申请/专利权人：中国农业科学院上海兽医研究所

申请日：2017-09-19

公开（公告）日：2018-02-27

公开（公告）号：CN107739402A

主分类号：C07K14/18(2006.01)I

分类号：C07K14/18(2006.01)I;C07K16/10(2006.01)I;G01N33/68(2006.01)I;G01N33/569(2006.01)I

优先权：

专利状态码：失效-发明专利申请公布后的驳回

法律状态：2022.04.08#发明专利申请公布后的驳回;2018.03.23#实质审查的生效;2018.02.27#公开

摘要：本发明公开了一种猪瘟病毒Erns蛋白的抗原表位，所述抗原表位为：编码1D5抗原表位的短肽，序列如SEQ ID NO.1：LATDTEL所示，定位在46‑52AA。所述抗原表位可以与CSFV反应，而不与pCold‑TF空载体发生反应，也不与Vero细胞发生反应。所述抗原表位在猪瘟病毒抗体药物检测试剂中的应用，该应用使得猪瘟病毒抗体诊断抗原可以用普通化学合成方法制备，相比基因工程表达蛋白做为诊断抗原，合成抗原工艺简便，纯度更高。

主权项：一种猪瘟病毒Erns蛋白的抗原表位，所述抗原表位可以与CSFV反应，而不与pCold‑TF空载体发生反应，也不与Vero细胞发生反应。

全文数据：一种猪瘟病毒Erns蛋白的抗原表位、抗体的制备及应用技术领域[0001]本发明属于生物技术领域。更具体涉及一种猪瘟病毒Erns蛋白的抗原表位、抗体的制备及应用。背景技术[0002]CSF是由CSFV引起的猪的一种高度接触性传染病，给养猪业造成严重的经济损失。CSFV属于黄病毒科、瘟病毒属成员之一。CSFV是有囊膜的单股正链RNA病毒，基因组大小约12.3kb，仅含有一个大的开放性阅读框架ORF。此ORF翻译成含3898个氨基酸残基，分子量约438kDa的多聚蛋白，并进一步在病毒和宿主细胞蛋白酶的作用下加工成结构蛋白和非结构蛋白，其结构蛋白和非结构蛋白在病毒RNA上的编码顺序为Npro、C、ErnsEO、E1、E2、P7、NS2-3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B。其中，除C、Erns、El和E2为结构蛋白外.其余均为非结构蛋白。[0003]Erns，是病毒的一种囊膜糖蛋白，也称gp4448,旧称E0。有9个可能的糖基化位点，去糖基的蛋白骨架分子量约26KDa，由病毒ORF中Glu268-Ala494组成。在感染细胞中Erns在内质网内积累，并可存在于细胞膜表面或被分泌到胞外。在病毒粒子中Erns以97KDa的同源二聚体形式存在于囊膜表面。由于其分子内缺乏疏水的膜锚定区，与病毒囊膜结合力弱，易从囊膜上游离下来。Erns可诱导产生猪瘟的中和抗体，免疫猪可诱导产生对致死量CSFV的保护性免疫。由于编码Erns的核酸序列在属内比编码E2的序列保守程度高，因此Erns可作为防治猪瘟的一种靶蛋白。[0004]在病毒感染过程中，细胞膜上的受体与病毒配体结合是介导病毒侵入宿主细胞的关键因素，也是病毒能否感染细胞的关键。因此，研究病毒受体和病毒配体之间的相互作用成为目前病毒致病机制研究的热点问题之一，因为以其中的任何一个为药物靶点都可以阻断病毒与靶细胞的结合，从而抑制病毒的感染。关于CSFV配体的研究，已证实Erns蛋白参与了病毒的早期吸附，El和E2蛋白形成的异源二聚体可以介导CSFV侵入宿主细胞，并且此异源二聚体还起到使哺乳动物细胞融合的作用。但是，究竟这三种蛋白的哪些氨基酸序列作为病毒配体与病毒受体结合，目前还没有详细的报道。发明内容[0005]本发明的目的是在于提供了猪瘟病毒Erns蛋白的抗原表位，所述抗原表位为:编码1D5抗原表位的短肽，序列如SEQIDNO.1:LATDTEL所示，定位在46-52AA。所述抗原表位可以与CSFV反应，而不与pCold-TF空载体发生反应，也不与Vero细胞发生反应。[0006]本发明还有一个目的是在于提供了一种猪瘟病毒Erns蛋白的抗原表位在猪瘟病毒抗体药物检测试剂中的应用，该应用使得猪瘟病毒抗体诊断抗原可以用普通化学合成方法制备，相比基因工程表达蛋白做为诊断抗原，合成抗原工艺简便，纯度更高。[0007]本发明的另一个目的是在于提供了一种猪瘟病毒Erns蛋白的抗原表位模拟肽的制备方法，该方法优点是利用噬菌体随机肽库来筛选猪瘟Erns单克隆抗体1D5识别的表位，可以筛选出与原始序列不同但功能相似的构象表位抗原，即模拟表位抗原。[0008]为了实现上述的目的，本发明通过以下技术措施实现.[0009]一种猪瘟病毒Erns蛋白的抗原表位的制备方法，其步骤是：[0010]A、利用分子生物学对Erns主要抗原表位区域基因的扩增与重组质粒的构建。