申请/专利权人：浙江易测环境科技有限公司

申请日：2018-12-14

公开（公告）日：2024-05-17

公开（公告）号：CN109852664B

主分类号：C12Q1/06

分类号：C12Q1/06;C12Q1/04;C12R1/01;C12R1/89

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.05.17#授权;2020.12.15#实质审查的生效;2019.06.07#公开

摘要：本发明公开了一种用于检测水华或赤潮水体中单一藻类生物量的方法，包括以下步骤：建立单一藻类生物量与色彩参数的关系方程；取水样并使用滤膜抽滤，使用色差计分析抽滤后滤膜的色彩参数，并使用显微镜观察藻的种类；根据藻的种类和色彩参数，通过色彩参数与生物量的关系方程，计算对应的生物量。本发明的目的在于提供一种用于检测水华或赤潮水体中单一藻类生物量的方法，可快速、高精度的测定水体中藻类叶绿素a的浓度，并且成本较低。

主权项：1.一种用于检测水华或赤潮水体中单一藻类生物量的方法，其特征在于，包括以下步骤：建立单一藻类生物量与色彩参数的关系方程；取水样并使用滤膜抽滤，使用色差计分析抽滤后所述滤膜的所述色彩参数，并使用显微镜观察藻的种类；根据所述藻的种类和所述色彩参数，通过所述色彩参数与生物量的关系方程，计算对应藻的生物量；所述色彩参数为Lab体系中的b值。

