申请/专利权人：河南农业大学

申请日：2017-12-28

公开（公告）日：2020-12-04

公开（公告）号：CN107868847B

主分类号：C12Q1/6895(20180101)

分类号：C12Q1/6895(20180101);C12N15/11(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.12.04#授权;2018.05.01#实质审查的生效;2018.04.03#公开

摘要：本发明涉及甜瓜基因工程技术领域的分子标记，具体涉及一对用于定位甜瓜黄绿叶色基因ygl的、与甜瓜黄绿叶色基因ygl紧密连锁的分子标记。利用分子标记Indel24定位黄绿叶色基因ygl时，可PCR扩增获得191bp的紧密连锁的特征条带；利用分子标记Indel43定位黄绿叶色基因ygl时，可PCR扩增获得200bp的紧密连锁的特征条带。黄绿叶色基因ygl位于两个分子标记之间，物理距离仅26Kb左右。利用这一结果，进而可获得这两分子标记之间的物理图谱，从而为最终ygl基因的克隆、分子标记辅助育种体系的建立奠定基础，同时也为甜瓜叶绿体发育及叶绿素合成调控网络的研究奠定基础。

主权项：1.与甜瓜黄绿叶色基因ygl紧密连锁的分子标记，包括分子标记Indel24和分子标记Indel43，其特征在于；所述分子标记Indel24，由一对PCR扩增用的上游引物Indel24-F和下游引物Indel24-R组成，具体而言：Indel24-F:5’-CCTATTCTCCCCCACTTTGC-3’，Indel24-R:5’-CCCAACCTCTCAAACAGCTC-3’；利用分子标记Indel24定位黄绿叶色基因ygl时，可PCR扩增获得191bp的紧密连锁的特征条带，所述191bp紧密连锁的特征条带的具体碱基序列如SEQIDNO.1所示；利用分子标记Indel24定位正常叶色基因YGL时，可PCR扩增获得206bp的紧密连锁的特征条带，所述206bp紧密连锁的特征条带的具体碱基序列如SEQIDNO.2所示；所述分子标记Indel43，由一对PCR扩增用的上游引物Indel43-F和下游引物Indel43-R组成，具体而言：Indel43-F:5’-GCCCTACCAATTGTAAATCA-3’，Indel43-R:5’-GAAATTAGGCGTATTGAAATTCT-3’；利用分子标记Indel43定位黄绿叶色基因ygl时，可PCR扩增获得200bp的紧密连锁的特征条带，所述200bp紧密连锁的特征条带的具体碱基序列如SEQIDNO.3所示；利用分子标记Indel43定位正常叶色基因YGL时，可PCR扩增获得196bp的紧密连锁的特征条带，所述196bp紧密连锁的特征条带的具体碱基序列如SEQIDNO.4所示。

