申请/专利权人：中国医科大学

申请日：2016-12-08

公开（公告）日：2017-03-15

公开（公告）号：CN106492191A

主分类号：A61K38/17(2006.01)I

分类号：A61K38/17(2006.01)I;A61P35/00(2006.01)I

优先权：

专利状态码：失效-发明专利申请公布后的驳回

法律状态：2021.01.08#发明专利申请公布后的驳回;2017.04.12#实质审查的生效;2017.03.15#公开

摘要：本发明属于生物技术领域，主要涉及WWC3蛋白分子抑制Wnt和激活Hippo信号通路的分子机制，以及利用这一机制的原理在制备抗肿瘤药物的应用中寻求保护。WWC3蛋白分子为含有WW结构域和C2结构域的型蛋白；WWC3通过WW结构域和Dvl2的PY基序相互作用，也可通过ADDV结构域与Dvl2的PDZ结构域相互作用，阻碍了CK1δε激酶对DVLs的磷酸化，促进Wnt通路效应蛋白分子β‑catenin的降解，减少β‑catenin入核，发挥抑制Wnt通路活性的作用。WWC3通过其自身的WW结构域与Hippo通路中央激酶LATS1相互作用，促进LATS1磷酸化，进而使Hippo效应蛋白YAP滞留于胞浆，发挥促进Hippo通路活性的作用。LATS1与WWC3的结合同Dvl2存在着竞争性。

主权项：WWC3蛋白分子在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述WWC3蛋白分子为含有WW结构域和C2结构域的型蛋白；所述WWC3通过DVLs抑制Wnt活性和通过LATS1激活Hippo通路活性。