[0011]B、将重组蛋白的诱导表达与纯化，[0012]C、利用纯化蛋白进行小鼠免疫，获得杂交瘤细胞和单克隆抗体。[0013]D、单克隆抗体的稳定性和特异性检测。[0014]E、获得上述特异性单克隆抗体的抗原表位，并对其进行鉴定。[0015]一种猪瘟病毒Erns蛋白的抗原表位在制备治疗或预防猪瘟病毒ELSIA抗体药物检测试剂盒）中的应用，其步骤是：[0016]1、以获得的抗原表位作为参考化学合成抗原。[0017]2、以合成抗原制备试剂盒主要组分抗原包被板。[0018]3、按常规方法制备试剂盒其他组分。[0019]4、使用试剂盒检测血清中狂犬病病毒抗体。[0020]本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：[0021]1、本发明的抗原表位是由针对猪瘟病毒石门株的特定单抗筛选而来，具有极高的特异性和稳定性。[0022]2、与现有的灭活病毒抗原或基因表达抗原技术相比，生产过程中不涉及菌种和毒株，工艺安全有保障，不会对环境造成污染。[0023]3、利用获得的抗原表位合成肽抗原与基因工程表达抗原相比，生产周期短，易纯化且纯度较高。[0024]4、本发明适合大规模的临床血清检测，反应时间短，2小时即可出结果。[0025]5、本发明试剂盒与其他病毒阳性血清无交叉反应，敏感性高，特异性好。[0026]6、本发明试剂盒操作简便，与猪瘟病毒正向间接血凝试剂盒符合率高。附图说明[0027]图1为Erns重组蛋白的表达与纯化，M:蛋白质分子量标准；1:IPTG诱导的pCold-Erns转化菌裂解物沉淀；2:IPTG诱导的pCold-Erns转化菌裂解物上清；3:IPTG诱导的pCold-Erns转化菌全菌;4:IPTG诱导的pCold-TF转化菌。[0028]图2为IFA鉴定Erns蛋白单克隆抗体的特异性。[0029]图3为Erns蛋白单抗的Westernblot鉴定，I:Marker;2:IPTG诱导的pCold-Erns转化菌裂解物纯化的上清;3:IPTG诱导的pCold-TF转化菌。[0030]图4为Erns-1D5单克隆抗体表位的鉴定结果，其中，㈧Erns-1D5鉴定表位第1轮；⑶Erns-1D5鉴定表位第2轮CErns-1D5鉴定表位第3轮具体实施方式[0031]实施例1:材料与方法[0032]毒株、细胞和实验动物猪瘟病毒石门株，SP20骨髓瘤细胞，PK-15，Vero细胞均由中国农业科学院上海兽医研究所保存。细胞均在37°C、5%C02和10%FBSFBS，Sigma，Shanghai，China条件下培养。BALBc雌性小鼠购自上海斯莱克实验动物公司。[0033]载体、试剂和菌株pCold-TF载体，大肠杆菌BL21DE3购自Takara上海公司;HRP标记的山羊抗鼠IgG和FITC标记的山羊抗鼠IgG购于Sigma上海）公司；核酸内切酶EcoRI购自NEB上海公司。[0034]实施例2:Erns主要抗原表位的扩增、蛋白制备[0035]Erns主要抗原表位区域基因的扩增与重组质粒的构建[0036]根据NCBI发表的CSFVErns基因序列，将Erns基因的全长送公司（金唯智）优化合成，并将Erns基因全长与pCold-TF载体连接构建质粒，质粒测序正确后，阳性质粒命名为pCold-Erns〇[0037]重组蛋白的诱导表达与纯化[0038]将重组质粒pCold-Erns转化到BL21DE3大肠杆菌中，37°C振荡培养至0D600值达至IjO.6〜0.8时，加入终浓度为ImM的IPTG诱导，16°C振荡24小时。收集菌体加入PBS进行超声裂解，加入5XSDSbuffer煮沸IOmin后进行SDS-PAGE电泳，对SDS-PAGE蛋白胶进行考马斯亮蓝染色，观察蛋白表达情况，同时设置空载体表达组作为对照。之后将pCold-Erns转化表达菌按1:1000比例接种到4mL含100ygmLAmp的LB培养基中，37°C、200rmin振荡培养12h。然后再按1:100将复苏的菌液接种于IOOmL含100ygmLAmp的LB培养液中，37°C、200rmin培养，至0D600达到0.6〜0.8时停止，加入终浓度为lmmolLIPTG，16°C诱导24h后，离心收集菌体。表达后的菌体进行超声破碎，差速离心后收集上清蛋白。采用Ni柱Biotool进行纯化，纯化的蛋白分装后保存于-80°C。[0039]pCold-Erns载体转化的表达菌E.coliBL21DE3，经IPTG诱导后，收集菌体超声裂解进行SDS-PAGE凝胶检测。结果显示，与载体对照组相比，pCold-Erns表达菌出现了相对分子量约为90kDaTF辅助蛋白约60KDa的目的条带，与重组蛋白大小相符。目的蛋白主要都在裂解物上清中。重组蛋白经Ni柱纯化后，电泳结果显示纯化目的蛋白纯度较高（图1。