申请/专利权人：华中农业大学

申请日：2016-11-28

公开（公告）日：2017-05-31

公开（公告）号：CN106755064A

主分类号：C12N15/82(2006.01)I

分类号：C12N15/82(2006.01)I;A01H5/00(2006.01)I

优先权：

专利状态码：失效-发明专利申请公布后的视为撤回

法律状态：2020.07.17#发明专利申请公布后的视为撤回;2017.06.23#实质审查的生效;2017.05.31#公开

摘要：本发明公开了一种利用油菜基因Bnms4b制备黄叶烟草的应用，方法如下：（1）构建农杆菌侵染载体pCAMBIA2300‑Bnms4b；（2）利用农杆菌侵染的方法将Bnms4b基因导入到烟草叶片细胞中，培育筛选获得转基因的黄叶烟草；（3）提取转基因烟草幼嫩叶片的DNA，对Bnms4b基因进行PCR扩增检测，以确定阳性转化株。所述转基因烟草叶片呈现明显的黄化，其后代黄化表型能够稳定遗传，转基因烟草的叶绿素含量明显低于野生型，叶绿体形态异常，类囊体分布紊乱。本发明为研究烟草叶片的光合作用提供了一种新的途径，为该基因在烟草杂交育种利用和叶色观赏性植物创建等方面打下基础。

主权项：一种利用油菜基因Bnms4b制备黄叶烟草的方法，其步骤是：A.以pCAMBIA2300载体作骨架，构建植物表达载体pCAMBIA2300‑Bnms4b，用所述的植物表达载体转化农杆菌；B.通过农杆菌介导的遗传转化方法将所述的甘蓝型油菜基因Bnms4b导入野生型烟草中，培育筛选获得转基因烟草阳性苗；C.提取转基因烟草幼嫩叶片的DNA，对Bnms4b基因进行PCR扩增检测，以确定阳性转化株，检测引物的正向序列为F：5'‑AGTCCTTCCCTTTACTCAGCTC‑3'，反向序列为R：5'‑GATTTTATCAATGACAAAAAA‑3'，所得到的阳性转化株表现为叶片黄化的表型。

