申请/专利权人：拉伯塞特股份有限公司

申请日：2017-09-15

公开（公告）日：2024-05-17

公开（公告）号：CN109996881B

主分类号：C12N15/87

分类号：C12N15/87

优先权：["20160915 US 62/395,363","20161227 US 62/439,458"]

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.05.17#授权;2019.09.03#实质审查的生效;2019.07.09#公开

摘要：提供了一种使用声穿孔实现宿主细胞转染的方法。将声辐射发生器定位为相对于包含要被转染的宿主细胞的储存器、要被加入到宿主细胞中的外源物质和细胞相容性流体介质成声耦合关系。将声辐射发生器激活以产生声辐射，并以有效方式将声辐射导引入储存器中以使得能够用外源物质转染宿主细胞。

主权项：1.一种将外源物质转染至细胞的声学方法，所述方法包括：a提供系统，其包含：i以阵列布置的多个储存器reseroir，每个储存器含有宿主细胞和待引入所述宿主细胞中的所述外源物质，和ii产生和导引声辐射的声辐射发生器；b将声辐射发生器声耦合至第一个储存器，而不同时将声辐射发生器声耦合至任何其他储存器；c激活声辐射发生器以产生声辐射并以诱导宿主细胞的声穿孔的方式将声辐射导引入第一个储存器中，从而促进外源物质引入声穿孔的宿主细胞；d将声辐射发生器与第一个储存器声学地分离；e将声辐射发生器声耦合至第二个储存器，而不同时将声辐射发生器声耦合至任何其他储存器；f对于第二个储存器，重复步骤c；和g将声辐射发生器与第二个储存器声学地分离，并随后对于多个储存器中的其他储存器重复步骤b至f。

全文数据：使用声穿孔的生物细胞高效转染技术领域本发明大体上涉及生物技术，更具体而言涉及生物细胞的有效转染。本发明可用于生物化学和医药学，包括细胞研究和药物开发。背景技术转染是指外来物质进入宿主细胞，包括细菌细胞、哺乳动物细胞和其它细胞类型。在生物技术领域，转染已成为用于将外来DNA或RNA引入细胞以生产转基因细胞的非常重要的工具。转染可以是稳定的或瞬时性的。在稳定转染中，引入的遗传物质通过穿越细胞膜和核膜而被递送到宿主细胞核并整合到宿主基因组中；每个子细胞均具有加入的物质。相反，在瞬时转染也称为"转化"中，核酸被插入到宿主细胞中，但不会整合到其基因组中。结果，外来遗传物质暂时性表达但不会传到转染细胞的后代。因此，应理解稳定转染对大规模蛋白质生产、基因疗法、药物开发、化合物筛选以及深入研究来说是必要的。然而，稳定细胞系的开发是复杂、耗时耗力和昂贵的。存在多种将外来遗传物质引入真核宿主细胞的方法，包括生物、化学和物理介导的方法。研究中最常用的转染方法是生物法，涉及使用病毒作为载体。腺病毒、慢病毒和致癌逆转录病毒载体已被广泛用于哺乳动物细胞培养物和体内的基因递送。病毒介导的转染或病毒"转化"是有效和使用相对简单的，即使对难以转染的细胞类型也是如此。然而，也存在显著的缺点，包括选定病毒的免疫原性和细胞毒性以及生产病毒载体所涉及的困难性和时间。例如，慢病毒载体对于使用者来说也是有生物危害性的，需要二级生物安全BiosafetyLevel2，BSL-2，由美国疾病控制及预防中心确立或增强BSL-2BSL-2+工作条件。广泛使用化学转染方法，其是最初用于将外来基因引入哺乳动物宿主细胞的方法。常用的化学方法包括但不限于以下：与盐水磷酸缓冲溶液组合的磷酸钙；阳离子聚合物，诸如二乙醇胺和葡聚糖的缀合物或“DEAE-葡聚糖”或聚乙撑亚胺；阳离子脂质制剂，诸如商品名为的市售产品其它阳离子脂质制剂在相关文本和文献中描述，例如，Felgner等人1994J.Biol.Chem.2694:2550-61；和活化的树状聚合物，诸如聚酰胺-胺树状聚合物参见Hudde等人1999GeneTherapy65:939-943。化学转染效率取决于细胞类型、遗传物质化学转染剂比、溶液pH以及其它条件而变。尽管化学转染方法不涉及病毒转染剂的潜在免疫原性和细胞毒性，其通常显示转染效率差。此外，许多上述化学转染试剂仅可用于那些强健而不特别敏感的极少数细胞系，例如，HeLa或HEK-293细胞。物理转染方法相比于病毒或化学转染是较新的，包括诸如以下的技术：电穿孔、基于激光的转染、显微注射和基因枪biolisticparticledelivery、细胞挤压和直接微注射。尽管已确立了这些方法来实现转染，但仍存在许多相关问题，包括样品大面积物理损坏的可能性。为克服上述方法遇到的一些问题，已对使用“声穿孔”技术实现转染投入了一些努力。声穿孔涉及使用超声或声能诱导细胞膜通透性发生足以允许宿主细胞摄入大分子的瞬时变化，否则那些大分子将不能穿过细胞膜。时至今日该领域中已做的工作集中于使用超声造影剂UCA。大部分UCA是充有浮力气体buoyantgas的微泡，其涉及用于医学超声检测以通过反向散射提高声反射。已提出通过在宿主细胞附近经历空化而使UCA用于声穿孔中，使得UCA首先膨胀，但是随后快速收缩或塌陷，产生微流或冲击波，其对细胞膜施加剪切应力，使那些膜暂时或永久性地破裂。最近，有人提出，使用具有低于将引发空化者的声能的UCA可发生声穿孔。参见，例如，Forbes等人2008UltrasoundinMed.&Biol.3412:2009-2018。然而，出于多种原因，该方法尚未以较大规模实施，所述原因包括以下事实：在流体介质中，UCA将上升至液体表面，而宿主细胞将因重力下沉。这是有问题的，因为经由声穿孔转染需要在施加声能时浮力微泡和宿主细胞接近。另一个问题是效率：迄今为止，没有报告过其中成功转染的宿主细胞的数量最大化且细胞死亡最小化的基于声穿孔的转染方法。此外，像其他转染技术一样，迄今为止声穿孔对于难以转染的细胞例如，出生细胞，特别是干细胞的转染无效。理想的转染方法将做到以下这些：最大化被转染的宿主细胞分数，同时最小化细胞死亡；允许成功转染多种细胞类型，包括通常对转染有抗性的细胞；能够转染非哺乳动物细胞以及哺乳动物细胞；能够转染融合以及非融合细胞；允许用核酸转染细胞，诸如DNA、RNA、小干扰RNAsiRNARNAi、微小RNAmiRNA和DNA质粒；允许用其它类型的外源物质转染细胞，包括蛋白质和小分子；使用选择用于修饰靶细胞功能的核酸序列和相关蛋白质以及用于执行基因表达的机构进行，包括a由Cas9蛋白和向导RNA组成的核糖核蛋白RNP和b具有相关启动子的CRISPR质粒；涉及简单实施而不需要过多时间或人力；和由于实施速度和容易性，适合用于高通量转染中。