全文数据：与甜瓜黄绿叶色基因ygI紧密连锁的分子标记技术领域[0001]本发明涉及甜瓜基因工程技术领域的分子标记，具体涉及一对用于定位甜瓜黄绿叶色基因的、与甜瓜黄绿叶色基因紧密连锁的分子标记。背景技术[0002]叶色突变的发生，主要是由于突变基因直接或间接干扰叶绿素的合成及降解，进而经由多种途径改变叶片中各种色素的含量和比例，最终引起叶色变异。叶绿素的合成与降解涉及核基因和叶绿体基因协同调控的复杂过程，任何一个相关基因的突变都有可能造成叶绿素合成受阻或叶绿体发育缺陷，进而导致光合作用受阻。高等植物叶绿素的生物合成与叶绿体的发育对其能否进行正常的光合作用起着关键作用，而叶色突变基因影响叶绿素的合成和叶绿体的发育，因此叶色突变体一直是研究光合代谢系统结构、基因功能及其分子调控机制的理想材料。[0003]迄今为止，拟南芥叶绿素生物合成途径中的基因已被克隆。此外水稻、玉米、番茄、烟草、甘蓝型油菜中也有相关基因被克隆。随着越来越多的叶色突变基因被克隆，人们对叶绿素的生物合成及其相关代谢途径的认识也越来越深入。不同的叶色突变体由于各种色素比例不同，有些突变体在强光逆境条件下，不会发生光抑制现象或表现程度较轻，甚至有些突变体会产生更高的光合效率。Coschigano等（Coschiganoetal.ArabidopsisgJsmutantsanddistinctFd-GOGATgenes.Implicationsforphotorespirationandprimarynitrogenassimilation，PlantCell，1998，105:741-752从拟南芥叶色突变体中分离出GLW基因，并证实其编码产物与光呼吸有密切关系，这一发现为抑制作物的光呼吸，提高光合效率进行高光效育种奠定了理论基础。随后Jordi等（Jordietal.IncreasedcytokininlevelsintransgenicPSAG12—IPTtobaccoplantshavelargedirectandindirecteffectsonleafsenescence,photosynthesisandNpartitioning，PlantCellEnvironment，2000,233:279-289利用转基因技术获得了一个烟草常绿突变体，该突变体衰老明显延迟，生物量增加40%、种子产量增加52%，是利用叶色突变体进行高光效育种的成功范例。Wu等Wuetal.Achlorophyll-deficientricemutantwithimpairedchlorophyIIideesterificationinchlorophyllbiosynthesis，PlantPhysiology，2007，145I:29-40在水稻上利用黄绿叶色突变体成功克隆了叶绿素合酶基因TOLh为改良水稻光能利用率，培育高光效的品种提供了理论依据。黄俊丽等2010黄俊丽等，水稻高叶绿素含量基因DETlcDNA的克隆、生物信息学分析及超表达载体的构建，中国生物工程杂志，2010,30⑷：60-64以水稻高叶绿素含量突变体为材料，克隆了高叶绿素含量基因为水稻高光效、超高产育种奠定了研究基础。这些研究为利用叶色突变体进行植物高光效育种及抗逆育种提供了崭新的思路。因此，叶色突变体还是研究植物高光效育种和抗逆育种的理想材料。[0004]此外，叶色突变还可作为表型标记性状在良种繁育和杂交育种中有效地提高种子纯度鉴定效率。该方法具有鉴定程序简单、操作方便、结果直观可信的优点，同时也克服了田间种植鉴定周期较长的不足，在苗期就可以明显表达，易于鉴别。水稻已利用叶色突变体育成了一批具有较高应用价值的不育系，并选配出了一批杂交组合，如光亚2号、全优36、越优1号、农华优2号、池优6162等，在苗期便可根据植株的叶色表型剔除受外源污染的种子，极大地提高了制种田里不育系的纯度欧立军，水稻叶色突变体的光合生理特点及遗传规律分析，2008,湖南师范大学博士学位论文）。[0005]在甜瓜上，1952年Whitaker首次报道甜瓜黄转绿突变体，之后有多种类型的甜瓜叶色突变体先后被报道，主要的有V但是这些报道仅局限于甜瓜叶色突变体的发生、分类、遗传规律等方面，没有从分子水平对叶色突变体进行深入探索。邵勤等叶色黄化突变体甜瓜叶片内部生理生化变化的研究，中国蔬菜，2013;叶色黄化突变体甜瓜叶片蛋白质组差异分析，中国果树，2013;薄皮甜瓜叶色黄化突变体的农艺性状调查及红外光谱分析，东北农业大学学报，2013对薄皮甜瓜黄绿叶色突变体的主要农艺性状、光合特性、叶绿体超微结构、叶绿素生物合成特征、遗传特性等方面进行研究，获得了黄绿叶色突变体与突变亲本之间的差异表达蛋白，并利用SSR标记初步将基因定位在5.9cM内。