申请/专利权人：西南大学

申请日：2016-01-12

公开（公告）日：2018-10-02

公开（公告）号：CN105420256B

主分类号：C12N15/54(2006.01)I

分类号：C12N15/54(2006.01)I;C12N9/12(2006.01)I;C12Q1/6895(2018.01)I

优先权：["2015.12.31 CN 2015110285079"]

专利状态码：失效-未缴年费专利权终止

法律状态：2019.12.27#未缴年费专利权终止;2018.10.02#授权;2016.04.20#实质审查的生效;2016.03.23#公开

摘要：本发明公开了水稻黄绿叶突变基因YGL8及其编码的蛋白和应用，其中水稻黄叶突变基因YGL8的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示，氨基酸序列如SEQ ID No.12所示，与野生型相比水稻黄绿叶突变基因YGL8在编码框第671位碱基由C转换为T，导致第224位的编码氨基酸由丙氨酸Ala变异为缬氨酸Val，该基因突变后的水稻YGL8突变体在全生育期叶片均呈现黄绿色，遗传分析发现该性状为隐性性状，能够将此性状作为分子标记进行田间除杂和种子纯度鉴定，对水稻的遗传育种具有重要意义。

主权项：1.水稻黄绿叶突变基因YGL8，其特征在于：核苷酸序列如SEQ ID No.11所示。

全文数据：水稻黄绿叶突变基因YGL8及其编码的蛋白和应用技术领域[0001]本发明属于遗传学领域，具体涉及一种水稻黄绿叶突变基因YGL8,还涉及该基因编码的蛋白和应用。背景技术[0002]水稻OrvzasativaL.是世界上最重要的粮食作物，在120个国家和地区广泛种植，全球一半以上的人口以稻米为主食。我国成功育成杂交水稻，并进行推广和应用，增产的粮食为一些国家实现粮食自给创造了条件，对国家乃至世界粮食安全作出了杰出贡献。然而由于不育系育性不稳定而造成的杂交种子混杂，严重影响杂种纯度和杂交水稻的生产，甚至给农民造成的严重损失，制约杂交稻发挥更大作用。在两系和三系杂交稻育种及生产实践中，人们发现不育系不育性表达不稳定现象普遍存在。因此，如何有效提高亲本繁殖制种过程中的除杂效率，快速准确鉴定种子生产过程中因育性波动可能出现的种子纯度问题，已成为杂交水稻研究和应用中的一个重要课题。叶色突变体可作为苗期标记性状进行作物杂种一代新品种选育和种子纯度鉴定，其优势是在苗期即可通过观察标记性状的存在或消失与否来识别真假杂种，因此在三系和两系杂交水稻亲本繁殖、杂交制种、杂交种子纯度鉴定等方面得到充分利用。该项技术直观准确，简便快速，具有一般的异地种植鉴定和DNA分子标记鉴定技术无法比拟的优越性。近年来育种家已经选育出多个带有叶色标记的不育系，如白化转绿叶色标记不育系白丰A、淡黄叶不育系标810S、黄叶不育系黄玉A和黄绿叶不育系黄标A系列。但由于多数苗期标记性状单系本身性状不优良、光合效率下降，造成植株生长发育不正常而减产，使其在育种实践中的应用受到限制。因而，发现一些稳定遗传、叶色变异对其它性状尤其产量、品质性状没有显著影响的叶色突变非常重要。发明内容[0003]有鉴于此，本发明的目的之一在于提供水稻黄绿叶突变基因YGL8,该基因为全生育期标记性状，为水稻转基因研究提供有力的工具，促进杂交稻育种研究;本发明的目的之二在于提供水稻黄绿叶突变基因YGL8编码的蛋白质;本发明的目的之三在于提供水稻黄绿叶突变基因YGL8的应用。[0004]为实现上述目的，本发明利用甲基磺酸乙酯EMS诱变优良恢复系缙恢10号，获得了一个全生育期叶片均表现为黄绿色的突变体命名为ygl8，遗传分析发现该突变性状受一对隐性核基因（命名为YGL8控制。分子标记定位结果显示，该基因定位于第1染色体长臂端Indel标记ID-3和SSR标记RM12339之间54kb的区间内。[0005]在上述基因定位的基础上，本发明通过候选基因预测、同源搜索及基因序列差异比较，初步确定了YGL8为尿苷酸激酶UMPkinase基因（L〇C_0s01g73450;随后，本发明以水稻黄绿叶突变体ygl8为材料，克隆了该基因的cDNA并进行了测序，具有如SEQIDNo.11所示的核苷酸序列，结果显示，YGL8基因由7个外显子组成，CDS编码框全长为1056bp，共编码351个氨基酸，其氨基酸序列如SEQIDNo.12所示。