发明内容因此，本发明解决了上面讨论的本领域中的需要并提供了一种用于转染宿主细胞的基于声穿孔的方法。在一个实施方式中，本发明提供了一种转染细胞的声学方法，所述方法包括：a提供包括以下的系统：i至少两个储存器，各自包含宿主细胞和待引入到宿主细胞中的外源物质，和ii产生和导引声辐射的声辐射发生器；b将声辐射发生器声耦合至第一个储存器，同时不将声辐射发生器声耦合至任何其他储存器；c以诱导宿主细胞的声穿孔的方式激活声辐射发生器以产生声辐射并将其导引至第一个储存器内，从而促进将外源物质引入到声穿孔的宿主细胞中；d将声辐射发生器与第一个储存器声学地分离；e将声辐射发生器声耦合至第二个储存器，同时不将声辐射发生器声耦合至任何其他储存器；和f对第二个储存器重复步骤c。在该实施方式的一个方面，所述至少两个储存器被包含在多个储存器中，所述方法进一步包括g将声辐射发生器与第二个储存器声学地分离，随后对其它储存器重复步骤b至g。储存器可被包含在集成式多储存器单元中，诸如微孔板，诸如96-孔板，384-孔板，1536-孔板等。在该实施方式的一个方面，被导引入储存器中的声辐射是聚焦声辐射。在该实施方式的另一方面，所述方法在高通量转染系统背景下实施，其中多个多储存器中每个中的宿主细胞被连续地快速声穿孔。这可意味着储存器至储存器转换时间为至多约0.5秒、0.1秒或0.001秒。在相关方面，每个储存器中流体介质的体积可在约0.5μL至约500μL范围内。在该实施方式的另一方面，诱导声穿孔的方式包括将产生的声辐射传递到宿主细胞的手段means，其通常为包含在流体介质中的多个声学可激活的部分诸如，声学可激活的局部流体体积的转染激发物质。局部流体体积localizedfluidvolume可以为充气微泡，其可被缀合至宿主细胞以促进声能从被辐射的微泡传递到宿主细胞。在另一个实施方式中，提供了一种用于转染宿主细胞的方法，包括：a通过将多个用第一结合部分进行表面功能化的充气微泡悬浮在于宿主细胞相容的流体介质中制备微泡组合物；b通过将微泡与对宿主细胞类型具有特异性并且用连接到第一结合部分的第二结合部分功能化的抗体在流体介质中混合将微泡缀合至该抗体，从而产生微泡-抗体缀合物；c通过将微泡-抗体缀合物与要被转染到宿主细胞中的外源物质混合制备加载的微泡-抗体缀合物；d任选地用与宿主细胞相容的流体介质稀释加载的微泡-抗体缀合物，这提供了具有有效优化转染效率的加载的微泡-抗体缀合物浓度的稀释液；e将储存器中的宿主细胞接触稀释液；和f通过如下方式将e中提供的宿主细胞-稀释液混合物声穿孔：用声辐射在导致微泡以其平均共振频率的约15％内或其平均共振频率谐波的约15％内的频率共振的条件下辐射储存器。在另一个实施方式中，本发明提供了一种转染细胞的声学方法，包括：将声辐射发生器声耦合至包含宿主细胞、要被转染到宿主细胞中的外源物质和流体介质的储存器；和以诱导宿主细胞的声穿孔的方式激活声辐射发生器以产生声辐射并将声辐射导引入储存器中，而不会导致流体介质中的温度升高多于约10℃。在另一个实施方式中，本发明提供了一种转染细胞的声学方法，包括：将声辐射发生器声耦合至被包含在包括至少1536个储存器的集成式多储存器单元中的选定储存器，所述选定储存器包含宿主细胞、要被转染到宿主细胞中的外源物质和流体介质；和以诱导宿主细胞的声穿孔的方式激活声辐射发生器以产生声辐射并将声辐射导引入储存器中，从而促进外源物质进入声穿孔的宿主细胞中。在另一个实施方式中，本发明提供了一种转染细胞的声学方法，包括：将声辐射发生器声耦合至储存器，所述储存器包含宿主细胞、待转染到宿主细胞中的外源物质、流体介质和由多个声学可激活的局部流体体积构成的转染激发物质；和以声激活局部流体体积的方式激活声辐射发生器以产生声辐射并将声辐射导引入储存器中，由此使其以局部流体体积平均共振频率的约15％内或局部流体体积平均共振频率谐波的约15％内的频率振动，从而促进声激活的局部流体体积附近的外源物质进入宿主细胞。在另一个实施方式中，本发明提供了一种转染细胞的声学方法，包括：将声辐射发生器声耦合至储存器，所述储存器包含宿主细胞、待转染到宿主细胞中的外源物质、流体介质和由多个具有一定尺寸分布的声学可激活的局部流体体积构成的转染激发物质；和以声激活局部流体体积的方式激活声辐射发生器以产生声辐射并将声辐射导引入尺寸为选定尺寸±15％的储存器中，从而促进声激活的局部流体体积附近的外源物质进入宿主细胞。在相关实施方式中，本发明提供了一种转染细胞的声学方法，包括：a将声辐射发生器声耦合至储存器，所述储存器包含宿主细胞、待转染到宿主细胞中的外源物质、流体介质和由具有多模态尺寸分布的多个声学可激活的局部流体体积构成的转染激发物质；b以声激活局部流体体积的方式激活声辐射发生器以产生声辐射并将声辐射导引入尺寸为第一模态峰值的约15％内的储存器中，由此使得声激活的局部流体体积传递声能到附近的宿主细胞；c重复步骤b以声激活尺寸为第二模态峰值的约15％内的局部流体体积；和d任选地重复步骤b以声激活尺寸为一个或多个其它模态峰值的约15％内的局部流体体积。在另一个实施方式中，本发明提供了一种转染细胞的声学方法，包括：将声辐射发生器声耦合至储存器，所述储存器包含宿主细胞、待转染到宿主细胞中的外源物质、流体介质和由多个具有一定尺寸分布的声学可激活的局部流体体积构成的转染激发物质；和以诱导宿主细胞的声穿孔的方式激活声辐射发生器以产生具有选定频率含量的声辐射并将产生的声辐射导引入储存器中，其中选择产生的声辐射的频率含量选择为相关于声学可激活的局部流体体积的尺寸分布.在相关实施方式中，本发明提供了一种转染细胞的声学方法，包括：将声辐射发生器声耦合至储存器，所述储存器包含宿主细胞、待转染到宿主细胞中的外源物质、流体介质和由具有在储存器中的空间分布的多个声学可激活的局部流体体积构成的转染激发物质；和以诱导宿主细胞的声穿孔的方式激活声辐射发生器以产生具有选定频率含量的声辐射并将产生的声辐射导引入储存器中，从而促进外源物质进入声穿孔的宿主细胞中，其中选择产生的声辐射的频率含量以使其关联于声学可激活的局部流体体积的空间分布。在另一个实施方式中，使用协同优选但不必须同时但以不同频率操作的两个转换器来进行声穿孔，其中一个转换器是环形转换器被可操作地安装在标准转换器周围并密封该标准转换器。