申请/专利权人：武汉中博生物股份有限公司

申请日：2014-01-27

公开（公告）日：2015-12-02

公开（公告）号：CN103760365B

主分类号：G01N33/68(2006.01)I

分类号：G01N33/68(2006.01)I;G01N33/569(2006.01)I

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2015.12.02#授权;2014.06.04#实质审查的生效;2014.04.30#公开

摘要：本发明公开了一种检测猪瘟病毒Erns及E2抗原的BAS-ELISA试剂盒，属于生物技术和动物传染病诊断研究领域。该试剂盒包含有：包被抗CSFV-Erns单克隆抗体及抗CSFV-E2单克隆抗体的酶标板、样品稀释液、CSFV阳性对照和CSFV阴性对照、洗涤液、生物素化兔抗CSFV-Erns多克隆抗体及生物素化兔抗CSFV-E2多克隆抗体混合液、酶标链霉亲和素、酶显色底物和终止液。其中，两种单克隆抗体与对应的多克隆抗体所针对的抗原表位不同。本发明的试剂盒采用生物素-亲和素检测系统，并对猪瘟病毒Erns及E2蛋白联合检测，大大提高了猪瘟病毒检测的灵敏度、特异性和可重复性，可用于对猪瘟的诊断及研究工作。

主权项：一种检测猪瘟病毒Erns及E2抗原的BAS‑ELISA试剂盒，其特征在于包含有：包被抗CSFV‑Erns单克隆抗体及抗CSFV‑E2单克隆抗体的酶标板、样品稀释液、CSFV阳性对照和CSFV阴性对照、洗涤液、生物素化兔抗CSFV‑Erns多克隆抗体及生物素化兔抗CSFV‑E2多克隆抗体混合液、酶标链霉亲和素、酶显色底物和终止液；所述的抗CSFV‑Erns单克隆抗体、抗CSFV‑E2单克隆抗体和兔抗CSFV‑Erns多克隆抗体、兔抗CSFV‑E2多克隆抗体是采用原核表达的CSFV‑Erns及CSFV‑E2重组抗原分别免疫Balbc小鼠和家兔得到；CSFV‑Erns及CSFV‑E2重组抗原的制备包含如下步骤：1以猪瘟病毒的RNA为模板使用如下引物分别PCR扩增CSFV‑Erns和CSFV‑E2片段，ErnsF：5’‑CGGGATCCGAAAATATAACTCAGTGGAACCTGA‑3’，ErnsR：5’‑CGCTCGAGGGCATAGGCACCAAACCAG‑3’；E2F：5’‑CGGGATCCCGTCTAGCCTGCAAGGAAG‑3’，E2R：5’‑CGCTCGAGTAGATCTTCATTTTCCACTGTGG‑3’；2通过限制性内切酶及DNA连接酶将CSFV‑Erns和CSFV‑E2片段分别连接到pET30a载体上构建重组质粒pET30a‑Erns和pET30a‑E2‑N；3将重组质粒pET30a‑Erns和pET30a‑E2‑N分别转化到含有表达伴侣蛋白GroEL的PGrO7重组质粒的BL21中进行原核表达得到CSFV‑Erns及CSFV‑E2重组抗原；表达条件为：在含10μgmL的卡那霉素和20μgmL的氯霉素的LB培养液中，于37℃、180rpm将细菌培养至OD＝0.2；加入伴侣蛋白的诱导剂四环素和L‑阿拉伯糖，四环素和L‑阿拉伯糖的终浓度分别为5ngmL、1mgmL，37℃、180rpm继续将细菌培养至OD＝1.0；加入终浓度为0.5mM的IPTG，30℃、180rpm诱导过夜。

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