申请/专利权人：深圳市龙华区人民医院

申请日：2017-07-25

公开（公告）日：2017-10-20

公开（公告）号：CN107267636A

主分类号：C12Q1/68(2006.01)I

分类号：C12Q1/68(2006.01)I;A61K31/711(2006.01)I;A61P35/00(2006.01)I

优先权：

专利状态码：失效-未缴年费专利权终止

法律状态：2022.07.15#未缴年费专利权终止;2017.11.17#实质审查的生效;2017.10.20#公开

摘要：本发明涉及LncRNA GENE NO.9在制备膀胱癌诊断剂和治疗药剂中的应用，所述LncRNA GENE NO.9的序列如SEQ ID NO:1所示；还涉及一种用于检测膀胱癌的诊断试剂盒，其包括检测LncRNA GENE NO.9表达量的试剂；还涉及一种用于治疗膀胱癌的药剂，其包含抑制癌细胞中的LncRNA GENE NO.9表达量的活性成分。对于患有膀胱肿瘤的患者，可使用本发明的提供的检测试剂检测肿瘤组织的LncRNA GENE NO.9表达量，当检测发现LncRNA GENE NO.9表达量显著高于肿瘤旁边的正常膀胱组织或试剂盒中提供的正常膀胱组织时，可作为判定其为恶性组织的依据以及治疗靶点选择依据。然后可施用LncRNA GENE NO.9表达抑制剂，例如本发明提供的siRNA来进行治疗。