在该实施方式中，环形转换器和标准转换器通常以不同频率操作。在该实施方式的一个方面，环形转换器可以选择为在引起声穿孔的频率下操作，而标准转换器可以在有效导致声穿孔细胞的声喷射的频率下操作，例如，声喷射到储存器中、到基板上或到分析用分析仪器。在该实施方式的另一方面，两个转换器之一主要用于供应用于声穿孔的声能，另一个转换器传递声能以改变在不使用微泡-细胞缀合时微泡对于宿主细胞的相对位置。在另一个实施方式中，通过以下方式进行声穿孔：用连续的多个声短纯音辐射，每个声短纯音均具有有效地将不同尺寸的微泡声穿孔的不同声频。多个声短纯音中每个的声频通常在约1.5MHz至约5.0MHz范围内，更通常在约2.0MHz至约2.5MHz范围内。在进一步的实施方式中，提供了一种转染细胞的声学方法，其包括：将声辐射发生器声耦合至选定储存器，所述储存器包含宿主细胞、待转染到宿主细胞中的外源物质、流体介质和包括多个声学可激活的局部流体体积的转染激发物质；和以声激活局部流体体积的方式激活声辐射发生器以产生声辐射并将声辐射导引入储存器中，从而促进声激活的局部流体体积附近的外源物质进入宿主细胞，其中产生的声辐射处于选择为确保在辐射后至少50％的局部流体体积保持完整的声穿孔压力。在该实施方式的一个方面，声穿孔处于将导致局部流体体积空化的最小声压的约50％至约90％范围内。附图说明图1提供了实施例4中所述的FACS分析中正向散射高度与侧向散射高度之间的关系图。图2也源自实施例4中所述的FACS分析，其表明在FL1通道中检测到成功转染，同时在FL3通道中检测到死细胞。图3也源自实施例4中所述的FACS分析，其独立地说明了对于阳性对照物获得的结果。图4提供了逐个孔的结果well-by-wellresults，说明了实施例4中转染细胞的比例随声功率和微泡浓度二者的增加而增加。图5提供了图表形式的结果。图6逐个孔地显示了实施例14中声穿孔之后保留的活细胞的百分比接近100％，甚至在所用的较高电压1.5V下也是如此。图7说明了实施例4中对于转染细胞和阴性对照物即，仅有DPBS，不存在微泡获得的结果。图8显示了实施例5中所述的CRISPR转染实验中对于四种质粒浓度中的每种获得的GFP-阳性细胞的百分比。图9显示了在四种质粒浓度中的每种下的GFP-阳性细胞的平均百分比，并显示了标准误差线。图10显示了实施例5中所述的对于四种质粒浓度中每种的死细胞百分比。图11说明了实施例6第1次运行的CRISPR转染实验的错配切割实验和分析的结果。图12说明了实施例6第2次运行的CRISPR转染实验的错配切割实验和分析的结果。图13是表明实施例6第1次和第2次运行所得的切割百分比结果的柱形图。图14提供了在实施例6第2次运行中转染宿主细胞所得的荧光图像，使用具有RFP发光立方体的EVOS荧光显微镜检测标记的tracrRNA。具体实施方式除非另外定义，本文中所用的所有技术和科学术语均具有本发明所述领域一般技术人员普遍理解的含义。下文中定义了对于本发明说明书具有特别重要性的特定术语。在本说明书和所附权利要求中，单数形式“一一个一种aan”和“所述该the”包括复数指代物，除非上下文中另有明确规定。因此，例如，"一个一种组分"不仅是指单一组分，而且指两个种或更多个种组分的组合，以及类似情况。术语"声辐射"和"声能"在本文中可互换使用，并且指代声波形式的能量的发射和传播。如下文中所讨论地，与其他波形一样，可使用聚焦装置来聚焦声辐射。术语"聚焦装置"和"声聚焦装置"是指通过以下方式使声波汇聚在焦点处的装置：通过独立于声能来源的作用类似透镜的器件，或者通过声能来源的空间布置，经由相长干涉和相消干涉实现声能在焦点处的汇聚。聚焦装置可简单地为具有弯曲表面的实体构件，或者其可包括诸如在菲涅耳透镜Fresnellenses中可见的那些复杂结构其采用衍射来引导声辐射。合适的聚焦装置还包括相控阵法，如本领域中已知和在以下文献中描述的：例如，Nakayasu等人的美国专利第5,798,779号，以及和Amemiya等人1997Proceedingsofthe1997IS&TNIP13InternationalConferenceonDigitalPrintingTechnologies,pp.698-702。本文所用的术语"声耦合"和"声耦合的"是指如下状态：其中将物体放置为与另一个物体直接或间接接触以允许声辐射在两个物体之间传递而没有显著的声能损失。当两个物品间接声耦合时，需要"声耦合介质"以提供可通过其传输声辐射的媒介物。因此，可通过以下方式将发射器声耦合至储存器中的流体：例如，在发射器与流体之间插入声耦合介质以将发射器产生的声辐射通过声耦合介质传递至流体中。"声学可激活"的部分是当用特定波长的声能辐射时能引起其以超声频率振动的部分。本文所用的术语"储存器"是指用于保持或包含流体的容器或室。在其最简单的形式之一中，储存器由如下的固体表面组成，该固体表面具有足够的湿润性质以使得仅因流体与表面之间的接触即可保持流体。储存器还可为孔板中的孔、试管或试管架中的其他这种容器等。本文所用的术语"阵列"是指特征的二维排列，诸如储存器例如，孔板中的孔的排列。阵列通常包括有规律地排列的特征，例如，直线网格、平行条纹、螺旋线等，但也可有利地使用不规则阵列。阵列与图形的区别在于，图形不必包含规则有序的特征。阵列通常，但非必要地，包括至少约4个至约10,000,000个特征，通常在约4个至约1,000,000个特征范围内。本文所用的术语"流体"，如在“流体介质"中，是指非固体和至少部分由液体组成的物质。流体可包含最低限度、部分或完全溶剂化、分散或悬浮的固体。流体的实例包括但不限于水性液体包括水本身和盐水和非水液体诸如有机溶剂等。流体还可为包含细胞、生物分子等的生物流体。术语"核酸"是指核苷、核苷酸或多核苷酸，包括寡核苷酸，无论其是自然产生的还是在实验室中合成的，因此涵盖诸如质粒的非天然构建体。除非另有明确说明或者上下文有不同解释，这些术语在本文中可互换使用。核酸包括包含2-脱氧-D-核糖以及D-核糖的那些，因此分别包含多脱氧核糖核苷酸和多核糖核苷酸，并且可包含任何常规的嘌呤和嘧啶碱基，即，腺嘌呤A、胸腺嘧啶T、胞嘧啶C、鸟嘌呤G和尿嘧啶U以及它们的受保护形式例如，其中碱基用以下保护基保护：诸如乙酰基、二氟乙酰基、三氟乙酰基，异丁酰基或苯甲酰基，以及本领域技术人员已知和在相关文本和文献中描述的嘌呤和嘧啶类似物。