全文数据：WWC3蛋白分子在制备抗肿瘤药物中的应用技术领域[0001]本发明属于生物技术领域，主要涉及WWC3蛋白分子的作用机制及利用这一机制在制备抗肿瘤药物方面的应用。背景技术[0002]Wnt信号通路与Hippo信号通路均参与生物胚胎发育，组织器官形成，细胞的增殖、分化与凋亡等重要生理过程，Wnt通路的异常激活和Hippo通路的失活与肿瘤的发生和发展有着密切的联系，揭示他们的内在联系将为制备抗肿瘤药物提供重要的理论和实验基础。[0003]肿瘤细胞中常常存在着异常的Wnt通路活性。Wnt通路的核心因子是β-连环蛋白β-catenin，当经典Wnt通路信号激活时，01δε活化，活化的〇1δε磷酸化Dishevelled①vis，最终导致胞衆内β-catenin不被泛素化而蓄积、入核后的β-catenin与Tcf-4结合并激活Wnt通路的靶基因c-myC，CyclinDl，MMP7等转录活性，促进肿瘤细胞的增殖和侵袭。当β-catenin被蛋白酶体降解或不能入核时，则Wnt通路活性被中断。[0004]Hippo通路与肿瘤细胞的增殖、侵袭与转移的关系备受重视。该通路的分子组成包括:上游分子Fat，NF2，WWC1，ΑΜ0Τ蛋白等）、中央激酶复合体MST12-WW45-LATS12-M0B和下游效应分子YAP蛋白）等。当Hippo通路被激活时则抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭，而当Hippo通路活性被抑制时，去磷酸化的YAP入核后则与TEAD共辅助激活因子结合，启动其靶基因（CTGF和CyclinE等的转录活性，促进肿瘤细胞的增殖和侵袭。[0005]因此，发现既能抑制Wnt信号通路活性又能激活Hippo通路活性的因子，并揭示其作用的分子机制，将会为制备抗肿瘤的药物或靶向药物提供理想的作用靶点和重要的理论基础。[0006]WWC3是人类WffCs蛋白家族WWC1，WWC2，WWC3之一，WffCs均含有:近N端双"WW"结构域能与PPxY基序相互作用，参与Hippo通路的激活），中央部分为与膜相关的C2结构域，近C端为aPKC结合位点（参与细胞极性的调节），C端为ADDV结构域PDZbindingmotif。目前，有关WffCs家族在人类肿瘤中的作用仅限于WWC1参与Hippo通路的研究上。而WWC2和WWC3与人类肿瘤的关系及对Wnt信号通路活性是否有影响等未见报道。发明内容[0007]发明目的：本发明的目的在于提供了WWC3蛋白分子在抑制Wnt信号通路的同时激活Hippo信号通路的作用和分子机制，以及证明存在这些机制的方法，为利用这些机制制备抗肿瘤靶向）药物提供依据。[0008]技术方案：WWC3蛋白分子在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于:所述WWC3蛋白分子为含有WW结构域和C2结构域的ΠΙ型蛋白；所述WWC3通过DVLs抑制Wnt活性和通过LATS1激活Hippo通路活性。[0009]所述的WWC3蛋白分子在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于:所述WWC3蛋白分子通过其自身的WW结构域和ADDV结构域与Wnt通路中重要的上游蛋白分子DVLs相互作用，该相互作用阻碍了〇1δε激酶对DVLs的磷酸化，促进Wnt通路效应蛋白分子β-catenin的降解，减少β-catenin入核，发挥抑制Wnt通路活性的作用。[0010]所述的WWC3蛋白分子在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：利用WWC3的突变体和Dvl2剪接体，采用免疫共沉淀的方法证明了WWC3通过WW结构域和Dvl2的PY基序相互作用，也可通过ADDV结构域与Dvl2的ΗΖ结构域相互作用，发挥抑制Wnt通路活性的作用。[0011]所述的WWC3蛋白分子在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述WWC3的突变体包括WWC3-Δffff、ffffC3-ΔADDV、ffffC3-Δffff所述Dvl2剪接体包括Dvl2_ΔPDZ、Dvl2_ΔPY、Dvl2_ΔPDZ&PY。[0012]所述的WWC3蛋白分子在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于:所述WWC3通过其自身的WW结构域与Hippo通路中央激酶LATS1相互作用，促进LATS1磷酸化，进而使Hippo效应蛋白YAP滞留于胞浆，发挥促进Hippo通路活性的作用。