但这一研究工作仍未实现对叶色控制基因的克隆，更未揭示甜瓜叶色发生变化的分子机理。[0006]总之，找到与甜瓜黄绿叶色基因紧密连锁的分子标记，可为下一步图位克隆该基因打下坚实的基础;而对甜瓜黄绿叶色基因的研究将有助于揭示甜瓜叶色形成的分子机制，为甜瓜高光效生理研究及高光效品种选育提供重要的理论依据和应用指导。发明内容[0007]本发明的目的是提供一对用于定位甜瓜黄绿叶色基因的、与甜瓜黄绿叶色基因紧密连锁的分子标记，从而为研究甜瓜叶绿体和叶绿素形成的分子机制、为甜瓜高光效育种及品质选育提供理论依据和应用指导。[0008]本申请所采取的技术方案详述如下。[0009]与甜瓜黄绿叶色基因yg·]紧密连锁的分子标记，包括分子标记Indel24和分子标记Indel43；甜瓜正常叶色绿色）中，含有正常叶色基因FGL，为显性控制;甜瓜黄绿叶色中，为黄绿叶色基因，为隐性控制；所述分子标记111^124，由一对？0时广增用的上游引物（111^124-!〇和下游引物Indel24-R组成，具体而言：Indel24-F:5’-CCTATTCTCCCCCACTTTGC-3’，Indel24-R:5’-CCCAACCTCTCAAACAGCTC-3’；利用分子标记Indel24用于定位黄绿叶色基因时，可PCR扩增获得191bp的紧密连锁的特征条带，所述191bp紧密连锁的特征条带的具体碱基序列如SEQIDNO.1所示；利用分子标记Indel24用于定位正常叶色基因FGL时，可PCR扩增获得206bp的紧密连锁的特征条带，所述206bp紧密连锁的特征条带的具体碱基序列如SEQIDNO.2所示；所述分子标记Indel43,由一对PCR扩增用的上游引物（Indel43-!〇和下游引物Indel43-R组成，具体而目：Indel43-F:5’-GCCCTACCAATTGTAAATCA-3’，Indel43-R:5’-GAAATTAGGCGTATTGAAATTCT-3’；利用分子标记Indel43用于定位黄绿叶色基因时，可PCR扩增获得200bp的紧密连锁的特征条带，所述200bp紧密连锁的特征条带的具体碱基序列如SEQIDNO.3所示；利用分子标记Indel43用于定位正常叶色基因FGL时，可PCR扩增获得196bp的紧密连锁的特征条带，所述196bp紧密连锁的特征条带的具体碱基序列如SEQIDNO.4所示。[0010]所述与甜瓜黄绿叶色基因紧密连锁的分子标记在分子育种的应用，用于识别、定位甜瓜黄绿叶色基因和或正常叶色基因FGL。[0011]本申请首次对甜瓜黄绿叶色性状相关基因进行了详细研究，利用分子标记和染色体步移法等相关研究方法，最终确定了两对与甜瓜黄绿叶色基因紧密连锁的分子标记。定位结果表明，黄绿叶色基因位于两个分子标记（Indel24、Indel43之间，物理距离仅26Kb左右。利用这一结果，进而可获得这两分子标记之间的物理图谱，从而为最终基因的克隆、分子标记辅助育种体系的建立奠定基础，同时也有助于最终甜瓜叶绿体发育及叶绿素合成调控网络的研究奠定基础。总之，由于分子标记对于最终功能基因定位具有十分重要意义，加上分子标记在分子标记育种体系建立中具有简便、快速、高通量的优势，因而使得本申请具有十分重要的应用价值，对于甜瓜新品种培育也具有十分重要的保护意义。附图说明[0012]图1为利用分子Indel24进行PCR扩增时的电泳图。1代表黄绿叶色材料NSL73046,2代表正常叶色材料DHL92;图2为利用分子Indel43进行PCR扩增时的电泳图。1代表黄绿叶色材料NSL73046,2代表正常叶色材料DHL92;图3为对甜瓜黄绿叶色基因yd的精细定位过程示意图，其中yd代表黄绿叶色基因。具体实施方式[0013]下面结合申请做进一步的解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中生物材料、实验试剂及相关实验背景情况简要介绍如下。[0014]生物材料：甜瓜黄绿叶色材料NSL73046母本），由美国农业部USDA种质资源中心提供，其整个植株在整个生长期都表现为黄绿色且能够稳定遗传；甜瓜DHL92材料由西班牙IRTA农业基因组研究中心CRAG的JordiGarcia-Mas博士提供，该材料叶色是正常的绿色，同时该材料也是甜瓜全基因组测序所采用的双单倍体材料；实验过程中，甜瓜材料种植于河南农业大学毛庄科教园区日光温室内，种植过程中，催芽后进行穴盘育苗，采用正常的甜瓜栽培管理方式，在三叶一心期对相关表型性状进行调查统计；PCR扩增用引物及基因测序工作，由北京诺赛基因组研究中心有限公司提供完成；实验试剂：PCR扩增用PCRMagicMix3.0,购于北京天恩泽基因科技有限公司；电泳与银染相关试剂如丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、AgN03、Na0H和甲醛等试剂，购自北京索莱宝科技有限公司；实验设备：PCR仪，珠海黑马医学仪器有限公司Hema9600型基因扩增仪；JY300HC通用型电泳仪，由北京君意东方电泳设备有限公司生产；HT-SCZ04A高通量垂直电泳槽，由北京鸿涛基业科技发展有限责任公司生产。