全文数据：一种用于检测水华或赤潮水体中单一藻类生物量的方法技术领域本发明涉及水体生物量的检测技术领域，尤其涉及一种用于检测水华或赤潮水体中单一藻类生物量的方法。背景技术水体中藻类生物量是水体水质优劣的重要指标之一，藻类暴发对环境与经济发展造成重大危害，严重影响水体水质，因此掌握水体藻类生物量情况，合理预测藻类生物量浓度变化越来越重要。目前，实验室藻类生物量常用叶绿素a含量来表征。其检测方法主要有可见光分光光度法、荧光法、色谱法、遥感技术和黑白瓶法四大类。其中，可见光分光光度法分析需要进行过滤-低温干燥-研磨-化学提取的前处理过程，并且使用仪器价格低廉，应用广泛，但是分析时间长，约12小时，无法实现原位分析。荧光法分析不需进行前处理过程，并且分析速度快，可用于在线实时分析，也可以用便携式仪器现场分析，但是分析仪器价格高，约40-60万元，不利于推广。色谱法分析需要进行过滤-低温干燥-研磨-化学提取的前处理过程，可以对测试的色素进行精确分类分析，干扰小，但是分析过程复杂，耗时长、成本高，且仪器较为昂贵、不便携。遥感技术分析需要建立数据库和模型建立，不需要对水样进行处理的过程，可用于大水体分析，测试范围广，测试速度较快，但是分析精度低，不同水系需要独立建模。黑白瓶法分析不需要进行前处理过程，能直接反应一个时间段的生产力总量，但是操作复杂、分析时间长，需24小时。综上所述，对于单一藻种的水华赤潮水样，目前还没有一种能在现场直接快速分析，并且精度较高、价格低廉、便于推广的方法。发明内容为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于检测水华或赤潮水体中单一藻类生物量的方法，可快速、高精度的测定水体中藻类生物量的浓度，并且成本较低。本发明的目的采用如下技术方案实现：一种用于检测水华或赤潮水体中单一藻类生物量的方法，包括以下步骤：建立单一藻类的生物量与色彩参数的关系方程；取水样并使用滤膜抽滤，使用色差计分析抽滤后所述滤膜的色彩参数，并使用显微镜观察藻的种类；根据所述藻的种类和所述色彩参数，通过色彩参数与生物量的关系方程，计算对应的生物量。通过建立藻类生物量与色彩参数的关系方程数据库，对于已知藻种，可在现场通过抽滤后滤膜的色彩参数快速分析水中藻类的生物量的浓度。进一步地，所述关系方程的建立方法包括以下步骤：配置多个不同浓度的单一藻种样品；使用所述滤膜对所述单一藻种样品进行抽滤，并用所述色差计分析抽滤后所述滤膜的色彩参数；使用回归分析方法对所述单一藻种生物量和色彩参数进行分析，得到所述关系曲线的关系方程。进一步地，所述生物量为叶绿素a含量、细胞密度、细胞干重、油脂含量、基因片段含量或ATP含量中的一种。进一步地，在进行抽滤之前，使用色差计分析空白滤膜的色彩参数。进一步地，所述滤膜为玻璃纤维滤膜；所述滤膜的孔径为0.2μm～0.45μm。进一步地，所述滤膜的孔径为0.2μm。进一步地，在用色差计分析抽滤后滤膜的色彩参数的步骤之前，将抽滤后的所述滤膜在通风处静置。进一步地，所述色彩参数为Lab色彩体系中的b值。相比现有技术，本发明的有益效果在于：通过建立藻类生物量与色彩参数的关系方程数据库，对于已知藻种，可通过色差计分析抽滤后滤膜的色彩参数，来快速分析水中藻类的生物量的浓度，分析精度高，且整个检测过程不需加入化学试剂，环保无毒害，并且分析设备价格便宜。具体实施方式下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。本发明提供一种用于检测水华或赤潮水体中单一藻类生物量的方法，该方法包括针对不同藻类分别建立色彩参数与生物量的关系曲线，形成色彩参数与生物量的关系数据库；根据单一藻种类—生物量的数据库，分析水体中对应的单一藻的生物量。生物量的表征方法有很多，不同生物量表征方法间存在显著的线性正相关关系。常用的指标有叶绿素a含量、细胞密度、细胞干重、油脂含量、基因片段含量或ATP含量。其中，细胞密度是指单位水体中藻细胞数量，以cellsL计；常用的检测方法有显微镜镜检法、光密度分析法、颗粒计数法、流式细胞仪分析法。叶绿素a含量分析常用的分析方法有丙酮提取分光光度法、热乙醇提取分光光度法、荧光法。细胞干重是指某一时间单位面积或体积栖息地内所含一个或一个以上生物种，或所含一个生物群落中所有生物种的总个数或总干重包括生物体内所存食物的重量，细胞干重的单位通常是用g㎡或J㎡表示。某一时限任意空间所含生物体的总量，量的值用重量或能量来表示，用于种群和群落。用鲜重或干重衡量时，规定用B表示；用能量衡量时，则用QB也称活体能量，biocontent表示。应当理解，关于藻类生物量的表征方法有很多，可根据实验需要样品数据，允许使用样品体积，样品浓度等等，选择合适的表征参数，然后选择合适的仪器，以期达到最佳的实验效果。针对不同种类单一藻建立色彩参数与生物量的关系曲线的方法步骤，以构建叶绿素a与色彩参数的关系曲线为例：取一定浓度的某种单一藻种水华赤潮实际水样或纯培养的藻液，摇匀后，使用叶绿素a荧光仪或光度法测定其叶绿素a浓度，记为C0。使用移液枪和量筒，配置多个不同浓度的单一藻种样品各500ml；使用孔径为0.2μm～0.45μm的滤膜，优选孔径为0.2μm的滤膜，对单一藻种样品进行抽滤，弃去滤液。应当理解，滤膜的孔径根据单一藻种类的形态、大小来选择，比如颤藻可以用0.45，个体比较小的曲壳藻要用0.20；也可以选择大于0.45μm或小于0.2μm孔径的滤膜。经过抽滤步骤后，将滤膜在阴凉通风处静置一段时间，优选5min。然后，用色差计分析抽滤后滤膜的色彩参数；在进行抽滤之前，使用色差计分析空白滤膜的色彩参数作为参照。使用回归分析方法对单一藻种叶绿素a浓度和色彩参数进行分析，得到色彩参数与叶绿素a浓度关系曲线的关系方程。