与缙恢10号野生型基因相比，YGL8基因在编码框第671位碱基由C转换为T，导致第224位的编码氨基酸由丙氨酸Ala变异为缬氨酸Val，该突变位点位于UMP结合位点附近。[0006]然后，本发明构建了互补载体并转化水稻黄绿叶突变体ygl8，性状分析发现转基因阳性植株叶片恢复正常绿色，叶绿素含量分析显示转基因阳性植株叶片叶绿素含量恢复正常水平;构建RNAi载体并转化缙恢10号，经鉴定转基因阳性植株叶片变为黄绿色、叶绿素含量极显著降低，转基因阳性植株中YGL8突变基因表达量也明显下调。因此，确定突变体黄绿叶性状是由YGL8基因突变引起的。[0007]本发明的有益效果在于:本发明提供了水稻黄绿叶突变基因YGL8,该基因为苗期标记性状，对千粒重等主要农艺性状无显著影响，为水稻遗传育种研究提供了有力的工具，为选育纯种不育系奠定基础。附图说明[0008]为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：[0009]图1为野生型缙恢10号和水稻黄绿叶突变体ygl8形态学观察结果A:苗期野生型缙恢10号与ygl8突变体植株和叶片;B:分蘖期野生型缙恢10号与ygl8突变体植株和叶片；C:成熟期野生型缙恢10号与ygl8突变体植株）[0010]图2为野生型缙恢10号和水稻黄绿叶突变体ygl8的细胞超微结构分析A-B:野生型缙恢10号的细胞超微结构分析;C-D:ygl8突变体的细胞超微结构分析）。[0011]图3为野生型缙恢10号与ygl8突变体主要农艺性状分析A:株高;B:单株有效穗数;C:每穗粒数;D:每穗实粒数;E:结实率;F:千粒重）。[0012]图4为水稻黄绿叶突变基因YGL8基因的遗传和物理图谱，其中A为YGL8的初步定位，在第1染色体长臂SSR标记RM6141和RM6321之间;B为YGL8基因的精细定位，在InDel标记ID-3和SSR标记RM12339之间54kb的范围内；C为突变基因所在的BAC克隆AP0023263;D为突变体ygl8的候选基因0s01g73450的结构及突变位置。[0013]图5为ygl8突变体的互补表型及RNAi鉴定分析，其中A为野生型WT和互补转基因阳性植株ygl8-C;B为野生型WT和互补转基因阳性植株ygl8-C的总叶绿素含量分析;C为野生型WT和RNAi转基因阳性植株;D为野生型WT和RNAi转基因阳性植株的总叶绿素含量分析;F为YGL8基因在野生型WT和RNAi转基因阳性植株中的表达分析。[0014]图6为YGL8基因与野生型基因的序列比对图，YGL8基因CDNA在第671位发生了C-T的转变。[0015]图7为YGL8基因编码蛋白与野生型基因编码蛋白的序列比对图，YGL8基因编码蛋白在第224位发生了A-V的变异。具体实施方式[0016]下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南第三版，J.萨姆布鲁克等著）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。[0017]本发明实施例中使用的材料:野生型水稻材料缙恢10号WT和水稻黄绿叶突变体ygl8均由西南大学水稻研究所培育;M-MLV逆转录酶、高保真DNA聚合酶PFU、TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶、pMDl9-T载体、Trizo1试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、λ-HindIIIDNAMarker及DL5000DNAMarker购自TaKaRa公司；DNAMarkerIII购自天根生化科技（北京）有限公司；氨节青霉素（Ampici11in，Amp和卡拉霉素Kanamycin，Kan为Sigma公司产品；引物合成和DNA测序由上海英俊生物技术有限公司完成;其它化学试剂购自北京鼎国生物技术有限责任公司；大肠杆菌DH5a、农杆菌LBA4404由本实验室保存。[0018]实施例1、水稻黄绿叶突变体ygl8的获得和形态学观察[0019]在西南大学水稻研究所水稻EMS突变体库中发现了一个全生育期表现为黄绿叶突变体，根据表型特征命名为ygl8图1。