[0040]实施例3:单克隆抗体的制备[0041]小鼠免疫[0042]取IOOyg纯化蛋白与弗式完全佐剂1:1混合乳化，接种6周龄健康雌性BALBc小鼠，此后每隔2周用等量纯化蛋白与弗氏不完全佐剂乳化进行第二和第三次免疫，第三次免疫后第10天采血，测定ELISA抗体效价，效价在1:10000以上的小鼠，在细胞融合前第3-4天经腹腔注射纯抗原200yg，进行加强免疫。[0043]McAbs的制备[0044]融合前Id取小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养层细胞，之后选取免疫效价最高的小鼠进行脾细胞与SP20细胞融合。将杂交瘤细胞培养在铺有饲养层细胞的96孔板里，在37°C、5%C02在HAT选择性培养基条件下培养。在杂交瘤细胞长满96孔板13〜12面积时，通过间接ELISA以及IFA的方法检测以筛选阳性细胞克隆株。将筛选的阳性细胞克隆株经3〜5轮细胞亚克隆之后，对能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞进行扩大培养，液氮冻存。将筛选的杂交瘤细胞株连续传代20代，分别取第5、10、15和20代细胞上清液，用间接ELISA的方法进行检测，鉴定杂交瘤细胞分泌抗体稳定性。将液氮冻存的杂交瘤细胞复苏，取复苏细胞的细胞上清液，用间接ELISA和IFA的方法进行检测，鉴定杂交瘤细胞分泌抗体的稳定性。[0045]实施例4:单克隆抗体的鉴定[0046]根据优化合成的Erns基因的序列，设计特异性引物扩增Erns全长序列。[0047]上游引物Erns-F:5’-tcgagctcaagcttcgaattctgGAAAATATCACCCAGTGGAAT-3’（SEQIDNO.2；[0048]下游引物Erns-R:5’-gtaccgtcgactgcagaattTGCATAGGCGCCAAACCA-3’（SEQIDN0.3。小写部分是与pEGFP-C3载体进行同源重组的同源臂序列，扩增产物为687bp。用PrimerstarHSTakara高保真酶扩增Erns基因。PCR扩增程序：95°C5min;98°CIOs，58°C1〇8,72°：11^1135个循环）；72°：1〇1^11。将？0?产物通过同源重组（诺唯赞）的方法，与PEGFP-C3载体多克隆位点的EcoRI位置重组，质粒测序正确后，阳性质粒命名为EGFP-Erns0[0049]将Vero细胞铺在6孔板中，待细胞长至50%-80%时，将EGFP-Erns质粒按2ug孔转染FUGENE，Promega细胞。24h后，将6孔板用5%BSA室温封闭Ih，PBS洗板之后加入收集的Erns蛋白的杂交瘤细胞上清液，室温孵育IhWBS洗3遍，避光加入FITC标记的羊抗鼠IgG1:800PBS稀释室温避光孵育Ih。在荧光显微镜下观察荧光。[0050]EGFP-Erns质粒转染vero细胞，24h后，固定细胞进行间接免疫荧光试验，以检测单克隆抗体Erns-1D5的特异性反应。结果显示，单克隆抗体Erns-1D5可以与EGFP-Erns蛋白反应图2，且既不与EGFP-C3空载体反应，也不与Vero细胞发生反应。[0051]Westernblot检测单克隆抗体[0052]将Vero细胞铺在6孔板中，待细胞长至50%-80%时，将EGFP-Erns质粒按2ug孔转染FUGENE，Promega细胞。24h后用细胞裂解液裂解细胞，收取细胞蛋白进行SDS-PAGE电泳。使用伯乐Trans-Blot®SDcellsystemBI〇-RAD，USA转印NC膜，5%脱脂奶粉室温封闭2h，用1:500稀释的杂交瘤细胞上清4°C孵育10h，TBST洗膜3次后，20min次。加入1:5000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，室温反应lh，TBST洗膜后，经过发光，曝光，显影，定影之后扫描图片。[0053]pCold-Erns载体转化的表达菌E.coliBL21DE3经IPTG诱导后，，进行SDS-PAGE、Westernblot方法以检测单克隆抗体Erns_lD5。结果显示，单克隆抗体Erns_lD5能与Erns蛋白发生特异性反应，在90KDa特异性条带，而不与pCold-TF空载体发生反应图3。[0054]实施例5:E2单克隆抗体表位的鉴定[0055]根据基因序列，设计14对引物表1，引物分别带有pCoId-TF载体EcoRI酶切位点上游臂和下游臂，对Erns基因进行截短，将扩增出的DNA片段连接到pCold-TF原核表达载体上，经测序正确后，转化到BL21DE3大肠杆菌中进行表达并诱导，将诱导表达的蛋白经SDS-PAGE分析，用单克隆抗体进行Westernblot鉴定。