全文数据：甘蓝型油菜基因Bnms4b在制备黄叶烟草中的应用技术领域[0001]本发明属于基因工程和生物技术领域，具体涉及一种油菜基因Bnms4b在制备黄叶烟草中的应用。背景技术[0002]油菜杂种优势利用关键在于优良的授粉控制系统和双亲之间是否可以获得具有一定生产潜力的杂交种。相对于油菜细胞质雄性不育系统，隐性细胞核雄性不育系统有诸多天生的优点，主要表现为败育彻底，育性稳定，恢复源广，无不良胞质负效应，且有的核不育类型能获得全不育制种群体而具有良好的应用前景。本课题组克隆了甘蓝型油菜隐性核不育两型系7365AB系统的核不育基因Bnms4b，并将该基因及其育种应用申请了专利保护申请号：2〇151〇〇6785〇_8，该基因可导致多种十字花科植物产生不育表型，且不育表型具有败育彻底，无不良胞质负效应的特点，可以用于植物杂种优势利用和进行分子标记辅助育种。[0003]光合作用是地球上最大规模利用太阳能的过程，它为几乎所有的生命活动提供有机物、能量和氧气。光合作用是植物将太阳能转换为化学能，并利用它把二氧化碳和水等无机物合成有机物并释放出氧气的过程沈允刚，2006。光合作用效率与叶绿体的结构和功能是否完整，光合作用复合体的稳定性，叶绿素含量的高低都有着复杂的关系。叶绿素的减少或缺失将使叶片颜色变浅，叶绿素缺乏往往使植物发育迟缓、生物学产量降低、生长势减弱，甚至导致死亡，因此过去常被认为是无义突变，直到1949年，Gran-ick首次对发生失绿突变的小球藻chorella研究后，并用于阐明叶绿素合成的过程雷红梅，2〇1〇，才使人们认识到了黄叶突变体在理论研究上的重要价值。叶色黄化突变体作为一种特殊材料，对研究高等植物的叶绿体结构、叶绿素生物合成途径、光合机理、遗传控制等具有特殊价值常青山等，2〇13。叶绿素合成调控机理非常复杂，所以研究和开发影响叶绿素合成的相关基因，对提高植物的光合效率和产量至关重要。[0004]烟草的叶片，既是营养器官又是产品器官。烟草叶片的生长状况决定了烟草品质的好坏，探宄烟草叶绿素的合成和降解因素，对揭示叶绿素的代谢，通过人工改造提高光能利用效率和作物产量具有重要的意义。近些年来，叶色的应用价值备受关注，叶色变异可以作为标记性状用于基因工程创建，在育种繁育方面发挥重要的作用，不但可以用于苗期剔除受外援花粉污染的种子和假杂种，还可以用于测定种子纯度（章志兴，2001;魏祥进，2013。此外，叶色突变可以用于观赏性植物的叶色基因工程创建。植物叶色的变异，可以形成丰富的景观效果，增添不同的视觉感官，丰富城市的自然景观，体现城市的个性。发明内容[000S]本发明的目的是在于提供油菜基因Bnms4b在制备黄叶烟草中的应用，所述基因如SEQIDN0.1所示，利用农杆菌侵染的方法将Bnms4b基因转化到烟草叶片中，可显著降低烟草叶片中叶绿素含量，破坏叶绿体的形态建成，使烟草叶片出现黄化表型，方法简便可行。[0006]为了买现上述的目的，本发明采用以下技术方案：[0007]—种甘蓝型油菜基因BninS4b在制备黄叶烟草中的应用，其方法是：[0008]1•载体的构建：将基因Bnms4b的全长gDNA序列（如SEQIDNO•1所不）连接到PCAMBIA2300载体中，构建农杆菌侵染载体pCAMBIA2300-Bnms4b，图1是该载体的构建示意图；[0009]2•烟草的遗传转化:通过农杆菌介导的遗传转化方法将所述的甘蓝型油菜基因BmnS4b导入野生型烟草中，培育筛选获得转基因烟草阳性苗包括植物各部分组织），所得到的转基因烟草表现出叶片黄化的表型；[0010]3.阳性苗的鉴定:提取转基因烟草幼嫩叶片的DNA，设计相应引物对Bnms4b基因进行PCR扩增检测，以确定阳性转化株，检测引物的正向序列为f:5’-AGTCCTTCCCTTTACTCAGCTC-3’，反向序列为R:5’-GATTTTATCMTGACAAAAAA-3，。[0011]与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：[0012]本发明利用基因转化技术创建黄化烟草植株，所得的黄化烟草植株自苗期乃至整个生长过程有持续黄化的现象，且其后代的黄化表型可以稳定遗传。利用烟草的黄叶性状可通过叶色标记技术进行烟草的杂种优势育种繁种，剔除假种和检验种子纯度。同时通过研究烟草叶片的黄化机理，对揭示烟草叶绿素形成和降解，通过人工改造提高光能利用效率及抵抗生物和非生物胁迫具有重要的意义。附图说明[0013]图1为pCAMBIA23〇〇-Bnms4b表达载体构建示意图，其中（A图为PCAMBIA2300的空载体图谱，⑻图为构建的植物表达载体{^八題1423003111^415的图谱。[00M]图2为转基因烟草阳性苗PCR检测，其中C为包含Bnms4b基因的阳性对照；阴性对照为WT野生型烟草）与water水）；M:分子量标记Maker，Tl至T8为转Bnms4b基因烟草植株扩增结果。[0015]图3为^^^^基因转化烟草所得的转化植株与野生型烟草的黄化表型对比图。