[0013]所述的WWC3蛋白分子在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：WWC3与LATS1激酶相互作用并发挥了激活Hippo通路活性的功能，而缺失WW结构域的WWC3则无此功能；增加LATS1的表达，可使WWC3与Dvl2的结合量减少；减少LATS1的表达，则WWC3与Dvl2的结合量增加，即LATS1与WWC3的结合同Dvl2存在着竞争性。[0014]本发明的优点：本发明提供了一种WWC3蛋白分子的应用。本发明立足于分子生物学及细胞功能学试验，设计严谨，真实性强，并且具有一定的创新性，WWC3通过影响Wnt及Hippo通路活性抑制肺癌细胞的增殖，侵袭能力，并在裸鼠模型中得以验证，有较高的转化医学的应用前景，为临床开发靶向治疗药物提供依据。附图说明[0015]图1为过表达醫C3对肺癌细胞集落形成能力的影响的结果对比图（***P〈0.001;图2为敲除醫C3对肺癌细胞集落形成能力的影响的结果对比图***P〈0.001;图3为过表达WWC3对肺癌细胞侵袭能力的影响的结果对比图（**P〈0.01;图4为敲除WWC3对肺癌细胞侵袭能力的影响的结果对比图**P〈0.01;图5为MTT法考察双向调控醫C3的表达对肺癌细胞增殖能力的影响的结果对比图（**P〈0.01；图6为过表达WWC3对裸鼠移植瘤形成能力（移植瘤体积和重量）的影响的结果对比图***P〈0·001，**P〈0·01，n=5;图7为敲除醫C3对裸鼠移植瘤形成能力移植瘤体积和重量的影响的结果对比图（**P0·01，η=5;图8为蛋白免疫印记考察WWC3在六种肺癌细胞系和正常支气管上皮细胞ΗΒΕ中表达的结果对比图；图9为荧光素酶报告基因考察双向调控WWC3对Wnt通路活性影响的结果对比图（**Ρ〈0·01，*Ρ〈0·05;图10为荧光素酶报告基因考察双向调控WWC3对Hippo通路活性影响的结果对比图（**Ρ〈0.01，***Ρ〈0·001;图11为蛋白免疫印记考察双向调控WWC3对Wnt通路与Hippo通路靶基因蛋白水平影响的结果对比图；图12为实时定量PCR考察双向调控WWC3对Wnt与Hippo通路靶基因mRNA水平影响的结果对比图（*Ρ〈〇·〇5;图13为免疫共沉淀考察WWC3与DVL2存在相互作用的蛋白印记图；图14为醫C3野生型质粒和突变型质粒的结构模式图；图15为DVL2野生型质粒和突变型质粒的结构模式图；图16为免疫共沉淀考察WWC3通过其WW结构域和ADDV结构域与DVL2相互作用的免疫印记图；图17为免疫共沉淀考察DVL2通过其PDZ结构域和ΡΥ基序与WWC3相互作用的免疫印记图；图18为免疫共沉淀考察WWC3的WW结构域和ADDV结构域分别与DVL2的ΡΥ基序和ADDV结构域相互作用的免疫印记图；图19为免疫共沉淀考察双向调控醫C3对DVL2磷酸化水平影响的结果对比图；图20为荧光素酶报告基因考察共同敲除WWC3与01δε对Wnt通路活性的影响（#*Ρ〈0.001;图21，22为蛋白免疫印记考察在敲除機^3的基础上，抑制016八活性或敲除〇16八的表达，DVL2磷酸化水平的变化对比图。[0016]图23为免疫共沉淀考察梯度转染WWC3后01δε与DVL2结合量的变化;梯度转染α1δε后WWC3与DVL2结合量的变化对比图。[0017]图24为荧光素酶报告基因考察在Η1299转染WWC3和突变体后Wnt通路活性的变化对比图（**Ρ〈〇·〇1，*Ρ〈〇·〇5;图25为蛋白免疫印记考察在Η1299转染WWC3和突变体后DVL磷酸化水平和Wnt通路靶基因表达的变化对比图图26为蛋白免疫印记考察双向调控WWC3的表达对Hippo通路主要蛋白LATS与YAP磷酸化水平的影响的结果对比图图27为荧光素酶报告基因考察在H1299转染WWC3和突变体后Hippo通路活性的变化对比图（*Ρ〈0·05;图28为免疫共沉淀考察WWC3与LATS1存在相互作用的免疫印记图图29为免疫共沉淀考察过表达DVL2后WWC3与LATS1结合量变化的结果对比图图30为免疫共沉淀考察敲除DVL2后WWC3与LATS1结合量变化的结果对比图图31为免疫共沉淀考察过表达LATS1后醫C3与DVL2结合量变化的结果对比图图32为免疫共沉淀考察敲除LATS1后醫C3与DVL2结合量变化的结果对比图图33为蛋白免疫印记考察在过表达WWC3的基础上，转染DVL2，LATS1和YAP磷酸化水平改变的结果对比图图34为蛋白免疫印记考察在过表达WWC3的基础上，敲除DVL2，LATS1和YAP磷酸化水平改变的结果对比图图35为为蛋