该性状经过多代观察，表现稳定遗传，透射电镜观察苗期野生型缙恢10号和ygl8突变体叶片细胞超微结构，突变体细胞结构完整，叶绿体基粒片层结构受到破坏（图2;主要农艺性状如穗长和每穗粒数显著减少，然而千粒重没有显著差异（图3。[0020]实施例2、突变ygl8基因遗传分析与定位[0021]以表型正常的不育系西农IAXinonglA与ygl8突变体杂交，所有F1植株均表型正常。F2群体出现明显的双亲性状分离现象，在9473株群体中正常单株7095株、黄绿叶突变单株2378株，经卡平方测验，符合3:1分离比，表明该突变性状受一对隐性基因控制。[0022]初步定位:选取均匀分布于水稻12条染色体上的400对SSR标记扩增亲本和基因池DNA，结果发现位于第1染色体的标记RM614URM12233和RM6321可能与YGL8连锁。进一步用连锁标记RM614URM12233和RM6321分析F2代群体452个隐性突变单株，初步将该基因定位于第1染色体长臂端与标记RM6141与RM6321之间，遗传距离分别为0.43cM和1.7cM图4中A〇[0023]精细定位:根据已公布的籼稻品种93-11序列，在标记RM6141与RM6321之间进一步筛选和开发了14对InDe1标记和40对SSR标记，其中ID-3，ID-8，ID-13，RMl2239和RM6489在亲本间表现出多态性表1。用这5对引物进一步分析所有FJt性突变单株，最终将YGL8定位在Indel标记ID-3和SSR标记RM12339之间，物理距离为54kb的范围内（图4中B，此区间在BAC克隆AP003263上（图4中C。[0024]表1、具有多态性的InDel标记序列「00251[0026]在MC克隆0SAP003263上位于标记ID-3和SSR标记RM12239之间的共有11个开放阅读框http:www.gramene.org，通过候选基因预测、同源搜索及基因序列对比分析，发现该区间内包含一个尿苷酸激酶UMPkinase基因（Loc_0s01g73450，可能为目标基因。该基因由7个外显子和6个内含子组成，CDS编码框全长为1056bp，其核苷酸序列如SEQIDNo.11所示，共编码351个氨基酸，氨基酸序列如SEQIDNo.12所示（图4D。[0027]实施例3、克隆0s01g73450基因[0028]根据GenBank已登录的水稻日本晴基因0s01g73450序列，利用VectorNTI软件设计扩增野生型缙恢10号和ygl8突变体0s01g73450序列的mRNA特异引物:上游引物YGL8-F:5’-gtcctcatcgtcatcatctcgt-3’SEQID1^〇.13;下游弓|物¥61^8-1?:5’-agcaataggcaatgcagctac-3’（SEQID1'1〇.14。分别取野生型纟晋恢10号和突变体}^18在光照培养两周的幼叶2g，迅速放入液氮中研磨成粉末，按照Trizol试剂盒说明书提取总RNA。所得野生型缙恢10号和突变体ygl8总RNA的电泳结果显示主带清晰完整，28S和18S的条带亮度比约为2:1，说明RNA的浓度和纯度符合实验要求，可以用于合成双链cDNA。然后分别以所得野生型缙恢10号和突变体ygl8总RNA为模板，按照M-MLV逆转录酶说明书，使用01igodT引物进行逆转录获得cDNA;再以cDNA为模板，以SEQIDNo.13和SEQIDNo.14所示序列为特异引物及高保真DNA聚合酶PFU进行PCR扩增，PCR反应条件为:94°C预变性5分钟；然后94°C变性30秒，55°C复性30秒，72°C延伸1分钟，共35个循环;最后72°C延伸10分钟。将RT-PCR产物进行1.0%gmL琼脂糖凝胶电泳检测。结果显示，野生型缙恢10号和突变体ygl8扩增产物均在约IOOObp处呈单一特异性条带，并将野生型缙恢10号扩增产物命名为YGL8基因，突变体yg18扩增产物命名为YGL8突变基因YGL8’）。[0029]然后按照DNA凝胶回收试剂盒说明书进行切胶回收纯化，纯化的YGL8基因和YGL8突变基因与PTCK303载体在T4DNA连接酶的作用下于16°C连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，PCR鉴定后测序，分别得重组载体PTCK303-YGL8和PTCK303-YGL8’。