yi为转基因烟草阳性苗，WT为野生型烟草。[0016]图4为烟草转化植株与表型相对应的叶绿素含量测定。Tobl到Tob4为转基因烟草叶片由黄到绿的梯度图，WT为野生型烟草。[0017]图5为烟草转化植株叶绿体形态的透射电镜观察。Tobl到Tob4为转基因烟草叶片由黄到绿的梯度图，WT为野生型烟草。具体实施方式[0018]以下结合具体实施例，进一步定义本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如《分子克隆：实验室指南》NewYork:ColdSpringHarborLaboratory,1989中所述的条件，或者按照生产厂商提供的操作手册中建议的条件。^[0019^采用常规农杆菌侵染法进行烟草的遗传转化。本发明中转化的品种为野生型烟草，为华中农业大学实验基地常规种植华中农业大学园艺植物生物学教育部重点实验室叶志彪教授赠送）。本发明中所用的农杆菌侵染载体PCAMBIA2300-Bnms4b由本实验室的夏胜前老师赠予，图1是该载体的构建示意图。[0020]实施例1:农杆菌侵染载体pCAMBIA2300-Bnms4b的构建方法[0021]本实施例通过对Bnms4b基因的gDNA全长序列进行酶切位点分析，发现其可以不被Kpnl和Sail酶切。设计扩增基因全长的引物CC2F⑻，左右引物分别加上Sail和Kpnl的酶切位点，利用高保真PCR聚合酶PhusionTMHigh-FidelityDNAPolymerse,来自NewEnglandBiolads公司）分离基因全长序列，将扩增片段如SEQIDNO.1所示）克隆到pCAMBIA2300华中农业大学作物遗传改良国家实验室林拥军教授赠送载体上，测序结果表明序列完全准确，没有错配碱基存在。提取插入片段序列正确的克隆的融合质粒，并转化大肠杆菌DH5a购自北京全式金公司），在含有5〇UgmL卡那霉素的LB培养基上筛选转化子，挑选单菌落提取质粒，酶切检测准确的克隆所包含的载体就是包含正确Bnms4b*长的融合载体pCAMBIA2300-Bnms4b图1。将载体质粒通过电转化的方法转导GV3101农杆菌菌株中本实验室长期保存的菌株），在含有5〇UgtnL卡那霉素和50ugmL庆大霉素的固体培养基上挑取单克隆，并进行PCR检测确认阳性克隆后，将该单克隆于-80°C保存起来，用于野生型烟草的遗传转化。[0022]CC2F正向引物）：GCGGTACCAACCGAACTTTCATATAATCCGAATGGGGC;[0023]CC2R反向引物）：GCGTCGACATATCACCAGCACCAACAGITTTCTTTTGC。[0024]实施例2:甘蓝型油菜基因Bnms4b在制备黄叶烟草中的应用，其步骤是：[0025]1无菌苗的获得。先将成熟饱满的野生型烟草种子用70%的酒精浸泡2min，0•1%升汞溶液消毒6min，无菌ddH20清洗5_6次，每次清洗5min;将灭菌的种子播于编号为播种培养基上，于光照强度25001ux、光周期16hd、23度的温度条件下培养30天左右。[0026]2农杆菌的准备。挑取实施例1中_80°C保存的农杆菌，接种到50mL的液体LB添加相应抗生素50mgmLKana和50mgmLRif中，28°C，l8〇rmin培养，至0D600=0.6约需12-14h，然后4000rmin离心收集菌体，用悬浮液悬浮，倒入培养皿中待用。[0027]⑶预培养。选烟草无菌苗中部完全展开的健壮叶，剪去叶缘、主脉及叶柄后，将叶片剪成0.8cmX0.8cm大小，叶背朝上放到预培养基上，预培养基成分同共培养基，每皿6-8片，于28°C黑暗条件下预培养3d。[0028]⑷农杆菌侵染。将预培养的叶片放入制备好的农杆菌液中，浸泡8-10min，其间轻轻摇晃培养皿数次，使菌液与材料充分接触，取出叶片，置于无菌滤纸上吸去多余菌液。[0029]5共培养。将叶片接种于共培养基上，注意叶背面朝上，于28°C黑暗条件下共培养2d。[0030]6筛选分化。将叶片转入筛选培养基进行抗性芽的筛选分化，每15d更换一次培养基。[0031]7生根培养。叶片在筛选培养基上长出比较明显的抗性芽时，将抗性芽切下，转到生根培养基，进行抗性苗的生根培养。长根后再移入营养钵中炼苗，一个月后移入大田。[0032]筛选得到的转化植株，取拇指盖大小的绿色叶片，提取DNAStewartjrandVia,1993，进行转化材料的PCR阳性检测。[0033]引物序列:F:5’-AGTCCTTCCCTTTACTCAGCTC-3’，[0034]R:5’-GATTTTATCAATGACAAAAAA-3’。[0035]反应体系为10uL:模板DNA为luL约100ng;10*Taqbuffer含MgCl2luL，dNTP1Ommo1LlyL，引物F，R各0•5yL，Taq5UyL0•5yL，ddH205•5uL。反应条件为94°C5min;94°〇3〇3,551：3〇3,72°：11^113^，32个循环；72°：1〇111111。