常见的类似物包括，但不限于，1-甲基腺嘌呤、2-甲基腺嘌呤、N6-甲基腺嘌呤、N6-异戊基-腺嘌呤、2-甲硫基-N6-异戊基腺嘌呤、N,N-二甲基腺嘌呤、8-溴腺嘌呤、2-硫胞嘧啶、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-乙基胞嘧啶、4-乙酰基胞嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、2,2-二甲基鸟嘌呤、8-溴鸟嘌呤、8-氯鸟嘌呤、8-氨基鸟嘌呤、8-甲基鸟嘌呤、8-硫鸟嘌呤、5-氟-尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、5-乙基尿嘧啶、5-丙基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、5-羟甲基尿嘧啶、5-羧基羟甲基尿嘧啶、5-甲基-氨基甲基尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-尿嘧啶、2-硫脲嘧啶、5-甲基-2-硫脲嘧啶、5-2-溴乙烯基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、假尿嘧啶、1-甲基假尿嘧啶、queosine、肌苷、1-甲基肌苷、次黄嘌呤、黄嘌呤、2-氨基嘌呤、6-羟基氨基嘌呤、6-硫嘌呤和2,6-二氨基嘌呤。本文的核酸还可具有其他类型的修饰，包括但不限于：糖部分上的修饰，例如，其中一个或多个羟基被路原子或脂族基团替换或被官能化为醚、胺等；非天然核苷酸间键，诸如甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基膦酸酯、氨基甲酸酯、硫代磷酸酯、氨基烷基氨基磷酸酯和氨基烷基磷酸三酯；用侧链部分进行官能化；加入嵌入剂例如，吖啶、补骨脂素等；加入螯合剂例如，金属、放射性金属、硼、氧化性金属；等等。术语"多肽"意图包括由两个或更多个氨基酸组成的任何结构，因此包括二肽、寡肽和蛋白质，除非文本或上下文另有说明，这些术语在本文中可互换使用。形成肽的全部或一部分的氨基酸可以为以下中的任何种类：20种天然常规氨基酸，即，丙氨酸A、半胱氨酸C、天冬氨酸D、谷氨酸E、苯丙氨酸F、甘氨酸G、组氨酸H、异亮氨酸I、赖氨酸K、亮氨酸L、蛋氨酸M、天冬酰胺N、脯氨酸P、谷氨酰胺Q、精氨酸R、丝氨酸S、苏氨酸T、缬氨酸V、色氨酸W和酪氨酸Y；非常规氨基酸，诸如常规氨基酸的异构体和修饰，例如，D-氨基酸、非-蛋白质氨基酸、翻译后修饰的氨基酸、酶修饰的氨基酸、β-氨基酸、设计为模拟氨基酸的构建体或结构例如，α,α-二取代氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸、β-丙氨酸、萘丙氨酸、3-吡啶丙氨酸、4-羟基脯氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰蛋氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸和正亮氨酸；以及如例如Rosenberg等人的美国专利第5,679,782号中所述的其它非常规氨基酸。肽还可包含非肽骨架键nonpeptidicbackbonelinkages，其中天然酰胺-CONH-键在肽骨架内的一个或多个位点处被替换为非常规键，诸如N-取代的酰胺键、酯键、硫代酰胺键、反向肽retropeptide，-NHCO-、反向硫代酰胺-NHCS-、磺酰胺-SO2NH-和或类肽N-取代甘氨酸键。因此，肽可包括伪肽和模拟肽。肽可以是：a天然的，b通过化学合成制成，c通过重组DNA技术制成，d通过较大分子的生物化学或酶促分裂制成，e通过上述方法a至d的组合方法制成，或f通过制备肽的任何其他方式。术语"基本"，例如，在短语"基本相同的储存器"中，是指在声学特性上基本没有实质性偏差的储存器。例如，“基本相同的储存器”的声衰减彼此相差不多于10％，优选不多于5％，更优选不多于1％，最优选至多0.1％。术语“基本”的其他用途涉及类似定义。本发明提供了一种使用声辐射以能够转染多种细胞类型包括非哺乳动物细胞和哺乳动物细胞、融合细胞和非融合细胞的方式转染细胞的方法。如本文所述地使用声穿孔，该方法能够将外源物质加入宿主细胞，包括但不限于，质粒、核糖核蛋白和其它物种。如下文中将要详细描述的，该方法适合用于高通量转染，这在很大程度上升是因为该方法可用大量包含细胞的储存器连续进行。在一个实施方式中，转染细胞的方法包括：a提供包括i各自包含宿主细胞和要经由声穿孔诱导的转染而被引入到宿主细胞中的外源物质的至少两个储存器和ii产生和导引声辐射的声辐射发生器的系统；b将声辐射发生器声耦合至第一个储存器同时不将声辐射发生器声耦合至任何其他储存器；c以诱导宿主细胞的声穿孔的方式激活声辐射发生器以产生声辐射并将其导引至第一个储存器内，从而促进将外源物质引入到声穿孔的宿主细胞中；d将声辐射发生器与第一个储存器声学地分离；e将声辐射发生器声耦合至第二个储存器同时不将声辐射发生器声耦合至任何其他储存器；和f对第二个储存器重复步骤c。通常，尽管非必要地，第一个和第二个储存器被包含在多个储存器中，并且对一些或全部储存器重复上述方法。在这种情况中，所述方法在f之后包括额外步骤，即，g将声辐射发生器与第二个储存器声学地分离，和对于其他储存器重复步骤b至g。为提供组件的模块性和可互换性，有时可优选器件与多个可移除储存器协同使用，例如，试管架中的试管等。储存器被排列为图形或阵列，通常为阵列，以便为每个储存器提供单独的系统可寻址性。尽管每个储存器可作为分立或单独的容器提供，在需要大量储存器的情况中，例如，在高通量转染方法中，优选储存器被包含在集成式多储存器单元中。多储存器单元可为孔板，其中各个孔用作储存器。适用于所述器件的许多孔板是市售的，并且每个孔板可包含例如96个、384个、1536个或3456个孔，并且具有全裙边、半裙边或无裙边。孔板或微量滴定板已广泛用于实验室项目。实验室自动化与筛选学会theSocietyforLaboratoryAutomationandScreening，SLAS已与美国国家标准协会联合建立和保持了微量滴定板的标准，包括封装尺寸标准thefootprintanddimensionstandardsANSISLAS1-2004。