申请/专利权人：甘肃农业大学

申请日：2009-06-29

公开（公告）日：2011-01-05

公开（公告）号：CN101935691A

主分类号：C12Q1/68(2006.01)I

分类号：C12Q1/68(2006.01)I

优先权：

专利状态码：失效-发明专利申请公布后的驳回

法律状态：2013.10.30#发明专利申请公布后的驳回;2011.03.02#实质审查的生效;2011.01.05#公开

摘要：本发明公开了一种绵羊PRNP等位基因密码子的分型方法，包括：以提取的绵羊血液基因组DNA为模板，使用寡核苷酸作为引物，通过巢式PCR方式扩增外侧引物；稀释扩增产物，并以得到的扩增产物稀释物为模板，以所述序列A作为上游引物，使用序列C～序列L作为下游引物，通过ARMS-PCR扩增外侧引物，分别进行密码子136、154和171不同基因型突变位点的检测；扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，记录扩增条带的有无，判断并确定基因型。本发明所述分型方法，可以克服现有技术中成本高、检测时间长和精确性差等缺陷，以实现成本低、检测时间短、并有利于提高绵羊PRNP痒病抗性基因型ARRARR频率的优点。

主权项：一种绵羊PRNP等位基因密码子的分型方法，其特征在于，包括以下步骤：a、提取绵羊血液基因组DNA，以所述基因组DNA为模板，使用寡核苷酸作为引物，通过巢式PCR方式扩增外侧引物；其中，所述寡核苷酸包括以下序列表：序列A  SHP‑P1  5′GCATGTGGCAGGAGCTGCTG  3′；序列B  SHP‑P2  5′AGTTTCGGTGAAGTTCTCCCCCTTG  3′；b、稀释步骤a得到的扩增产物，获得扩增产物稀释物，以所述扩增产物稀释物为模板，以所述序列A作为上游引物，并使用序列C～序列L作为下游引物，通过ARMS‑PCR扩增外侧引物，并分别进行密码子136、154和171不同基因型突变位点的检测；其中，所述密码子136包括密码子136A、136V和136T，所述密码子154包括154R、154H和154L，所述密码子171包括171Q、171R、171K和171H；所述序列C～序列L具体如下：序列C  136A  5′TGTAGGCCTGCTCATAGC  3′；序列D  136V  5′TAGCTAGGCCTGCTCAAGA  3′；序列E  136T  5′GCTAGGCCTGCTCATTGT  3′；序列F  154R  5′GCTCAACGGTACATGTTTTCAC  3′；序列G  154H  5′CGCTAACGGTACATGTTTTGAT  3′；序列H  154L  5′CCTCAACGGTACATGTTTTCAA  3′；序列I  171Q  5′TGCGACGTCTGGTTACTATCCTG  3′；序列J  171R  5′CTGCTACGTCTGGTTACTATGCC  3′；序列K  171K  5′TGTTCGACGTCTGGTTACTATATTT  3′；序列L  171H  5′CTGCGACGTCTGGTTACTGCAA  3′；c、对步骤b得到的扩增产物，经琼脂糖凝胶电泳检测，记录特异性扩增条带的有无，并判断基因型；具体记录参见下表：d、当出现步骤c中Example 18～Example 22情况时，对步骤a得到的扩增产物进行TA克隆，以随机挑选的无色透明菌落为模板，进行菌落PCR扩增。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 甘肃农业大学 一种绵羊PRNP等位基因密码子的分型方法

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