白免疫印记考察在过表达WWC3的基础上，转染DVL2及突变体，LATS1和YAP磷酸化水平改变的结果对比图具体实施方式：i.WWC3具有抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭作用并在肺癌细胞中低表达1在体外与体内实验中，WWC3均能抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭为了验证醫C3在体内外的生物学功能的影响，选择醫C3低表达的H1299肺癌细胞系，转染WWC3过表达质粒G418筛选）；在相对高表达WWC3的A549细胞中转染shRNA-WWC3G418筛选），筛选后进行细胞功能学实验。[0018]1-1集落形成实验:将对照组和转染敲除）组细胞接种到6cm2培养皿中（1000个皿），1640培养基培养12天后，用磷酸盐缓冲液清洗两次，冰甲醇固定20min，然后Gimsa染色lOmin，最后计数数目。实验重复三次，取平均值。我们发现过表达WWC3能够显著抑制肺癌细胞的克隆形成能力（图1，敲除WWC3后克隆形成能力增强（图2。[0019]1-2基质胶侵袭实验:在24孔板中以双无的1640培养基按照1:3的比例稀释基质胶BDBiosciences，铺8微米孔径的上室Costar。然后将转染后的A549、H1299以100微升含有5X105个的细胞密度接种在上室并孵育16小时。下室放含有10%小牛血清的培养基。种植后培养48小时后，甲醇固定15分钟，苏木素染色。随机选取10个视野，计数侵袭到小室下的细胞数。实验重复三次，取平均值。我们发现过表达WWC3能够显著抑制肺癌细胞的侵袭能力（图3，敲除WWC3后肺癌细胞侵袭能力增强（图4。[0020]1-3MTT实验：96孔板中用含10%血清的培养基培养约3000个左右的转染后的A549、H1299细胞，每个孔加入20微升的5mgmlMTTThiazolylBlue溶液，在37°C孵育4小时后，去除溶液，用150微升的DMS0溶解生成的MTT结晶，用分光光度计检测490nm波长的吸收峰值进行定量。我们发现过表达WWC3后肺癌细胞增殖能力减弱，敲除WWC3后肺癌细胞增殖能力增强（图5。[0021]1-4裸鼠皮下成瘤实验：上述转染的H1299和A549细胞悬液进行裸鼠（BALBc背部皮下接种对照组和实验组各五只裸鼠），每只裸鼠接种〇.2ml细胞悬液（约含细胞1X1〇7个后无菌条件下饲养，以便观察WWC3对肿瘤细胞体内增殖情况的影响。观察并测量肿瘤大小与小鼠体重每3天测量一次），绘制肿瘤生长曲线和小鼠生存曲线。8周统一处死，取瘤体称取瘤重，观察是否存在转移灶。肿瘤制作石蜡切片。我们发现过表达WWC3组的瘤体质量与体积明显小于空白对照组（图6，敲除WWC3组的瘤体质量与体积明显大于空白对照组图7。[0022]1-5经裸鼠尾静脉体内成瘤实验:上述转染的H1299和A549细胞悬液进行裸鼠尾静脉接种，每只裸鼠接种〇.lml细胞悬液约含细胞1X106个后无菌条件下饲养，以便检测WWC3对肿瘤细胞全身转移情况的影响。观察并测量小鼠体重每3天测量一次），绘制小鼠生存曲线。8周统一处死，取小鼠全身主要脏器心、肝、脾、肺、肾），称重，肉眼观察脏器表面是否存在转移灶，固定脏器制作石蜡切片。应用HE染色法镜下观察脏器中是否存在肿瘤细胞的转移。如存在转移，比较转染组和空白对照组的肿瘤转移面积和数目的多少。我们发现：过表达醫C3组与空白对照组相比，（肺肿瘤转移数目和面积显著减少;敲除醫C3组，肺转移数目和大小显著增加。[0023]⑵WWC3在肺癌组织癌细胞系）中为低表达用预冷的RIPA裂解液RIPA:PMSF=100:1对6种肺癌细胞系A549、H1299、H460、H292、LK2、Calul及正常支气管上皮细胞ΜΕ的进行裂解，冰上超声3次，放置10分钟，4°C，12000rpm离心15分钟，取上清，用BCA试剂盒测定总蛋白含量，以BSA为标准品。通过8%浓度的SDS-PAGE进行蛋白分离，上样量为60微克，电泳1小时，将凝胶中的蛋白质电转移至PVDF膜上，取出后以磷酸盐吐温缓冲液PBS中加入0.1%vv吐温20洗膜液洗膜5分钟后，将膜放入含5%脱脂奶粉的磷酸盐吐温缓冲液中，摇床上室温封闭120分钟;磷酸盐吐温缓冲液洗膜5分钟后，将膜放入一抗WWC3-1:500，Sigma，GAPDH-1:10000，Sigma，4°C过夜;磷酸盐吐温缓冲液洗膜10分钟X3次;辣根酶标记山羊抗兔IgGl:3000,中杉金桥）、山羊抗鼠IgG1:3000,中杉金桥）室温摇床上孵育振荡120分钟，磷酸盐吐温缓冲液洗膜10分钟X3次；使用发光液Pierce发光。