这种孔板的孔通常为直线阵列形式。这样的市售孔板的可用性不排除生产和使用包含至少约10,000个孔或者多达100,000至500,000个孔或更多的其他几何结构的定制孔板。此外，用于构建储存器的材料必须是可相容并且与其中所含的流体样品相容的。对于水基流体，有多种材料适合用于构建储存器，包括，但不限于，陶瓷，诸如氧化硅和氧化铝，金属，诸如不锈钢和铂，以及聚合物，诸如聚酯、聚丙烯、环烯烃共聚物例如，可得自NipponZeon的名为的那些市售产品可得自Ticona的名为的那些市售产品、聚苯乙烯和聚四氟乙烯。此外，为减少在多个储存器中的每一个中快速连续转染宿主细胞所需的运动量和时间，优选每个储存器中心位于距相邻储存器中心不多于约1厘米，例如，不多于约1.5厘米，不多于约1毫米，以及不多于约0.5毫米。这些尺寸旨在将储存器的尺寸限制到最大体积。储存器被构建为通常包含不多于约1mL，优选不多于约500μL，更优选不多于约250μL流体，在某些情况中不多于100μL、50μL、25μL、10μL、5μL、1μL或0.5μL流体。因此，在操作过程中，储存器中流体介质的体积在约0.5μL至约500μL范围内。为有利于一致性，还优选储存器是在声学上不可区分的。包括超声转换器的声辐射发生器用于产生声辐射和将产生的声辐射导引入包含要被转染的宿主细胞的储存器中。超声转换器通常包括激发器和集中激发器所产生的声能的聚焦元件；激发器的实例包括压电和磁致伸缩magnetorestrictive元件，在本文中通常，尽管非必要地，优选压电转换器。在操作中，激发器由超声驱动频率的信号驱动，并且在有源物理元件中产生超声振动。这些振动被传输进入和通过声耦合介质并进入容纳流体样品的储存器中。可使用单一转换器，或者在某些情况中，可使用包括转换器组件的多元件声辐射发生器。例如，可有利地使用直线声学阵列、曲线声学阵列或相控声学阵列来产生同时传输到多个储存器的声辐射。在优选实施方式中，采用单一声辐射发生器。可有利地用于本文中的声辐射发生器的实例为可被加入到可得自LabcyteInc.SanJose,CA的声液滴喷射acousticdropletejection,ADE系统中的那些，该系统在例如以下中描述：Stearns等人的美国专利6,416,164；Ellson等人的6,666,541；Ellson等人的6,603,118；Ellson等人的6,746,104；Ellson等人的6,802,593；Ellson等人的6,938,987；Mutz等人的7,270,986；Ellson等人的7,405,395；和Mutz等人的7,439,048。得自Labcyte的市售ADE系统包括500-系列液体处理器系统，包括525、550和555液体处理器。如上文中所解释的，本文的声辐射发生器优选包括聚焦元件。本领域已知的包括弯曲表面或菲涅耳透镜的多种聚焦装置中的任一种可用于本发明。这样的聚焦装置在Lovelady等的美国专利4,308,547和Quate等人的美国专利5,041,849以及美国专利申请公开2002037579中描述。当在多个储存器中如在孔板或其它类型的阵列中的每一个中转染宿主细胞时，使用用于以声耦合关系定位每个储存器与声辐射发生器的装置来实施该方法，这样在每个声穿孔事件之后，声辐射发生器与要被辐射的下一个储存器对齐。可向转让系统中加入定位装置以相对于声发射器移动包含储存器的基板例如，其可被定位在可移动台上，反之亦然。因此容易促进储存器的快速连续辐射。无论定位装置是哪一种类型，即，发射器定位装置或储存器或储存器基板定位装置，都可由例如发动机、杠杆、滑轮、齿轮其组合或者其他电机或机械装置构建。储存器至储存器转换时间优选为至多约0.5秒，优选至多约0.1秒，最好为至多约0.001秒。应注意声辐射发生器必须相对于要被辐射的储存器为声耦合关系，因此也与储存器内容物成声耦合关系，当连续辐射多个储存器时，声辐射发生器在声穿孔之后与每个被辐射的储存器解耦，随后与下一个储存器声耦合以进行下一个声穿孔事件。因此，该方法涉及将声辐射发生器声耦合至要被辐射的第一个储存器，辐射第一个储存器，随后将声辐射发生器与第一个储存器声学地分离，随后将声辐射发生器声耦合至下一个储存器，辐射下一个储存器等，并且重复该过程知道已辐射了所需数量的储存器。尽管可以通过与储存器的直接接触实现声耦合，优选的方式是将声辐射发生器声耦合至储存器，因此声耦合至其内容物，但不允许声辐射发生器的任何其他部分例如，驱动手段forcingmeans接触储存器的内容物。声辐射发生器可与每个储存器的外表面直接或间接接触。对于直接接触，为声辐射发生器声耦合至储存器，优选直接接触完全适形以确保有效的声能传递。即，声辐射发生器与储存器应当具有适于配合接触的对应表面。因此，如果通过使用驱动手段在声辐射发生器与储存器之间实现声耦合，则对于储存器而言理想的是具有对应于驱动手段表面轮廓的外表面。如果不是适形接触，则声能传递的效率和准确性可能会受到损害。此外，由于许多聚焦装置具有弯曲表面，直接接触方式可能必须使用具有特别成形的相反表面的储存器。最佳地，通过间接接触实现声辐射发生器与每个储存器之间的声耦合，如在以下中所述的：在上文中引用的Stearns等人的美国专利6,416,164；Ellson等人的6,666,541；Ellson等人的6,603,118；Ellson等人的6,746,104；Ellson等人的6,802,593；Ellson等人的6,938,987；Mutz等人的7,270,986；Ellson等人的7,405,395；和Mutz等人的7,439,048。通常，将声耦合介质放置在声辐射发生器和要被辐射的储存器的底座之间。声耦合介质可为声耦合流体，优选与声辐射发生器的上表面适形接触的声均匀材料，例如，与位于声辐射发生器上表面上和储存器下侧的声聚焦装置适形接触。此外，重要的是确保声耦合流体基本不含具有与要被辐射的储存器中的流体介质不同的声学性质的材料。在使用中，将第一个储存器声耦合至声辐射发生器，使得通过例如驱动手段将声辐射发生器所产生的声辐射导引到声耦合介质中，后者将声辐射传输至储存器中。系统可包含单一声发射器，或者，如前文所述，其可包含多发射器。单发射器设计通常优于多发射器设计，这是因为用单发射器更容易实现液滴放置的准确性以及液滴尺寸和速度的一致性。然而，本发明不限于单发射器设计。