实施例[0015]本实施例主要介绍一下对甜瓜基因的精细定位过程，包括遗传分离群体的构建、初步定位、精细定位等过程（分析流程如图3所示），在此过程中涉及最终分子标记Indel24、Indel43的开发、设计及检验过程，相关实验过程简要介绍如下。[0016]—、遗传分离群体的构建以甜瓜叶色黄绿材料NSL73046作为母本，以甜瓜正常材料DHL92作为父本需要解释的是，实验期间，从材料易得性及操作方便考虑，发明人以DHL92作为父本，在采用其他纯合正常叶色材料时，同样可以进行相关实验），利用这两个亲本配置了杂交组合，结果表明，获得的朽代植株叶色正常。[0017]WF1代植株中选择10个单株，自交获得F2代种子，用于遗传分析与基因定位。对这些内代个体的叶片颜色表型进行鉴定，并用卡方测验进行验证。[0018]结果表明：初步定位时，随机选取142株F2群体，其中黄绿叶色表型35株，绿色叶色表型107株，，符合3:1的分离比。[0019]精细定位时，最初群体为1577株F2群体，其中黄绿叶色表型361株，绿色叶色表型1216株，，同样符合3:1的分离比。[0020]综合分析可知，甜瓜黄绿叶色性状是由1对隐性核基因控制的，将该基因命名为，绿色叶色FGL对黄绿叶色ygi为完全显性。[0021]二、基因的初步定位采用BSA法进行初步定位，具体实验过程为：1首先，制备基因池，具体为：在上述步骤一的F2群体中随机选取10个正常叶色单株与10个黄绿叶色单株，在三叶一心期从每个单株上面采集未展开的幼嫩叶片，采用CTAB法提取其基因组DNA，并分别混合制成正常叶色基因池和黄绿叶色基因池（正常叶色与正常叶色混合，黄绿叶色与黄绿叶色混合。[0022]2多态性筛选分析，具体为：利用发明人前期从甜瓜全基因组开发的384对SSR引物（具体引物序列发表在Zhuetal.Developmentofgenome-wideSSRmarkersinmelonwiththeircross-speciestransferabilityanalysisandutilizationingeneticdiversitystudyMolBreeding，2016，36:153-166.OnlineResource9，对步骤（I中所制备的两个基因池进行多态性筛选，将在两个基因池中获得的不同带型的标记称为多态性标记。[0023]进一步，将筛选出的多态性SSR标记对142株F2群体步骤一中初步定位时所选择）进行基因型分析，将所获得的与黄绿叶色亲本相同带型的记作1，获得与正常叶色亲本相同带型的记作2,获得杂合带型的记作3。[0024]多态性筛选分析过程中，PCR扩增时，IOyL扩增体系设计如下：基因池样品（基因组DNA，30ngyL，lyL约30ng;F、R引物，各0.5yL引物浓度均为5μπιο1LPCRMagicMix,5.0yL；ddH2〇，3.0yL;PCR扩增程序为：94°C、5min;94°C、30s，55°C、30s，72°C、30s，35个循环；72°C5min。[0025]需要解释的是，上述PCR扩增体系中的F、R引物分别代表一对引物中的前引物和后引物;384对SSR引物，由于这些引物与本申请欲保护主题并不直接关联，文本简明起见，不再详细说明。[0026]对PCR扩增产物进行8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。电泳检测时，聚丙烯酰胺凝胶电泳缓冲液为0.6XTBE，200V恒压电泳l~1.5h。电泳结束后进行银染，以便观察和检测，银染方法为：A、将带胶的玻璃板放入固定液中，在摇床上轻轻摇动直至指示剂退去颜色，其中固定液的组成为，冰醋酸:无水乙醇:蒸馏水的体积比为0.5:10:100;B、用超纯水洗1〜3min;C、将冲洗后的胶板放入染色液中摇动10min，染色液为0.2%硝酸银水溶液；D、将染色后的胶板放入超纯水中漂洗30s，放入装有显影液的塑料盒中，轻轻摇动直至条带清晰呈现，显影液是在IL蒸馏水中加入15gNaOH和3mL甲醛混匀得到的；E、最后放入自来水反复漂洗几次；F、室温下干燥，然后拍照。