[0056]表1引物序列[0057][0058][0059]注:小写部分是与PC〇ld-TF进行同源重组的同源臂序列；大写部分是扩增Ems片段的引物。[0060]将截短的Erns蛋白经过单克隆抗体Westernblot鉴定，单克隆抗体1D5株针对的抗原表位定位在46-52AA图4，氨基酸序列为46LATDTEL52,定位在46-52AA。所述抗原表位可以与CSFV反应，而不与pCold-TF空载体发生反应，也不与Vero细胞发生反应。[0061]实施例6;—种猪瘟病毒Erns蛋白的抗原表位在制备治疗或预防猪瘟病毒ELSIA抗体药物检测试剂盒）中的应用，其步骤是：[0062]A、猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒中的抗原包被板制备：[0063]根据本发明SEQIDNO:1所示的序列，利用本领域中常规的化学合成方法，制备纯度大于95%的短肽，此短肽即为检测抗原。将此抗原用碳酸盐缓冲液溶解并稀释至2ygmL，然后按每孔IOOyL加入到96孔酶标板中，4°C放置过夜，使抗原吸附在酶标板中。第二天弃去孔中液体，每孔再加入150yL磷酸盐缓冲液含0.5%BSA，置37°C温箱中2小时、弃去孔中液体。拍干。[0064]B、猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒其他组分制备：[0065]试剂盒其他组分还包含酶标记物、样品稀释液、阳性对照、阴性对照、显色液A、显色液B、洗涤液和终止液。酶标记物为羊抗猪二抗，样品稀释液为磷酸盐缓冲液，阳性对照为猪瘟病毒疫苗免疫的猪阳性对照血清，阴性对照为未免疫猪瘟病毒疫苗的健康猪阴性血清。洗涤液为含有0.05%Tween-20的I3BS缓冲液;显色液A为含有50mgmL过氧化氢脲的柠檬酸盐缓冲液，显色液B液为含有0.2mgmLTMBpH5.0的柠檬酸柠檬酸钠缓冲液。终止液为含0.25%体积比氢氟酸溶液。[0066]C、猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒操作步骤：[0067]1从试剂盒中取出预包被有抗原的检测板，将稀释好的待检血清（1:40稀释）100μL加入抗原包被板中，同时设阴、阳性对照孔，各设2孔，每孔100yL。[0068]2轻轻振匀孔中样品，置37°C温育60分钟。甩掉板孔中的溶液，加洗涤液200yL孔，洗板5次，最后一次在吸水纸上拍干。[0069]3每孔加酶标记物100yL，置37°C温育30分钟。洗涤5次，方法同步骤2。[0070]4每孔加显色液A、显色液B各50yL，混匀，室温（18〜26°C避光显色10分钟。每孔加终止液50yL，10分钟内用酶标仪测定每孔0D450nm读值。[0071]本发明试剂盒判定标准为:试验成立条件是阴性对照孔平均0D450nm值与阳性对照孔平均0D450nm值之差大于或等于0.5。S=样品孔0D450nm值，N=阴性对照孔平均0D450nm值。若SN比值大于2.1，样品判为猪瘟病毒抗体阳性。若SN比值小于或等于2.1，样品判为猪瘟病毒抗体阴性。[0072]D、猪瘟病毒ELSIA抗体检测试剂盒的应用：[0073]1、特异性试验用猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒检测猪瘟病毒、伪狂犬病毒、猪口蹄疫〇型）、猪细小病毒、猪流感和猪繁殖与呼吸综合征等标准阳性血清和猪瘟病毒阴性血清，除猪瘟病毒标准阳性血清的SN值显著大于2.1外，其余血清SN值均小于2.1，符合阴性血清的判定标准，表明这种方法的特异性良好见表2,其中所列数字为0D450nm值）。[0074]表2血清特异性检测「00751[0076]2、敏感性的检测用试剂盒检测不同稀释度的猪瘟病毒阳性血清，从表3中可以看出即使1280倍稀释的猪瘟病毒阳性血清，依然检测为阳性，说明试剂盒的敏感性很高。[0077]表3血清敏感性检测[0078][0079]3、重复性实验[0080]利用优化后的条件建立的ELISA条件进行检测，获得的组间变异系数在1.19%〜6.34%之间；获得组间变异系数在1.98%〜6.14%之间，表明建立的ELISA具有良好的重复性。[0081]综上，利用本发明制备所得的猪瘟病毒特异性表位建立的ELISA试剂盒检测猪瘟病毒具有特异性强、重复性好、灵敏度高的优点，可用于临床猪瘟病毒样本的检测。[0082]应当理解，虽然上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明内容作了详尽的描述，但在本发明的基础上，可以对之进行一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