ECL发光后，利用ImageJ进行条带灰度值测定，以WWC3GAPDH的比值作为相对表达量，实验重复三次取均值图8。[0024]具有抑制Wnt通路、促进Hippo通路活性的作用选择WWC3低表达的H1299细胞系进行WWC3的过表达实验。为了更加直观的观察结果，我们采用了Wnt3A50ngmL对细胞的Wnt活性进行了预刺激使其信号放大。在24孔板内利用脂质体Lipo3000Invitrogen共转染0.5微克的WWC3与0.5微克的Super8xTopFlashWnt通路报告基因质粒）以及50纳克对照质粒pRL-TK海肾素），pEGFP-C2空载体作为过表达质粒的阴性对照。在37°C孵育30小时后，采用双荧光素梅报告基因检测系统Promega，Madison,WI检测报告基因的表达采用Super8xTOPFlash报告基因活性与pRL-TK海参素报告基因活性的比值作为TCF-4介导的Wnt通路活性的值），结果显示WWC3能够显著抑制Wnt3A诱导的Wnt通路活性（图9。同样，在H1299细胞中，共转染WWC3与pGL3b_8xGTIICHippo通路报告基因质粒）以及pRL-TK方法、剂量同前），荧光素酶报告基因显示WWC3能够显著抑制YAP活性促进Hippo通路活性）（图10。[0025]选择相对高表达WWC3的A549细胞系进行WWC3的干扰实验。在A549中共转染shRNA-WWC3与Super8xTOPFlash质粒Wnt通路报告基因质粒）以及pRL-TK质粒方法、剂量同前），结果显示敲除WWC能够显著增加Wnt3A诱导的Wnt通路活性（图9。同理，在A549中共转染shRNA-WWC3与pGL3b_8xGTIICHippo通路报告基因质粒）与pRL-TK质粒（方法、剂量同前），结果显示敲除WWC3能够促进YAP活性抑制Hippo通路活性）（图10。[0026]在H1299细胞中转染WWC3,48h后提取蛋白及RNA，WesternBlot及qPCR技术检测发现WWC3的过表达能够显著下调Wnt通路主要蛋白non-phosphorylatedβ-catenin，以及革巴基因c-myc、MMP7、cyclinDl的蛋白及mRNA表达水平，同时下调Hippo通路靶基因CTGF的蛋白及mRNA表达水平（图13，14。在A549中转染shRNA-WWC3，WesternBlot及qPCR技术检测发现敲除11〇3能够显著上调1]11：通路主要蛋白11〇11-口11〇8口11〇巧13七610-〇3七611；[11，以及革[11基因3-myc、MMP7、eye1inD1的蛋白及mRNA表达水平，同时上调Hippo通路靶基因CTGF的蛋白及mRNA表达水平（图11，12。[0027]因此，醫C3是一种抑制Wnt通路同时促进Hippo通路活性的蛋白分子。[0028]通过WW结构域和ADDV结构域分别与Dvl2的PY基序和ΗΖ结构域相互作用A549细胞系用5mLPBS清洗两遍，并用lmLNP-40裂解液冰浴15分钟后，将细胞裂解产物从培养板中转移至新的1.5mLEP管中，在裂解产物4°C16000g离心20分钟后将上清转移至新管中，加入proteinA+GbeadsSantaCruzTechnology，4°C旋转摇床2h后，取上清至新的离心管，加入Dvl2抗体（2yLmg，作为诱饵蛋白进行沉降，4°C旋转过夜。次日加入proteinA+Gbesds，4°C旋转6h后，lOOOrpm5min4°C，弃上清，保留沉淀，加入lmLRIPA裂解液RIPA:PMSF=100:1洗磁珠，反复3次后，加入2XLoadingBuffer，煮样lOmin，进行WesternBlot检测。结果显示内源性WWC3与Dvl2存在相互作用。同样，在A549中共转染GFP-WWC3及FLAG-Dvl2质粒，免疫共沉淀发现外源性的WWC3和Dvl2同样可以相互作用（方法同前）（图13。[0029]构建WWC3剪接体（WWC3-ΔWW、WWC3-ΔADDV、WWC3-ΔWW&ADDV与Dvl2剪接体Dvl2_ΔPDZ、Dvl2_ΔPY、Dvl2_ΔPDZ&PY图14，15，以确定WWC3与Dvl2相互作用的结合位点。[0030]在H1299细胞系中共转染WWC3野生型质粒及Dvl2野生型和突变体质粒，转染后48h，收集细胞，免疫共沉淀显示Dvl2通过其PDZ结构域和PY基序与WWC3相互作用（方法同前）（图17;同样，在H1299中共转染Dvl2野生型质粒和WWC野生型和突变体质粒，免疫共沉淀显示WWC3通过其WW结构域和ADDV结构域与Dvl2相互作用方法同前）（图16。