[0027]3基因初步定位，具体为：结合初步定位群体表型调查数据和步骤（2中最终SSR标记的分型结果，利用JoinMap3.0软件，对甜瓜叶色控制性状基因进行初步定位，结果获得2个与基因紧密连锁的SSR分子标记:CmSSR25141和CmSSR25190相关编码为研究过程中发明人自行编码，并不具有特殊含义），这两个分子标记位于黄绿基因的两端，分别与基因相距〇.SOcM和0.OlcM如图3所示）。[0028]三、基因的精细定位在步骤二初步定位基础上，发明人进一步对与叶色控制性状基因基因进行了精细定位，具体过程简要介绍如下。[0029]1作图群体的扩大：在初步定位的基础上，我们将进一步将？2作图群体增加到1577株，然后选用CmSSR25311、CmSSR25141和CmSSR25190三个标记进行基因型分析，目的基因确定是定位在CmSSR25190和CmSSR25141之间，遗传距离分别与瓜]基因相距0.42cM和0.60cM。[0030]2亲本重测序和基因组比对利用IlluminaHi-Seq2000高通量测序平台对两亲本材料进行重测序，控制测序深度〉20倍；以已公布的甜瓜全基因组序列（https:melonomics.netgenome在SSR标记CmSSR25141和CmSSR25190之间的区段作为参考序列，利用网上公开的免费软件包BWAhttp:bio_bwa.sourceforge.net分别将两个亲本的重测序序列和候选区段进行比对，找到两个亲本在候选区段的差异位点。[0031]3精细定位我们比较两亲本基因组在初步定位的候选区段内的序列差异，选择序列差异较大如3个碱基以上的插入或者缺失位点，然后利用在线软件Primer3http:bioinfo.ut.eeprimer3_0·4·0primer3先后设计合成了43对Indel标记，命名为Indel1-Indel43。[0032]将这些Indel标记在亲本间进行了多态性筛选，同时将原1577株的作图群体进一步扩大到1994株，利用CmSSR25190和CmSSR25141标记对该群体进行筛选，寻找CmSSR25190和CmSSR25141标记基因型通过分析显隐亲本获得与性状表现型黄绿叶色正常叶色不一致的单株，即标记与i基因的重组单株。然后将筛选到的多态性的Inde1标记对CmSSR25190和CmSSR25141与yd的重组单株进行了基因型分析，最终将yd基因定位在Indel24和Indel43之间，这两个分子标记分别与对应表型之间有2个重组单株（如图3所示），而这两个Indel标记之间相距为26kb。[0033]其中分子标记Indel24,由一对PCR扩增用的上游引物（Indel24-F和下游引物Indel24-R组成，具体而言：Indel24-F:5’-CCTATTCTCCCCCACTTTGC-3’，Indel24-R:5’-CCCAACCTCTCAAACAGCTC-3’；分子标记Indel43,由一对PCR扩增用的上游引物（Indel43-F:和下游引物（Indel43-R:组成，具体而言：Indel43-F:5’-GCCCTACCAATTGTAAATCA-3’，Indel43-R:5’-GAAATTAGGCGTATTGAAATTCT-3’。[0034]基于这一结果，以F2R随机群体的甜瓜叶片为样品，提取基因组作为模板，分别利用分子标记Indel24和Indel43进行PCR扩增，IOyL扩增体系设计如下：基因组DNA，30ngAxL、lyL;F、R引物，各0.5yL引物浓度均为5μπιο1LPCRMagicMix,5.OyL；ddH2〇，3.0yL;PCR扩增程序为：94°C、5min;94°C、30s，55°C、30s，72°C、30s，35个循环；72°C5min;对扩增产物进行电泳检测，结果如图I、2所示。[0035]对扩增产物进一步进行分析、测序可知：利用分子标记Inde124定位黄绿叶色基因时，PCR扩增获得191bp的紧密连锁的特征条带，所述191bp紧密连锁的特征条带的具体碱基序列如SEQIDNO.1所示；利用分子标记Inde124定位正常叶色基因FGL时，PCR扩增获得206bp的紧密连锁的特征条带，所述206bp紧密连锁的特征条带的具体碱基序列如SEQIDNO.2所示；利用分子标记Indel43定位黄绿叶色基因时，PCR扩增获得200bp的紧密连锁的特征条带，所述200bp紧密连锁的特征条带的具体碱基序列如SEQIDNO.3所示；利用分子标记Indel43定位正常叶色基因FGL时，PCR扩增获得196bp的紧密连锁的特征条带，所述196bp紧密连锁的特征条带的具体碱基序列如SEQIDNO.4所示。