应当理解的是，回归分析方法包括：最小二乘法、线性回归LinearRegression、逻辑回归LogisticRegression、多项式回归PolynomialRegression、逐步回归StepwiseRegression、岭回归RidgeRegression、套索回归LassoRegression，可以使用上述任意回归分析方法得出生物量与色彩参数的关系方程。当单一优势藻类赤潮或水华爆发时，水华或赤潮水体中对应的单一藻的生物量的分析方法以叶绿素a浓度与色彩参数的关系为例：取至少一个水样如500ml，水样浓度过高时进行稀释或者取少量；在进行抽滤之前，使用色差计分析空白滤膜的色彩参数。然后使用孔径为0.2μm～0.45μm的玻璃纤维滤膜进行抽滤，优选孔径为0.2μm的滤膜；经过抽滤步骤后，将滤膜在通风处静置一段时间，优选静置5min。再使用色差计分析抽滤后滤膜的色彩参数，并使用显微镜观察藻的种类；根据藻的种类和色彩参数，通过单一藻种的色彩参数与叶绿素a浓度的关系曲线，查出对应的叶绿素a浓度。根据本发明的实施例，本发明中的色彩参数为Lab色彩体系，应当理解的是，本发明还可以使用其他色彩体系得到与本发明相似的效果，如CHL色彩体系的C值和H值，Lab体系中的a值，优选地，色彩参数为Lab体系中的b值。通过建立藻类叶绿素a浓度与色彩参数的关系方程数据库，对于已知藻种，可通过色差计分析抽滤后滤膜的色彩参数，来快速分析水中藻类的叶绿素a的浓度，分析精度高，整个检测过程不需加入化学试剂，环保无毒害，并且分析设备价格便宜，便于推广应用。本发明具体实施方式如下：实施例一：链状裸甲藻赤潮快速分析1.建立链状裸甲藻叶绿素a浓度与滤膜色彩参数方程1取梅山万人沙滩附近链状裸甲藻赤潮实际水样，将水样摇匀后使用叶绿素a荧光仪测定该水样的叶绿素a浓度，记为C0C0＝50μgL。2使用移液枪和量筒，配置不同浓度的样品各500ml，各样品的浓度成梯度分布，具体配置方法见下表。3抽滤之前使用色差计分析空白滤膜的Lab色彩参数，再分别用0.2μm的玻璃纤维滤膜抽滤，弃去滤液。4抽滤后，将带有该链状裸甲藻的滤膜在阴凉通风处静置5分钟。5使用色差计分别分析抽滤后滤膜的Lab色彩参数，每张膜测试三次，取平均值，得到的每个叶绿素a浓度对应的色彩参数见下表。6使用最小二乘法对链状裸甲藻液叶绿素a浓度和对应滤膜的Lab参数进行分析，设色彩参数与叶绿素a的浓度对应的线性方程为：b＝a+k*c，其中，c为叶绿素a浓度，b为色彩参数，a为截距，k为线性斜率。得到k＝0.3326，a＝-0.7378；线性相关系数r＝0.9991，即求得该藻种叶绿素a浓度的线性方程为c＝b+0.7378÷0.3326。2.分析链状裸甲藻实际样品1取选梅山水道多个采样点，分别取500ml水样浓度过高时稀释或少取，用0.2μm的玻璃纤维滤膜抽滤。其中每个采样点采取三个样品，A，B为平行样，进行Lab色彩分析。C为对照样，使用荧光法进行分析测定。2抽滤后，将滤膜在阴凉通风处静置5分钟。3使用色差计分析抽滤后带有该链状裸甲藻的滤膜的Lab色彩参数。4抽滤之前，分析空白滤膜的Lab色彩参数作为参照。5使用显微镜判断藻种，确认水体中藻种单一，为链状裸甲藻。6链状裸甲藻线性方程如下：c＝b+0.7378÷0.3326，其中，浓度c，色彩参数b，线性斜率k，截距a，通过已测的色彩参数计算样品叶绿素a浓度。相对偏差＝A样品测量值-B样品测量值A样品测量值+B样测量值*100％，相对误差＝均值-真值真值*100％，以常规分析方法荧光法测试结果为真值即C样品测量值计算取得。通过上述对叶绿素a含量6.1～35.1μgL链状裸甲藻赤潮单一藻种样品进行分析，本方法的精密度在5.9％～12.4％；以荧光法测值为真值，准确度-18.7％～11.7％，可以满足分析需要。实施例二水华鱼腥藻生物量快速分析1.建立水华鱼腥藻叶绿素a浓度与滤膜色彩参数方程1取人工培养的水华鱼腥藻藻液约5×107cellL。摇匀后，使用叶绿素a荧光仪测定其叶绿素a浓度，记为C0C0＝40μgL。2使用移液枪和量筒，配置不同浓度的样品各500ml，各样品的浓度成梯度分布，具体配置方法见下表。3抽滤之前使用色差计分析空白滤膜的Lab色彩参数，再分别用0.2μm的玻璃纤维滤膜抽滤，弃去滤液。4抽滤后，将带有该水华鱼腥藻的滤膜在阴凉通风处静置5分钟。5使用色差计分别分析抽滤后滤膜的Lab色彩参数，每张膜测试三次，取平均值，得到的每个叶绿素a浓度对应的色彩参数见下表。6使用最小二乘法对藻液浓度和对应滤膜的Lab参数进行线性分析，设色彩参数与叶绿素a的浓度对应的线性方程为：b＝a+k*c，其中，c为叶绿素a浓度，b为色彩参数，a为截距，k为线性斜率。得到k＝0.562，a＝-0.6257；线性相关系数r＝0.9978，即求得该藻种叶绿素a浓度的线性方程为c＝b+0.6257÷0.562。2.分析水华鱼腥藻实际样品1取选某水库多个采样点，分别取500ml水样浓度过高时稀释或少取，用0.2μm的玻璃纤维滤膜抽滤。其中每个采样点采取三个样品，A，B为平行样，进行Lab色彩分析。C为对照样，使用荧光法进行分析测定。2使用色差计分析空白滤膜的Lab色彩参数。抽滤后，将滤膜在阴凉通风处静置5分钟。3使用色差计分析抽滤后带有水华鱼腥藻的滤膜的Lab色彩参数。4抽滤之前，分析空白滤膜的Lab色彩参数作为参照。5使用显微镜判断藻种，确认水体中藻种单一，为水华鱼腥藻。6水华鱼腥藻线性方程如下：c＝b+0.6257÷0.562浓度c，色彩参数b，线性斜率k，截距a，通过已测的色彩参数计算样品叶绿素a浓度。相对偏差＝A样品测量值-B样品测量值A样品测量值+B样测量值*100％，相对误差＝均值-真值真值*100％，以常规分析方法荧光法测试结果为真值即C样品测量值计算取得。通过上述对叶绿素a含量10.1～107.3μgL水华鱼腥藻单一藻种样品进行分析，本方法的精密度在4.4％～19.5％；以荧光法测值为真值，准确度-6.7％～18.5％，可以满足分析需要。上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