权利要求：1.一种猪痕病毒Erns蛋白的抗原表位，所述抗原表位可以与CSFV反应，而不与pCold-TF空载体发生反应，也不与Vero细胞发生反应。2.如权利要求1所述的一种猪瘟病毒Erns蛋白的抗原表位，所述抗原表位序列如SEQIDNO.I:LATDTEL所示，定位在46-52AA。3.—种抗体制剂，所述抗体制剂包含特异性针对权利要求1或2中所述的猪瘟病毒Erns蛋白的抗原表位的抗体，所述抗体是多克隆或单克隆的;或所述制剂包含所述抗体的片段。4.权利要求3所述的抗体制剂，所述抗体制剂可以有效的治疗或预防猪瘟病毒。5.—种制备抗血清的方法，所述方法包括将权利要求1或2中所述的抗原表位给药至动物宿主以在所述动物宿主中产生抗体和回收包含在所述动物宿主中产生的抗体的抗血清。6.—种抗原组合物，所述抗原组合物包含至少一种抗原，其中所述至少一种抗原包含猪瘟病毒Erns蛋白的至少部分蛋白或多肽且所述至少部分蛋白或多肽包含至少一种猪瘟病毒Erns蛋白的抗原表位或抗原决定簇。7.如权利要求6所述的抗原组合物，所述的猪瘟病毒Erns蛋白的抗原表位，所述抗原表位序列如SEQIDNO.I:LATDTEL所示，定位在46-52AA。8.权利要求1或2所述的一种猪瘟病毒Erns蛋白的抗原表位、权利要求3或4所述的抗体制剂、权利要求6、7所述的抗原组合物在制备治疗或预防猪瘟病毒ELSIA抗体药物检测试剂盒中的应用。

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