[0031]在H1299中共转染WWC3-ΔWW与Dvl2_ΔPY质粒，免疫共沉淀显示保留ADDV结构域的WWC3与保留PDZ结构域的Dvl2能够相互作用（图18;在H1299中共转染WWC3-AADDV与Dvl2-ATOZ质粒，免疫共沉淀显示保留WW结构域的WWC3与保留PY结构域的Dvl2仍能够相互作用（图19。[0032]因此:WWC3是通过其自身的WW结构域和ADDV结构域分别与Dvl2的PY基序和PDZ结构域相互作用。[0033]4.WWC3与Dvl2的相互作用阻碍了α1δε对Dvl2的磷酸化而负性调控Wnt通路活性在H1299细胞中转染WWC3质粒，48h后提取蛋白，WesternBlot检测发现:WWC3的过表达能够显著下调Dvl2的磷酸化;在A549中转染shRNA-WWC3，WesternBlot检测发现WWC3的敲除能够显著上调Dvl2的磷酸化图20。[0034]在A549细胞中转染shRNA_WWC3,同时加入：Κ1δε抑制剂（IC261，SantaCruzTechnology，或转染siRNA-CKlSe，37°C30小时后，荧光素酶报告基因和WesternBlot方法同前）显示:敲除ααδε或抑制其活性能够显著逆转由于WWC3沉默引起的Wnt通路活性的上调（图20以及Dvl2磷酸化的上调（图21，22。[0035]在H1299细胞中梯度转染WWC3,免疫共沉淀显示：随着WWC3表达的逐渐增加，CKU与Dvl2的结合量逐渐减少方法同前）（图23;另一方面，在H1299中梯度转染CKU，免疫共沉淀发现:随着CKU表达的逐渐增加，醫C3与Dvl2的结合量逐渐减少方法同前）（图23最后在H1299细胞中转染WWC3和WWC3突变体，荧光素酶报告基因显示WWC3野生型能够显著抑制Wnt通路活性，而WWC3-AWW&ADDV不能与Dvl2结合）则无此作用（方法同前）（图24;蛋白免疫印记发现:野生型WWC3能够下调Wnt通路中p-Dvl2,活化的β-catenin和革巴基因蛋白表达水平，而WWC3-Δffff&ADDV不能与Dvl2结合则无此作用方法同前）（图255.LATS1与Dvl2竞争性结合WWC3而促进Hippo通路活性在H1299细胞中转染WWC3质粒，48h后提取蛋白，WesternBlot检测发现:YAP与LATS激酶的磷酸化水平上调（图24;相反，在A549中敲除WWC3后，WesternBlot检测发现:YAP与LATS激酶的磷酸化水平下调（图26;上述结果均这证明WWC3为Hippo通路的正向调节因子。[0036]在H1299中分别转染WWC3和WWC3的三种突变体质粒，利用荧光素酶报告基因实验，发现：与对照组相比，WWC3能够显著减低YAP活性（激活Hippo通路），而缺失WW结构域的Mutantl与Mutant3则不能（图27;同时我们应用免疫共沉淀实验发现野生型WWC3能够与LATS1激酶相互作用，而缺失WW结构域的WWC3则不能（图28。这说明WWC3的WW结构域促进Hippo通路激活中起到重要作用。[0037]根据Dvl2也能与WWC3的WW结构域结合这一实验结果，说明LATS1和Dvl2都可以与WWC3的同一位点结合。因此，我们预测：LATS1与Dvl2很有可能竞争性结合WWC3,进而影响Hippo通路活性。为了证明这一推测，一方面在H1299中过表达Dvl2,免疫共沉淀发现WWC3与LATS1的结合减少（图29;在H1299中敲除Dvl2,免疫共沉淀实验发现WWC3与LATS1的结合量增多（图30。另一方面我们在H1299中过表达LATS1，免疫共沉淀发现WWC3与Dvl2的结合量减少（图31;在H1299中干扰LATS1的表达，免疫共沉淀发现WWC3与Dvl2的结合量增加（图32。这些证明了LATS1和Dvl2能够竞争性结合WWC3.为了探究LATS与Dvl2竞争性结合WWC3后对Hippo通路活性有怎样的影响，在H1299中共转染WWC3与Dvl2两种质粒，48h后，WesternBlot检测发现Dvl2能够逆转WWC3引起的p-LATSl、p-YAP水平上调（图33;在H1299中共转染WWC3质粒与siRNA-Dvl2，WesternBlot检测发现敲除Dvl2能够进一步上调WWC3引起的LATS1与YAP的磷酸化图34。[0038]最后在H1299中共转染WWC3质粒和Dvl2野生型及突变体质粒，WesternBlot检测发现能够与WWC3结合的野生型Dvl2质粒能够逆转WWC3引起的p-LATSl与p-YAP水平的上调，而不能与WWC3结合的Dvl2Mutant3质粒则不能逆转（图35。