主权项：LncRNA GENE NO.9在制备膀胱癌诊断剂中的应用，所述LncRNA GENE NO.9的序列如SEQ ID NO:1、2或3所示。

全文数据：LncRNAGENENO.9的应用以及膀胱癌的诊断剂和治疗药剂技术领域[0001]本发明涉及肿瘤分子标志物和治疗祀点，更特别的，涉及LncRNAGENENO.9在诊断和治疗膀胱癌中的应用，以及根据LncRNAGENENO.9制备诊断剂和治疗剂。背景技术[0002]研宄表明，非编码RNANoncodingRNAs，ncRNAs占据人类基因组主体，根据长度，小于200bp的称为smallncRNAs，超过200bp的称为长链非编码RNALongnon-codingRNA，LncRNA。目前，科研工作者已经将smallncRNA的研究涉及到各个领域，但是对LncRNA了解却不多。[0003]有研宄表明，一些LcnRNA在基因组起到重要的表观遗传调控作用，在肿瘤中的发生、发展和转移中具有重要作用。H19作为最先被关注的LncRNA，被发现与多种泌尿系统肿瘤的发生发展密切相关。H19与IGF2胰岛素样生长因子2,Insulin-likegrowthfactor2编码基因并共用同一个增强子，所以在同一个染色体上了这两个基因不能同时被表达。正常细胞中，父源的H19被甲基化，无法被转录调节器CTCF识别，IGF2被表达翻译;母源性的H19基因没有被甲基化，CTCF识别H19并进行转录，IGF2不能转录。在病理学发展进程中，一些细胞的母源H19也被甲基化，导致IGF2过量表达，引起组织细胞异常增生，这便是肾胚细胞瘤Wilmstumours成因之一。此外，双等位基因H19甲基化伴随IGF2双等位基因异常表达在老龄男性中也是前列腺癌变易感因素之一。H19双等位基因甲基化水平降低引起的H19异常高表达，还参与并调控膀胱癌的多种生物代谢过程。[0004]膀胱癌是世界第九大肿瘤，其中尿路上皮癌占9〇%。近年来，膀胱癌的早期诊断和外科手术治疗技术日益精进，但该病死亡率仍居高不下。对于无肌肉浸润的膀胱癌，经典的外科手术和膀胱内化疗是最主流的治疗方法，但是高复发率依然是这类膀胱癌治疗的难点。浸润性膀胱癌患者预后很差，五年生存率小于50%，而对于转移性膀胱癌即使进行积极的综合治疗，生存中位数也只有10个月。[0005]因此，需要一种新的诊断标志物和治疗剂。发明内容[0006]GENEN0.9也称cancersusceptibilitycandidate9，CASC9的转录产物首次发现于食管癌中，曾用名ESCCAL-1、LINC00981。该基因可检测到三个转录本，长度为1300-1500bp，序列分别如SEQIDN0:l、2和3所示，这三个转录本均未编码蛋白质，因此为LncRNA〇[0007]发明人在对膀胱癌的研究过程中发现，73.7%肿瘤样本中GENENO.9的表达量高于癌旁正常组织。并且，在随后的实验中还发现，敲低GENENO.9的表达后，膀胱癌细胞的迁移和侵袭受到抑制。[0008]基于以上发现，本发明提供了LncRNAGENEN0.9在制备膀胱癌诊断剂中的应用，所述LncRNAGENEN0.9的序列如SEQIDN0:1、2或3所示。[0009]本发明还提供了LncRNAGENENO.9在制备膀胱癌治疗药剂中的应用，所述LncRNAGENENO.9的序列如SEQIDNO:1、2或3所示。[0010]本发明还提供了一种用于检测膀胱癌的诊断试剂盒，其包括检测LncRNAGENENO.9表达量的试剂。[0011]在一个实施方案中，所述检测LncRNAGENEN0.9表达量的试剂为检测LncRNAGENENO.9表达量的RT-PCR试剂、Northern检测试剂或RNA检测探针。[0012]在一个实施方案中，所述检测LncRNAGENEN0_9表达量的试剂为RT-PCR试剂，包括序列如SEQIDN0:4所示的正向扩增引物，以及序列如SEQIDN0:5所示反向扩增引物。[0013]在一个实施方案中，所述诊断试剂盒还包括RNA提取试剂。[0014]在一个实施方案中，所述诊断试剂盒还包括正常膀胱组织样品作为阴性对照和已经被鉴定为高表达LncRNAGENEN0.9的膀胱癌组织样品作为阳性对照。[0015]本发明还提供了一种用于治疗膀胱癌的药剂，其包含抑制癌细胞中的LncRNAGENENO.9表达量的活性成分。[0016]在一个优选实施方案中，所述抑制癌细胞中的LncRNAGENEN0.9表达量的活性成分为抑制1^1?嫩6£呢州.9表达的311?離，所述311?離的序列如8£〇10购:6、7或8所示。[0017]对于患有膀胱肿瘤的患者，可使用本发明的提供的检测试剂检测肿瘤组织的LncRNAGENEN0.9表达量，当检测发现LncRNAGENEN0.9表达量显著高于肿瘤旁边的正常膀胱组织或试剂盒中提供的正常膀胱组织时，可作为判定其为恶性组织的依据以及治疗靶点选择依据。然后可施用LncRNAGENEN0.9表达抑制剂，例如本发明提供的siRNA来进行治疗。附图说明t〇〇18]图1为38例膀胱癌组织样本中LncRNAGENEN0.9表达量的统计图；[0019]图2为显示膀胱癌组织和正常膀胱组织样本中LncRNAGENEN0.9表达量的分布的散点图；[0020]图3为显示膀胱癌组织和正常膀胱组织样本中LncRNAGENEN0.9表达量平均数和标准偏差的柱状图；[0021]图4为LncRNAGENE购.9在转化细胞系3丫-而：1细胞和肿瘤细胞系〇'24、了0^1^、UMUC3、J82和5637中的表达量统计图；[0022]图5为向5637中分别转入3中siRNA后LncRNAGENEN0.9的表达量统计图，*，p0.05;**，P〈0_01;***，P〈0.001;[0023]图6为向J82中分别转入3中siRNA后LncRNAGENENO.9的表达量统计图，*，p0.05;**，P〈0_01;***，P〈0_001;[0024]图7为5637的划痕实验照片；[0025]图8为根据图7的实验照片计算的5637的相对迁移能力；[0026]图9为J82的划痕实验照片；[0027]图10为根据图9的实验照片计算的j82的相对迀移能力；[0028]图11为5637和J82的穿井实验照片；[0029]图12为根据图11的实验照片计算的5637的相对迁移能力；[0030]图13为根据图11的实验照片计算的J82的相对迀移能力；[0031]图14为5637培养0-72小时的生长曲线；[0032]图15为J82培养0-72小时的生长曲线。