统计获得抗性再生植株29株，对获得的转基因阳性植株的表型进行观察发现转化植株比野生植株矮小，且叶片呈明显的黄化现象。[0036]⑻烟草遗传转化步骤中所用的培养基配方如下：[0037]播种培养基:MS+30gL蔗糖+7gL琼脂[0038]悬浮液:MS+30gL鹿糖[0039]预共培培养基以3+2.2511^16-84+0.31^八嫩六+3^1蔗糖+7卩凡琼脂[0040]筛选培养基:1^+2.2511^16-8么+0.311^凡嫩八+10011^几1〇1+40011^凡〇6€+3^几蔗糖+7gL琼脂[0041]生根培养基:MS+100mgLKM+400mgLcef+30gL薦糖+7gL琼脂[0042]所有培养基的PH都调为5.8。[0043]实施例3:丙酮法测转基因烟草叶片的叶绿素含量[0044]为了进一步确定Bnms4b导致烟草黄花的现象，取不同黄化程度的转基因野草和野生型烟草叶片，将所取叶片去除叶脉并剪成小碎片，分别称取〇.2克放入25mL容量瓶中，倒入25mL的丙酮：乙醇溶液（1:1，vv。置于黑暗处常温下浸泡48h，期间多次摇动。将浸提液移至光径lcm的比色皿中，以丙酮和乙醇1:1溶液为空白对照，用紫外分光光度计测定在波长645nm和663nm下的吸光度值，按Arnon1949公式计算：[0045]叶绿素a浓度mgL:Ca=12.7A663-2.69A645[0046]叶绿素b浓度mgL:Cb=22.9A645-4.68A663[0047]叶绿素总浓度mgL:Ca+b=Ca+Cb[0048]计算提取液中叶绿素浓度，换算为每克鲜叶叶绿素含量mgg鲜重）。其中A645和八663分力U为在波长645nm和663nm下所得吸光度值。按上述公式计算得到叶绿素的浓度后，再利用下列公式计算叶绿素含量：[0049]叶绿素含量mgg=CXV1000A[0050]式中C:叶绿素浓度mgL;V:提取液总体积mL;A:叶片鲜重g;[OO51]经测量，转基因烟草叶片的叶绿素含量随叶片由黄到绿呈逐渐升高的趋势。[0052]实施例4:叶绿体形态的透射电镜观察[0053]为了进一步确定Bnms4b基因影响了烟草叶片的叶绿素合成，取不同黄化程度的转基因野草和野生型烟草叶片，将所取叶片去除叶脉并剪成小碎片，用2.5%的戊二醛固定25%的戊二，用PH7•2，0•2M的磷酸缓冲液稀释至2_5%，用小型真空栗抽真空直至碎片全部沉到2mL离心管管底，4°C过夜。用0.2M的磷酸缓冲液PH7.2清洗三次后，进行锇酸固定（1%值7_0，大约2h。固定完成后，再次用磷酸缓冲液洗涤3次，每次10min。之后进入脱水环节，各级酒精梯度脱水，每次3〇min，酒精梯度依次为30%，50%，70%，80%，90%，100%乙醇两次）。脱水完成后，倒掉酒精。材料用酒精与SPI_812树脂混合液按梯度依次渗透，渗透液比例3:1;3:2;3:3，每次3h。之后用SPI-812包埋，包埋后的材料放入37。：烘箱12h后，移至6〇°C烘箱直到材料完全聚合硬化。超薄切片使用Leic£lUC6切片机制备，厚度50-70nm，切片措至铜网，用2%wv乙酸铀酰和2.6%wv柠檬酸铅双染色。染色后样品在华中农业大学公共电镜平台日立Hitachi-7650透射电镜下镜检照相。检测结果如图5所示，野体明概突变体的叶绿体大，正物体呈株=十绿体呈不麵形状（图私心以^风⑽：野生型叶绿体图内含大^^垛置的基粒，且规则的分布在叶绿体基质中（图5B，5〇，而转化株的叶绿体基粒分布紊浓缩在一起，呈不规则排布（图5H，51，5K，5L，训，5〇。由此可见，转基因植株叶片中的叶^体结构出现异常，导致了叶片的黄化。"[0054]以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明的基础上，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换;而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精祌和范围。

权利要求：1.一种利用油菜基因Bnms4b制备黄叶烟草的方法，其步骤是：A•以pCAMBIA2300载体作骨架，构建植物表达载体pCAMBIA2300-Bnms4b，用所述的植物表达载体转化农杆菌；B•通过农杆菌介导的遗传转化方法将所述的甘蓝型油菜基因Bnms4b导入野生型烟草中，培育筛选获得转基因烟草阳性苗；C.提取转基因烟草幼嫩叶片的DNA，对8腦341基因进行PCR扩增检测，以确定阳性转化株，检测引物的正向序列为？：5’40代：1'1'：：：1'1^人：代六0：1'：-3’，反向序列为1?:5’-GAnTTATCAATGACAMAM-3’，所得到的阳性转化株表现为叶片黄化的表型。2.权利要求1所述的油菜基因Bnms4b在制备黄叶烟草中的应用。

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