申请/专利权人：THD股份公司

申请日：2017-02-03

公开（公告）日：2018-11-23

公开（公告）号：CN108884489A

主分类号：C12Q1/6851(2018.01)I

分类号：C12Q1/6851(2018.01)I;C12Q1/6858(2018.01)I;C12Q1/689(2018.01)I;C12Q1/04(2006.01)I

优先权：["2016.02.05 IT 102016000011879"]

专利状态码：有效-授权

法律状态：2022.06.14#授权;2019.03.01#实质审查的生效;2018.11.23#公开

摘要：本发明涉及一种用于确定从个体分离的生物样品中的幽门螺杆菌的体外方法。此外，本发明的方法还使得能够确定幽门螺杆菌的抗生素抗性。本发明的另一方面涉及用于进行所述方法的试剂盒。

主权项：1.一种用于确定从个体分离的生物样品中的幽门螺杆菌Helicobacter pylori和或用于确定所述幽门螺杆菌对至少一种抗生素的抗性的体外方法，所述方法包括以下步骤：I.获得从个体分离的生物样品；II.从所述样品纯化分离DNA；和III.扩增幽门螺杆菌的至少一个基因的至少一部分，所述至少一个基因的至少一部分包含负责对所述抗生素的抗性的至少一个突变位点，所述扩增通过实时PCR，使用至少一对寡核苷酸引物对和至少两种寡核苷酸探针进行，其中所述引物对在跨越所述突变位点的DNA区域中杂交，且其中每种寡核苷酸探针在5’和3’末端用两种不同标记物标记，并且其中至少一种寡核苷酸探针与所述基因的野生型等位基因的至少一个基因部分互补并对该基因部分是特异性的，并且至少一种寡核苷酸探针与所述基因的负责所述抗生素抗性的突变等位基因的至少一个基因部分互补并对该基因部分是特异性的；IV.通过以优选地PCR循环阈值测量标记所述寡核苷酸探针的标记物的水平，来定量扩增的野生型和或突变的DNA，其中仅标记与所述野生型等位基因的至少一个基因部分互补并对该基因部分特异的探针的标记物的存在界定了正常的纯合基因型，且因此界定了对所述抗生素无抗性的所述Hp的存在；仅标记与所述基因的突变等位基因的至少一个基因部分互补并对该基因部分特异的探针的标记物的存在界定了突变的纯合基因型，且因此界定了对所述抗生素具有抗性的所述Hp的存在；并且两种标记物的存在界定了具有所述基因的野生型等位基因和突变等位基因的杂合基因型，且因此界定了对所述抗生素具有抗性的所述Hp的存在。