具体实施方式[0033]以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。[0034]1•38例膀胱癌组织样本中的LncRNAGENEN0.9表达量检测[0035]1•1RNA提取[0036]①裂解:对于细胞样品，当细胞长满培养板的60-70%时弃上清，PBS洗两遍，加入Trizolambion，life公司，货号1S596026，六孔板每孔加lml;对于组织样品，采用液氮研磨，加入适量加入Trizol;[0037]②按比例每毫升Trizol加入200此的氯仿，上下用力混匀，静置5min，4°C10〇〇〇g离心15min。取上层澄清液体400此，加入等体积异丙醇混匀后室温放置5min，再次离心4°caoooog；[0038]③弃上清，75%乙醇重悬，再次离心弃上清，重复一次。[0039]④弃乙醇溶液后放在通风柜橱干燥，加入适量的DEPC水溶解RNA，测定浓度。[0040]1.2RNA反转录[0041]根据公司RTregentkitwithgDNAEraserRR047A说明书操作[0042]1.3RT-qPCR[0043]总反应体系20iL:2XSYBRGreenPCRMastermixTaraka公司）1〇此，引物1.如L，cDNAluL，双氧水7.4uL;[0044]引物序列为：[0045]ESSCAL1-F：5,-CCAGACAGCAGCAAAGCAAT-3,SEQIDNO:4[0046]ESSCAL1-R:5’-GGAAGCAGCAAATGTGTCCAT-3’（SEQIDN0:5[0047]该对引物扩增的序列是LncRNAGENENO.9的三个转录本的共有序列。使用LightCyCler480荧光定量PCR仪进行扩增反应，程序设定如下：95°C2min;95°Cl0s，60°C10s，72°C10s，40循环；721511^5[0048]结果如图1所示，38例确诊为膀胱癌组织样本中，有73.7%的肿瘤组织发生了LncRNAGENEN0.9高表达，图2和3显示，LncRNAGENEN0.9的表达量显著高于正常的膀胱组织P0.05，因此可认为，LncRNAGENEN0.9可作为膀胱癌的诊断标志物之一。[0049]2.膀胱癌细胞系中的LncRNAGENEN0.9表达量检测[0050]采用上文的方法，对五种膀胱上皮癌细胞系了24、了0^1^、而1^3、刊2和5637中的LncRNAGENEN0.9表达量进行检测，并与移形上皮转化细胞系SV-HUC1中的表达量进行比较。[0051]结果如图4所示，五种膀胱癌细胞系中LncRNAGENENO.9表达量均高于移形上皮转化细胞系SV-HUC1，尤其是UMUC3、J82和5637中，LncRNAGENEN0•9表达量是SV-HUC1的30倍以上，在5637甚至高达80倍。[0052]3.LncRNAGENENO.9的敲低[0053]根据上文的实验结果，选择J82和5637细胞系用来做LncRNAGENENO.9的敲低实验，并检测敲低后的相关基因表达和细胞迁移能力。[0054]3.1LncRNAGENEN0.9的敲低[0055]LncRNAGENENO.9的敲低使用siRNA的方法来实现，具体方法如下:六孔板铺上细胞，第二天长满培养板50%时，用Opti-MEMGibco，1ife公司，货号31985-070饥饿30min;[0056]取2.5nmolsiRNANC用125uLDEPC水溶解，每个孔的取量为10uL。取两个管标号A、B，每管加入100uLOpti-MEM;A管加入10uLlipofectamine300011【6公司），8管中加入siRNA或者NC10uL，分别混匀室温静置5min。将AB两管充分混匀，静置15min加入到六孔板中，转染6-8h。[0057]发明人在研宄中使用了三种siRNA，序列如下：[0058]5’-CAACUGGAUUCCAACUUUAUU-3’[0059]siRNA-1:3’-UUGUUGACCUAAGGUUGAAAU-5’（核心序列为CMCUGGAUUCCAACUUUA，SEQIDNO：6[0060]5’-CAAGMGUUUAGUAAACCAUU-3，[0061]siRNA-2:3’-UUGUUCUUCMAUCAUUUGG-5,（核心序列为CAAGAAGUUUAGUAAACCA，SEQIDNO：7[0062]5’-GAGAUCAUUAAGCCCAGMUU-3’[0063]siRNA-3:3’-UUCUCUAGUMUUCGGGUC-5’（核心序列为GAGAUCAUUAAGCCCAG，SEQIDNO：8[0064]这三种siRNA均与LncRNAGENENO.9的三个转录本的序列具有同源性。[0065]图5和6显示，将以上三种siRNA分别转入J82和5637细胞系后，两种细胞系中的LncRNAGENEN0.9表达量均发生降低。[0066]3.2肿瘤细胞的迀移能力测试[0067]对肿瘤细胞进行划痕实验图7-10和穿井实验图11-13。[0068]划痕实验的具体方法如下:转染后的细胞长满培养板80-90%，用合适大小的枪头划出两条垂直的划痕。无血清培养液培养，观察24h、48h、72h后划痕的愈合情况细胞向中间迁移情况）；[0069]穿井实验的具体方法如下:转染后的细胞稳定培养，以胰酶酰化，将不同转染组的细胞按10000_20000个细胞小室加入小室（CorningIncorporatedTranswellREF:3422，8•Own中。小室中使用无血清培养液，小室所在的24孔板的各孔中加入完全培养基，32-4¾后以4%多聚甲醛固定15min。采用结晶紫染色法观察小室底部由小室内穿过来的细胞数（显微镜Leica0MIRBOLYMPUSDP70。[0070]结果如图所示，与未被敲低的肿瘤细胞相比，转入了siRNA的J82和5637细胞迁移能力降低。[0071]3.3肿瘤细胞的增殖能力测试[0072]对敲低后的肿瘤细胞进行增殖能力测试，方法如下:细胞转染后立即消化下来，铺在96孔板中，每孔加入4000细胞，分别在〇h、24h、48h和72h时加入CCK-8试剂（货号C-60050，USEverbrightINC，孵育lh后酶标仪波长为630nm及450nm检测吸光度。[0073]结果如图14和15所示，肿瘤细胞的增殖能力显著降低。[0074]由上述实验结果显示，LncRNAGENENO.9的表达抑制剂可有效抑制高表达该非编码RNA的膀胱癌细胞的迁移和增殖，从而可作为这类膀胱癌的治疗剂或辅助治疗剂。[0075]以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