权利要求：1.一种用于检测水华或赤潮水体中单一藻类生物量的方法，其特征在于，包括以下步骤：建立单一藻类生物量与色彩参数的关系方程；取水样并使用滤膜抽滤，使用色差计分析抽滤后所述滤膜的所述色彩参数，并使用显微镜观察藻的种类；根据所述藻的种类和所述色彩参数，通过所述色彩参数与生物量的关系方程，计算对应藻的生物量。2.根据权利要求1所述的用于检测水华或赤潮水体中单一藻类生物量的方法，其特征在于，所述关系方程的建立方法包括以下步骤：配置多个不同浓度的单一藻种样品；使用所述滤膜对所述单一藻种样品进行抽滤，并用所述色差计分析抽滤后所述滤膜的所述色彩参数，得到所述生物量与所述色彩参数的关系曲线；使用回归分析方法对所述单一藻种的所述生物量和所述色彩参数进行分析，得到所述关系曲线的关系方程。3.根据权利要求1或2所述的用于检测水华或赤潮水体中单一藻类生物量的方法，其特征在于，所述生物量为叶绿素a含量、细胞密度、细胞干重、油脂含量、基因片段含量或ATP含量中的一种。4.根据权利要求3所述的用于检测水华或赤潮水体中单一藻类生物量的方法，其特征在于，在进行抽滤之前，使用色差计分析空白所述滤膜的所述色彩参数。5.根据权利要求4所述的用于检测水华或赤潮水体中单一藻类生物量的方法，其特征在于，所述滤膜为玻璃纤维滤膜；所述滤膜的孔径为0.2μm～0.45μm。6.根据权利要求5所述的用于检测水华或赤潮水体中单一藻类生物量的方法，其特征在于，所述滤膜的孔径为0.2μm。7.根据权利要求6所述的用于检测水华或赤潮水体中单一藻类生物量的方法，其特征在于，在用色差计分析抽滤后滤膜的色彩参数的步骤之前，将抽滤后的所述滤膜在通风处静置。8.根据权利要求1或2所述的用于检测水华或赤潮水体中单一藻类生物量的方法，其特征在于，所述色彩参数为Lab色彩体系中的b值。9.根据权利要求3所述的用于检测水华或赤潮水体中单一藻类生物量的方法，其特征在于，所述色彩参数为Lab色彩体系中的b值。

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