权利要求：1.与甜瓜黄绿叶色基因紧密连锁的分子标记，包括分子标记Indel24和分子标记Indel43，其特征在于；所述分子标记Indel24,由一对PCR扩增用的上游引物Indel24-F和下游引物Indel24-R组成，具体而言：Indel24-F:5’-CCTATTCTCCCCCACTTTGC-3’，Indel24-R:5’-CCCAACCTCTCAAACAGCTC-3’；利用分子标记Inde124定位黄绿叶色基因时，可PCR扩增获得191bp的紧密连锁的特征条带，所述191bp紧密连锁的特征条带的具体碱基序列如SEQIDNO.1所示；利用分子标记Indel24定位正常叶色基因FGL时，可PCR扩增获得206bp的紧密连锁的特征条带，所述206bp紧密连锁的特征条带的具体碱基序列如SEQIDNO.2所示；所述分子标记Indel43,由一对PCR扩增用的上游引物Indel43-F和下游引物Indel43-R组成，具体而言：Indel43-F:5’-GCCCTACCAATTGTAAATCA-3’，Indel43-R:5’-GAAATTAGGCGTATTGAAATTCT-3’；利用分子标记Indel43定位黄绿叶色基因时，可PCR扩增获得200bp的紧密连锁的特征条带，所述200bp紧密连锁的特征条带的具体碱基序列如SEQIDNO.3所示；利用分子标记Indel43定位正常叶色基因FGL时，可PCR扩增获得196bp的紧密连锁的特征条带，所述196bp紧密连锁的特征条带的具体碱基序列如SEQIDNO.4所示。2.如权利要求1所述与甜瓜黄绿叶色基因yg·]紧密连锁的分子标记，其特征在于，PCR扩增时，IOyL扩增体系设计如下：基因组模板DNA，30ngyL、IyL;上游引物、下游引物，各〇.5yL、引物浓度均为5ymolL;PCRMagicMix,5.OyL；ddH2〇,3·OyL;PCR扩增程序为：94°C、5min;94°C、30s，55°C、30s，72°C、30s，35个循环；72°C5min。3.权利要I所述与甜瓜黄绿叶色基因yg·]紧密连锁的分子标记在分子育种的应用，其特征在于，用于识别、定位甜瓜黄绿叶色基因yg·]和或正常叶色基因FGL。

百度查询： 河南农业大学 与甜瓜黄绿叶色基因ygl紧密连锁的分子标记

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