权利要求：1丄以^嫩6£呢觸.9在制备膀胱癌诊断剂中的应用，所述1此8祖0£肥冊.9的序列如SEQIDN0:l、2或3所示。2.1^^難6£肥齡.9在制备膀胱癌治疗药剂中的应用，所述1^«^齡0£呢购_9的序列如SEQIDNO:1、2或3所示。3.—种用于检测膀胱癌的诊断试剂盒，其特征在于，包括检测LncRNAGENENO.9表达量的试剂。4.根据权利要求3所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述检测LncRNAGENENO.9表达量的试剂为检测LncRNAGENENO.9表达量的RT-PCR试剂、Northern检测试剂或RNA检测探针。5.根据权利要求4所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述检测LncRNAGENENO.9表达量的试剂为RT-PCR试剂，包括序列如SEQIDN0:4所示的正向扩增引物，以及序列如SEQIDN0:5所示的反向扩增引物。6.根据权利要求5所述的诊断试剂盒，其特征在于，还包括RNA提取试剂。7.根据权利要求5或6所述的诊断试剂盒，其特征在于，还包括正常膀胱组织样品作为阴性对照和己经被鉴定为高表达LncRNAGENENO.9的膀胱癌组织样品作为阳性对照。8.—种用于治疗膀胱癌的药剂，其特征在于，包含抑制癌细胞中的LncRNAGENENO.9表达量的活性成分。9.根据权利要求8所述的药剂，其特征在于，所述抑制癌细胞中的LncRNAGENENO•9表达量的活性成分为抑制LncRNAGENENO.9表达的siRNA，所述siRNA的核心序列如SEQIDN0:6、7或8所示。

百度查询： 深圳市龙华区人民医院 LncRNA GENE NO.9的应用以及膀胱癌的诊断剂和治疗药剂

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