如本文中先前所解释的，包含要经由声穿孔转染的宿主细胞的储存器含有宿主细胞以及要被引入到宿主细胞中的外源物质。宿主细胞和外源物质有利地被包含在流体介质中，即，宿主细胞相容性流体介质，诸如缓冲液，例如，等渗缓冲液，诸如杜氏磷酸缓冲液DPBS。“相容性”流体介质意指细胞可在其中存活至少5分钟的流体介质。宿主细胞和宿主细胞类型：细胞应当在具有所有必要因子的合适培养基中生长，培养基必须不含污染。储存器内所含的流体介质中的细胞密度应当被优化，因为密度过低会因缺少细胞与细胞的接触而导致生长差，密度过高会导致接触抑制，使得细胞对核酸或其它大分子的摄入有抗性。宿主细胞通常来源于从受试者获取的细胞，诸如细胞系。可使用本发明的方法转染许多类型的哺乳动物细胞，不仅包括通常使用的那些哺乳动物细胞系，在某些情况中还包括通过目前已知的方法极难转染的细胞。通常使用的哺乳动物细胞系包括，例如，人细胞系HeLa、HepG2、HUVEC、MCF7、H1人胚胎、GM12878、K562和JurkatE6.1；小鼠细胞系NIH-3T3和MEF小鼠胚胎成纤维细胞；和其它细胞系诸如中国仓鼠卵巢CHO细胞和非洲绿猴肾COS-7细胞。通常极难转染但可使用本发明方法有效转染的细胞包括，例如：淋巴细胞，包括B-细胞和T-细胞二者；所有来源的初生细胞；神经元；所有类型的干细胞；以及卵母细胞。后面这组中的具体细胞系包括人淋巴母细胞系GM12878和JurkatE6.1，以及H1人胚胎细胞。能使用本发明方法转染的细胞系的具体实例包括但不限于C8161、CCRF-CEM、MOLT、mIMCD-3、NHDF、HeLa-S3、Huh1、Huh4、Huh7、HUVEC、HASMC、HEKn、HEKa、MiaPaCell、Panc1、PC-3、TF1、CTLL-2、C1R、Rat6、CV1、RPTE、A10、T24、J82、A375、ARH-77、Calu1、SW480、SW620、SKOV3、SK-UT、CaCo2、P388D1、SEM-K2、WEHI-231、HB56、TIB55、Jurkat、J45.01、LRMB、Bcl-1、BC-3、IC21、DLD2、Raw264.7、NRK、NRK-52E、MRC5、MEF、HepG2、HeLaB、HeLaT4、COS、COS-1、COS-6、COS-M6A、BS-C-1猴肾上皮细胞、BALB3T3小鼠胚胎成纤维细胞、3T3Swiss、3T3-L1、132-d5人胚成纤维细胞；10.1小鼠成纤维细胞、293-T、3T3、721、9L、A2780、A2780ADR、A2780cis、A172、A20、A253、A431、A-549、ALC、B16、B35、BCP-1细胞、BEAS-2B、bEnd.3、BHK-21、BR293.BxPC3.C3H-10T12、C636、Cal-27、CHO、CHO-7、CHO-IR、CHO-K1、CHO-K2、CHO-T、CHODhfr--、COR-L23、COR-L23CPR、COR-L235010、COR-L23R23、COS-7、COV-434、CMLT1、CMT、CT26、D17、DH82、DU145、DuCaP、EL4、EM2、EM3、EMT6AR1、EMT6AR10.0、FM3、H1299、H69、HB54、HB55、HCA2、HEK-293、HeLa、Hepa1c1c7、HL-60、HMEC、HT-29、Jurkat、JY细胞、K562细胞、Ku812、KCL22、KG1、KYO1、LNCap、Ma-Mel1-48、MC-38、MCF-7、MCF-10A、MDA-MB-231、MDA-MB-468、MDA-MB-435、MDCKII、MDCK11、MOR0.2R、MONO-MAC6、MTD-1A、MyEnd、NCI-H69CPR、NCI-H69LX10、NCI-H69LX20、NCI-H69LX4、NIH-3T3、NALM-1、NW-145、OPCNOPCT细胞系、Peer、PNT-1APNT2、RenCa、RIN-5F、RMARMAS、Saos-2细胞、Sf-9、SkBr3、T2、T-47D、T84、THP1细胞line、U373、U87、U937、VCaP、Vero细胞、WM39、WT-49、X63、YAC-1、YAR以及它们的转基因变体。细胞系可得自本领域技术人员已知的多种来源参见，例如，美国模式培养物集存库theAmericanTypeCultureCollection，ATCCManassas,VA。包含宿主细胞的流体介质中的外源物质，即，要经由转染加入宿主细胞中的外源物质，可以是能够被引入活细胞中以提供预期功能、结果或利益的任何物质。尽管转染通常被定义为将分子引入到受体细胞以加入、改变和或调节regular细胞的DNA，该定义在本文发明的上下文中可扩展为本发明的方法有利于将多种分子部分加入到宿主细胞中，包括但不限于最终影响宿主细胞DNA的结构和功能的分子部分。当术语"外源物质"在本文中使用时，则包括但不限于：核酸，诸如DNA、RNA、mRNA、小干扰RNAsiRNARNAi、microRNAmiRNA、编码将在宿主细胞中表达蛋白质的基因的DNA质粒、用作其它目的如产生增强子或RNA的DNA质粒、编码目标部分如CRISPR的同源重组供体的小线性DNA；蛋白质和多肽，包括激酶、细胞因子、染色质重塑酶、可视化的荧光蛋白质和正常蛋白的突变形式；以及小分子，特别是生物可用的低分子量1个碱基对错配的双链DNA。随后将消化的DNA稀释，并且在AATI片段分析仪上使用CRISPRDiscoveryGelKitDiscoveryGelKitDiscoveryGelKit运行以测量切割百分比。为测量切割百分比，AATIProSize软件比较了存在的“全长”DNA的量相对于在较小的“片段1”和“片段2”带中发现的量。这种切割百分比是CRISPY在细胞群中进行的编辑的百分比的代表。然而，T7E1酶不能检测1个碱基对插入缺失，后者可占CRISPR编辑事件的高达30％。通过该方法测量的切割百分比显著低估了插入缺失形成的真实比率。切割％＝片段1和2中的平均nmol全长中的nmol+片段1和2中的平均nmol重复试验工作并产生第二组结果。这两个试验在下文中被称为第1次运行和第2次运行。结果：图11显示了毛细管电泳凝胶，其显示了第1次运行的错配切割测定和分析的结果；图12是提供了第2次运行的结果的毛细管电泳凝胶。1,083bp片段是全长PCR产品，而"片段1"是827bp，"片段2"是256bp。这两幅图显示了实验样品中的切割和所有对照物中的无切割，表明成功进行了CRISPR转染和编辑。表8给出了每次运行的切割百分比：表8:第1次运行第2次运行还在图13的柱形图中示出了切割百分比结果，其中较暗的柱表示第1次运行的结果，较亮的柱表示第2次运行的结果。图14是第2次运行获得的荧光图像，使用具有RFP光立方体的EVOS荧光显微镜来检测标记的tracrRNA。在图像中可看出，在实验条件下将HPRT和非-靶向RNP成功转染到细胞中，而阴性对照物条件导致非常低的摄取。