将重组载体PTCK303-YGL8和PTCK303-YGL8’送测序公司进行测序，结果显示YGL8突变基因序列如SEQIDNo.11所示，与野生型缙恢10号相比，YGL8基因在编码框第671位碱基由C转换为T图5，导致第224位的编码氨基酸由丙氨酸Ala变异为缬氨酸Val图6，突变后氨基酸序列如SEQIDNo.12所示，YGL8基因序列与日本晴基因0s01g73450序列一致。[0030]实施例4、突变基因YGL8的功能验证[0031]为了验证水稻突变体ygl8的黄绿叶性状是由突变基因YGL8引起，利用表2中所示引物和酶切位点，分别构建互补载体和RNAi载体。构建互补载体并转化水稻黄绿叶突变体ygl8,性状分析发现转基因阳性植株叶片恢复正常绿色，叶绿素含量分析显示转基因阳性植株叶片总叶绿素含量恢复正常水平（图7A-B。构建RNAi载体并转化缙恢10号，经鉴定转基因阳性植株叶片变为黄绿色，叶绿素含量分析显示转基因阳性植株叶片总叶绿素含量极显著降低（图7C-D。然后利用表3中的引物SEQIDNo.21和SEQIDNo.22对野生型和RNAi转基因阳性植株ygl8中YGL8基因进行荧光定量分析，同时以Actin为内参反应体系为:在25yL的反应体系中加入2yL的cDNA模板，2yL引物，12.5yLSYBRGreen荧光染料和8.5yLRNase-freeH2O，在Bio-rad荧光定量PCR仪上进行荧光定量扩增;扩增条件为:95°C预变性30秒;95°C变性5秒，60°C30秒，40个循环;并加溶解曲线65°C5秒，95°C0.5°C，然后利用CFX-Manager软件进行数据的收集与处理。结果发现RNAi转基因阳性植株中YGL8突变基因表达量明显下调（图7E。因此，确定突变体黄绿叶性状是由YGL8基因突变引起的。[0032]表2、用于构建互补载体和RNAi载体引物和酶切位点[0033][0034]表3、用于qRT-PCR的引物序列[0035][0036]实施例6、水稻黄绿叶突变基因YGL8的生物信息学分析[0037]将YGL8基因序列利用NCBI中的ORFFinderhttp:www.ncbi.nlm.nih.govgorfgorf.html进行开放阅读框识别。结果显示，YGL8基因由一个完整且连续的开放阅读框组成。[0038]用ClustX软件对YGL8基因编码蛋白序列进行同源序列比对，表明YGL8基因编码蛋白属于一个高度保守的蛋白家族，并且由YGL8基因突变导致的氨基酸突变位点就在该高度保守区域附近。[0039]将YGL8基因编码蛋白序列利用MEGA软件进行系统进化树分析，表明YGL8基因与含有UMPK结构域的真核生物和原核生物都具体高度的同源性，进一步说明YGL8基因编码蛋白属于一个高度保守的蛋白家族。[0040]利用综合性状优良，且受隐性核基因控制的叶色突变体，通过杂交、回交等手段将叶色突变基因导入三系或两系的不育系中，可有效提高亲本繁育过程中的除杂保纯效率；也可快速准确鉴定种子生产过程中因育性波动可能出现的种子纯度问题。所以本发明公开的YGL8突变基因为水稻的分子育种提供了重要的基因资源。基于YGL8突变基因构建植物表达载体并转化优质背景的水稻不育系，再将转化的水稻细胞培育成黄绿叶不育系，即可通过转基因快速实现黄绿叶不育系。苗期黄绿叶标记性状在苗期即可通过观察标记性状的存在或消失与否来识别真假杂种，因此在三系和两系杂交水稻亲本繁殖、杂交制种、杂交种子纯度鉴定等方面得到充分利用。该项技术具有快速、简单、准确、低成本的特点，明显优于一般的异地种植鉴定和DNA分子标记鉴定技术。[0041]最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

权利要求：1.水稻黄绿叶突变基因rGLS，其特征在于:核苷酸序列如SEQIDNo.11所示。2.权利要求1所述水稻黄绿叶突变基因FGLS编码的蛋白质，其特征在于:氨基酸序列如SEQIDNo.12所示。3.权利要求1所述水稻黄绿叶突变基因FGLS在水稻黄绿叶性状的分子育种中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于:所述水稻品种为缙恢10号。

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