGC-3'；鼠伤寒沙门氏菌的扩增引物：上游引物ST-hutF序列为5'-ACTGGCGTTATCCCTTTCTCTGCTG-3'，下游引物ST-hutR序列为5'-ATGTTGTCCTGCCCCTGGTAAGAGA-3'；大肠杆菌O157:H7的扩增引物：上游引物EC-rfbEF序列为5'-AACGGTTGCTCTTCATTTAG-3'，下游引物EC-rfbER序列为5'-GAGACCATCCAATAAGTGTG-3'；步骤c）中，所述试纸条包括底板、以及依次粘接在底板上的样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述硝酸纤维素膜上有三条检测线，所述检测线上分别包被有抗生物素抗体、抗荧光素抗体、抗地高辛抗体。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 郑州轻工业大学 多重PCR与胶体金试纸条联合高通量检测致病菌的方法

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