权利要求：1.一种转染细胞的声学方法，所述方法包括：a提供系统，其包含：i至少两个储存器reseroir，每个储存器含有宿主细胞和待引入宿主细胞中的外源物质，和ii产生和导引声辐射的声辐射发生器；b将声辐射发生器声耦合至第一个储存器，而不同时将声辐射发生器声耦合至任何其他储存器；c激活声辐射发生器以产生声辐射并以诱导宿主细胞的声穿孔的方式将声辐射导引入第一个储存器中，从而促进外源物质引入声穿孔的宿主细胞；d将声辐射发生器与第一个储存器声学地分离；e将声辐射发生器声耦合至第二个储存器，而不同时将声辐射发生器声耦合至任何其他储存器；和f对于第二个储存器，重复步骤c。2.如权利要求1所述的方法，其中所述至少两个储存器被包含在多个储存器内，并且所述方法进一步包括g将声辐射发生器与第二个储存器声学地分离，并随后对于多个储存器中的其他储存器重复步骤b至g。3.如权利要求2所述的方法，其中所述多个储存器包括96个储存器、384个储存器、1536个储存器、3456个储存器或多于3456个的储存器。4.如权利要求3所述的方法，其中储存器以阵列布置。5.如权利要求4所述的方法，其中储存器包含在包括集成式多储存器单元的基板中。6.如权利要求5所述的方法，其中所述集成式多储存器单元包括孔板。7.如权利要求1所述的方法，其中以至多约0.5秒的储存器至储存器转换时间进行步骤c至e。8.如权利要求2所述的方法，其中以至多约0.5秒的储存器至储存器转换时间进行步骤b至g的重复。9.如权利要求8所述的方法，其中储存器至储存器转换时间为至多约0.1秒。10.如权利要求8所述的方法，其中储存器至储存器转换时间为至多约0.001秒。11.如权利要求8所述的方法，其中通过相对于声辐射发生器移动储存器进行每次的储存器至储存器转换。12.如权利要求8所述的方法，其中通过相对于储存器移动声辐射发生器进行每次的储存器至储存器转换。13.如权利要求1所述的方法，其中声辐射发生器包括聚焦元件，并且步骤c进一步包括聚焦步骤c中产生的声辐射，使得被导引入储存器的声辐射为聚焦声辐射。14.如权利要求1所述的方法，其中宿主细胞和外源物质被包含在流体介质中。15.如权利要求14所述的方法，其中诱导宿主细胞的声穿孔的方式包括将产生的声辐射传给宿主细胞的手段means。16.如权利要求15所述的方法，其中将声辐射传给宿主细胞的手段包括转染激发物质。17.如权利要求16所述的方法，其中所述转染激发物质包括流体介质中的多种声学可激活的部分。18.如权利要求17所述的方法，其中所述声学可激活的部分包括局部流体体积。19.如权利要求18所述的方法，其中所述局部流体体积是受限流体体积circumscribedfluidvolumes。20.如权利要求19所述的方法，其中受限体积包括充气微泡。21.如权利要求16所述的方法，其中步骤c中产生和被导引入储存器的声辐射使得微泡接收波长为微泡平均共振频率的约15％内或者微泡平均共振频率的谐波的约15％内的激发辐射。22.如权利要求19所述的方法，其中步骤c中产生和被导引入储存器的声辐射使得微泡接收波长为微泡平均共振频率的约5％内或者微泡平均共振频率谐波的约5％内的激发辐射。23.如权利要求20所述的方法，其中所述系统还包括确保微泡足够接近宿主细胞以便能够将声辐射从微泡传递到细胞的手段。24.如权利要求23所述的方法，其中所述手段包括在步骤b之前将微泡缀合至所述宿主细胞。25.如权利要求23所述的方法，其中将步骤a中提供的系统中的宿主细胞与微泡缀合。26.如权利要求14所述的方法，其中每个储存器中流体介质的体积在约0.5μL至约500μL范围内。27.如权利要求14所述的方法，其中流体介质包括等渗缓冲溶液。28.如权利要求1所述的方法，其中将细胞铺在储存器表面上。29.如权利要求1所述的方法，其中细胞是非贴壁的。30.如权利要求1所述的方法，其中外源物质包括核酸、质粒、肽、蛋白质、脂质、多糖、小分子或其组合。31.如权利要求30所述的方法，其中外源物质包括DNA质粒。32.如权利要求30所述的方法，其中外源物质包括核糖核蛋白。33.如权利要求32所述的方法，其中所述核糖核蛋白能够改变宿主细胞核酸。34.如权利要求33所述的方法，其中所述核糖核蛋白包括向导RNA和CRISPR相关的RNA可编程的DNA或RNA核酸酶蛋白或蛋白质复合物。35.如权利要求34所述的方法，其中所述核糖核蛋白包括向导RNA和Cas9蛋白。36.如权利要求35所述的方法，其中所述核糖核蛋白包括向导RNA和催化无活性的CRISPR相关的RNA可编程的DNA或RNA核酸酶蛋白或蛋白质复合物。37.如权利要求1所述的方法，其中在步骤c中，声穿孔包括以每秒约10至约25个短纯音的速度用声短纯音toneburst辐射储存器约15秒至约40秒。38.如权利要求37所述的方法，其中每个周期声短纯音为约5周期至10周期短纯音。39.一种转染宿主细胞的方法，包括：a通过将多个用第一结合部分进行表面功能化的充气微泡悬浮在与宿主细胞相容的流体介质中制备微泡组合物；b通过将微泡与对宿主细胞类型具有特异性并用连接到第一结合部分的第二结合部分功能化的抗体在流体介质中混合而将微泡缀合到该抗体，从而产生微泡-抗体缀合物；c通过将微泡-抗体缀合物与待转染到宿主细胞中的外源物质混合制备加载的微泡-抗体缀合物；d任选地用与宿主细胞相容的流体介质稀释加载的微泡-抗体缀合物，所述流体介质提供了具有有效优化转染效率的加载的微泡-抗体缀合物浓度的稀释液；e将储存器中的宿主细胞与稀释液接触；和f通过在导致微泡以其平均共振频率的约15％内或其平均共振频率谐波的约15％内的频率共振的条件下用声辐射来辐射储存器而使e中提供的宿主细胞-稀释液混合物声穿孔。40.