权利要求：1.WWC3蛋白分子在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于:所述WWC3蛋白分子为含有WW结构域和C2结构域的塗型蛋白；所述WWC3通过DVLs抑制Wnt活性和通过LATS1激活Hippo通路活性。2.根据权利要求1所述的WWC3蛋白分子在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于:所述WWC3蛋白分子通过其自身的WW结构域和ADDV结构域与Wnt通路中重要的上游蛋白分子DVLs相互作用，该相互作用阻碍了α1δε激酶对DVLs的磷酸化，促进Wnt通路效应蛋白分子β-catenin的降解，减少β-catenin入核，发挥抑制Wnt通路活性的作用。3.根据权利要求1所述的WWC3蛋白分子在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于:利用WWC3的突变体和Dv12剪接体，采用免疫共沉淀的方法证明了WWC3通过WW结构域和Dv12的PY基序相互作用，也可通过ADDV结构域与Dvl2的ΗΖ结构域相互作用，发挥抑制Wnt通路活性的作用。4.根据权利要求1所述的WWC3蛋白分子在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述WWC3的突变体包括WWC3-Δffff、ffffC3-ΔADDV、ffffC3-Δffff所述Dvl2剪接体包括Dvl2_ΔPDZ、Dvl2_ΔPY、Dvl2_ΔPDZ&PY。5.根据权利要求1所述的WWC3蛋白分子在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于:所述WWC3通过其自身的WW结构域与Hippo通路中央激酶LATS1相互作用，促进LATS1磷酸化，进而使Hippo效应蛋白YAP滞留于胞楽;，发挥促进Hippo通路活性的作用。6.根据权利要求1所述的WWC3蛋白分子在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：WWC3与LATS1激酶相互作用并发挥了激活Hippo通路活性的功能，而缺失WW结构域的WWC3则无此功能；增加LATS1的表达，可使WWC3与Dvl2的结合量减少；减少LATS1的表达，则WWC3与Dvl2的结合量增加，即LATS1与WWC3的结合同Dvl2存在着竞争性。

百度查询： 中国医科大学 WWC3蛋白分子在制备抗肿瘤药物中的应用

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