一种转染细胞的声学方法，所述方法包括：将声辐射发生器声耦合至包含宿主细胞、待转染到宿主细胞中的外源物质和流体介质的储存器；和以诱导宿主细胞的声穿孔但不会导致流体介质中的温度升高大于约10℃的方式激活声辐射发生器以产生声辐射并将声辐射导引入储存器中。41.如权利要求40所述的方法，其中宿主细胞的声穿孔不会导致流体介质中的温度升高大于约5℃。42.如权利要求41所述的方法，其中宿主细胞的声穿孔不会导致流体介质中的温度升高大于约2℃。43.如权利要求40所述的方法，其中声穿孔不会将流体介质的温度升高到大于约40℃。44.如权利要求40所述的方法，其中被导引入储存器的声辐射是聚焦声辐射。45.一种转染细胞的声学方法，所述方法包括：将声辐射发生器声耦合到包含在包括至少1536个储存器的集成式多储存器单元内的选定储存器中，所述选定储存器包含宿主细胞、待被转染到宿主细胞中的外源物质和流体介质；和以诱导宿主细胞的声穿孔的方式激活声辐射发生器以产生声辐射并将声辐射导引入储存器中，从而促进外源物质进入声穿孔的宿主细胞中。46.如权利要求45所述的方法，其中导引到储存器的声辐射是聚焦声辐射。47.一种转染细胞的声学方法，所述方法包括：将声辐射发生器声耦合至储存器，所述储存器包含宿主细胞、待转染到宿主细胞中的外源物质、流体介质和由多个声学可激活的局部流体体积构成的转染激发物质；和以如下方式激活声辐射发生器以产生声辐射并将声辐射导引入储存器中，所述方式声激活局部流体体积以使其以局部流体体积的平均共振频率的约15％内或局部流体体积的平均共振频率谐波的约15％内的频率振动，从而促进声激活的局部流体体积附近的外源物质进入宿主细胞。48.如权利要求47所述的方法，其中使声激活的局部流体体积以局部流体体积的平均共振频率的约5％内或局部流体体积的平均共振频率谐波的约5％内的频率振动。49.一种转染细胞的声学方法，所述方法包括：将声辐射发生器声耦合至储存器，所述储存器包含宿主细胞、待转染至宿主细胞中的外源物质、流体介质和由具有一定尺寸分布的多个声学可激活的局部流体体积构成的转染激发物质；和以声激活尺寸为选定尺寸的约15％内的局部流体体积的方式激活声辐射发生器以产生声辐射并将声辐射导引入储存器中，从而促进声激活的局部流体体积附近的外源物质进入宿主细胞。50.一种转染细胞的声学方法，所述方法包括：a将声辐射发生器声耦合至储存器，所述储存器包含宿主细胞、待转染到宿主细胞中的外源物质、流体介质和由多个具有多模态尺寸分布的声学可激活的局部流体体积构成的转染激发物质；b以声激活尺寸为第一模态峰值的约15％内的局部流体体积的方式激活声辐射发生器以产生声辐射并将声辐射导引入储存器中，从而促进声激活的局部流体体积附近的外源物质进入宿主细胞；c重复步骤b以声激活尺寸为第二模态峰值的约15％内的局部流体体积；和d任选地重复步骤b以声激活尺寸为一个或多个其它模态峰值的约15％内的局部流体体积。51.一种转染细胞的声学方法，所述方法包括：将声辐射发生器声耦合至储存器，所述储存器包含宿主细胞、待转染到宿主细胞中的外源物质、流体介质和由多个具有一定尺寸分布的声学可激活的局部流体体积构成的转染激发物质；和以诱导宿主细胞的声穿孔的方式激活声辐射发生器以产生具有选定频率含量的声辐射并将产生的声辐射导引入储存器中，从而促进外源物质进入声穿孔的宿主细胞中，其中选择产生的声辐射的频率含量以使其关联于声学可激活的局部流体体积的尺寸分布。52.一种转染细胞的声学方法，所述方法包括：将声辐射发生器声耦合至储存器，所述储存器包含宿主细胞、待转染到宿主细胞中的外源物质、流体介质和由多个具有储存器内空间分布的声学可激活的局部流体体积构成的转染激发物质；和以诱导宿主细胞的声穿孔的方式激活声辐射发生器以产生具有选定频率含量的声辐射并将产生的声辐射导引入储存器中，从而促进外源物质进入声穿孔的宿主细胞中，其中选择产生的声辐射的频率含量以使其关联于声学可激活的局部流体体积的空间分布。53.一种转染细胞的声学方法，所述方法包括：将声辐射发生器声耦合至选定储存器，所述储存器包含宿主细胞、待转染到宿主细胞中的外源物质、流体介质和包括多个声学可激活的局部流体体积的转染激发物质；和以声激活局部流体体积的方式激活声辐射发生器以产生声辐射并将声辐射导引入储存器中，从而促进声激活的局部流体体积附近的外源物质进入宿主细胞，其中产生的声辐射处于如下声穿孔压力下：所述声穿孔压力被选择为确保在辐射后至少50％的局部流体体积保持完整。54.如权利要求53所述的方法，其中所述声穿孔压力在导致局部流体体积空化的最低声压的约50％至90％范围内。55.一种转染宿主细胞的方法，包括在包含与宿主细胞相容的流体介质中的微泡-抗体缀合物和待转染到宿主细胞中的外源物质的储存器中接触宿主细胞，并通过用两个转换器产生的声辐射来辐射储存器而将由此提供的宿主细胞-稀释液混合物声穿孔，其中所述两个转换器以不同频率协同操作，其中一个转换器为环形转换器，其可操作地安装在标准转换器周围并密封该标准转换器。56.如权利要求55所述的方法，其中所述环形转换器以约1MHz至约2.5MHz范围内的频率操作。57.如权利要求56所述的方法，其中所述标准转换器以约6MHz至约20MHz范围内的频率操作。58.如权利要求55所述的方法，其中两个转换器之一主要用于供应用于声穿孔的声能，另一个转换器递送声能以使得声穿孔细胞能够从流体介质中声喷射出来。59.如权利要求55所述的方法，其中两个转换器之一主要用于供应用于声穿孔的声能，另一个转换器递送声能以改变微泡对于宿主细胞的相对位置。60.如权利要求59所述的方法，其中改变微泡对于宿主细胞的相对位置以使微泡和宿主细胞彼此接近以促进声穿孔。61.如权利要求58所述的方法，其中将微泡和宿主细胞定位成在有效导致声穿孔的声强区域中彼此接近。62.在使用声穿孔转染宿主细胞的方法，改进包括在声穿孔事件之后评价转染效率，调整至少一个声穿孔参数作为候选方案以改进转染效率，进行额外的声穿孔事件，和评价该额外的声穿孔事件的转染效率以评估候选方案的效率。63.如权利要求61所述的方法，进一步包括根据额外的声穿孔事件的转染效率改变声穿孔参数。64.如权利要求62所述的方法，其中所述声穿孔参数选自声强、转换器输出频率和短纯音设置profile中的至少一种。

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