全文数据：用于确定幽门螺杆菌Helicobacterpylori的方法[0001]描述技术领域[0002]本发明涉及一种用于确定从个体分离的生物样品中的幽门螺杆菌的体外方法。此夕卜，本发明的方法还使得能够确定幽门螺杆菌的抗生素抗性。[0003]本发明的另一方面涉及用于实施所述方法的试剂盒。[0004]领域状态[0005]幽门螺杆菌Hp是属于螺杆菌属Helicobacter的一种微需氧、嗜酸的有鞭毛革兰氏阴性细菌。[0006]目前，Hp是一种定殖在约一半世界人口的胃中的细菌，并且被认为是消化性溃疡和MALT淋巴瘤中的发病因子，是胃腺癌的风险因子，并且是与其他胃和胃外病理相关的因子。[0007]公知的是，Hp感染与低的社会经济地位而不是人们所属的种族相关。事实上，Hp感染在发展中国家非常普遍。这种细菌的传播方式尚不清楚;然而，经口或粪-口途径被认为是最有可能的。[0008]用于诊断Hp感染的方法可分类为：1侵入性方法，特别是对胃粘膜获取的活组织内窥镜检查并随后分析;2非侵入性方法，例如呼气测试，测试粪便中的抗原或测试血液中的抗体。[0009]最常见的非侵入性方法之一是尿素呼气试验UBT。该方法要求让患者饮用含有标记有放射性碳同位素的尿素的饮料。在Hp的存在下，由尿素酶催化的尿素分裂，导致在呼出的气体中铵和标记的二氧化碳的形成和释放。如果个体的呼气分析显示存在标记的C02，则测试为阳性，且因此认为个体被Hp感染。[0010]血清学试验要求寻找靶向Hp的IgG抗体。然而，这些测试不能使得将活动性感染与先前的Hp感染区分开。因此，它们不被认为对于监测疗法的有效性，或甚至作为证实根除的后测试是理想的。[0011]另一种微创方法是基于对粪便中抗原HpSA的测试。在这种情况下，免疫酶测试是对个体的粪便样品进行的。[0012]该方法是呼气测试的有效替代，但其特征在于低灵敏度和特异性，特别是当期望评价治疗效果时。[0013]关于根除Hp感染的疗法，最常见的疗法包括施用与抗生素相关的质子栗抑制剂PPI〇[0014]特别是，一线疗法第I线实际上包括三联疗法，其提供施用PPI和克拉霉素14天，然后施用PPI、克拉霉素和阿莫西林或左氧氟沙星和甲硝唑7-10天。可选地，顺序疗法是可得的；它提供施用1克X2的阿莫西林和PPI5天，然后在接下来的5天施用500mg克拉霉素X2、PPI和500mgX2的替硝唑。[0015]不幸的是，对抗生素的抗性是这种治疗方法缺乏成功的最重要因素。特别是，克拉霉素用于治疗呼吸系统疾病和妇科和寄生虫感染的广泛使用增加了对这种抗生素的主要耐药性。[0016]与所有大环内酯类似，克拉霉素通过与细菌核糖体的50S亚基键合而发挥其抗菌作用。该键合阻止肽从核糖体的A位点易位至P位点通过阻断酶移位酶并引起肽链延伸的抑制通过阻断酶转移酶）。[0017]对左氧氟沙星和阿莫西林的抗性也相当普遍。[0018]在基于克拉霉素的治疗失败后，使用左氧氟沙星用于根除Hp是常见的做法，因为其在“二线疗法”方案中的作用。氟喹诺酮类通过与DNA促旋酶拓扑异构酶II的A亚基结合而发挥剂量依赖性细菌效应，DNA促旋酶是一种维持DNA螺旋结构必需的酶。在敏感菌株中，左氧氟沙星阻断DNA合成，并且在高剂量时也阻断RNA合成。[0019]阿莫西林是一种氨基青霉素，其活性与氨苄青霉素相似，其特征在于相对于胃酸度具有良好的稳定性，并且具有比青霉素和氨苄青霉素更大的口服生物利用度。与青霉素类似，阿莫西林作用于细菌壁，防止形成确保壁本身刚性必需的交联转肽过程）。它与转肽酶形成稳定的、无活性复合物，转肽酶负责转肽过程。阿莫西林具有一系列作用，包括革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌，且基本上有三种抗性机制：[0020]1产生β-内酰胺酶，其通过打开β-内酰胺环使抗生素失活；[0021]2降低细菌对分子的渗透性;和[0022]3结合阿莫西林的蛋白或青霉素结合蛋白（PBP的修饰。[0023]阿莫西林是第一种用于根除Hp的抗生素，且目前仍用于常规治疗方案，也因为其耐药率低。[0024]鉴于上述情况，仍然非常需要具有能够确定幽门螺杆菌的技术，S卩，使得可能在个体中诊断该细菌感染并且是非侵入性的、经济、快速和诊断准确的技术。特别是，强烈需要具有能够确定样品中幽门螺杆菌的存在并同时评价细菌的抗生素抗性的方法。[0025]申请人已经找到了用一种方法用于上述需求的解决方案，该方法在体外对从个体分离的生物样品进行，并且提供包含幽门螺杆菌基因的突变位点的区域的分子分析，优选地基因分型，所述幽门螺杆菌基因在突变时负责对通常用于对抗这种细菌感染的疗法的抗生素优选克拉霉素、左氧氟沙星和阿莫西林的抗性。[0026]事实上，申请人出乎意料地发现，与目前可用的非侵入性方法相比，下文描述的方法是非常可靠的，目前可用的非侵入性方法特征在于低特异性，因为它们产生许多假阳性。[0027]本发明方法的一个特别的优点是，除了确定生物样品中Hp的存在，即该细菌的感染外，它同时使得能够确定所鉴定的Hp菌株是否携带负责对根除疗法中所用的抗生素之一的抗性的突变。因此，使用申请人设计的方法，通过单次非侵入性、快速、高灵敏度和特异性测试来确定Hp的感染，并确定细菌的抗生素抗性，优选其对克拉霉素、左氧氟沙星或阿莫西林的抗性是可能的。[0028]因此，从治疗的观点来看，本发明的方法证明是非常有利的，因为从最早的阶段，可以将患者引导至最合适的治疗以达到根除细菌的目的。换言之，患者将从最早阶段开始进行具有更大的治疗成功性的特别治疗。[0029]本发明的方法还具有健康服务的优点，因为它将实现消除与目前可用的被设计用于根除细菌的治疗方法相关的浪费，目前可用的设计用于根除细菌的治疗方法是基于用各种可用的药理学疗法的实际根除尝试。[0030]因此，本发明的主题涉及一种用于确定监测幽门螺杆菌，和或特别是用于确定幽门螺杆菌对通常用于治疗目的的抗生素的抗性的方法，如所附的独立权利要求所指定的。[0031]此外，本发明的主题还涉及用于实施所述方法的试剂盒，如所附的独立权利要求所指定的。[0032]在所附的从属权利要求中限定了本发明的方法和试剂盒的优选方面。[0033]从以下详细描述和说明性、非限制性实施例（其也参考附图），本发明的其他特征和优点将变得更加明显，其中：[0034]-图1显示了实施本发明方法的扩增步骤的图。[0035]详细描述[0036]本发明涉及一种体外对从个体分离的生物样品进行的，用于确定或还用于监测所述样品中幽门螺杆菌Hp的存在和或用于确定Hp对至少一种抗生素的抗性的方法，所述方法包括以下步骤：[0037]⑴获得从个体分离的生物样品；[0038]ii从所述样品纯化分离DNA;和[0039]iii扩增Hp基因的至少一部分，所述Hp基因的至少一部分包含在突变时负责对所述抗生素的抗性的至少一个核苷酸位点，所述扩增通过PCR，优选实时PCR，使用至少一对寡核苷酸（引物对和至少两种寡核苷酸探针进行，其中所述引物对在跨越所述突变位点的核酸区域中配对，所述寡核苷酸探针用两种不同标记物标记，并且其中至少一种寡核苷酸探针与包含至少一个正常位点的Hp基因的至少一部分互补并对该部分是特异性的（即与所述基因的正常非突变等位基因互补），并且至少一种寡核苷酸探针与Hp基因的包含负责所述抗生素抗性的至少一个突变位点的至少一部分互补并对该部分是特异性的（即与所述基因的突变等位基因互补）（参见图1;[0040]iv通过测量两种标记物的水平来定量扩增的正常和或突变的DNA，其中：[0041]-不存在扩增的DNA意味着样品中不存在Hp;[0042]-仅标记与所述基因的野生型等位基因互补并对所述基因的野生型等位基因特异的探针的标记物的存在界定了正常的纯合基因型，且因此界定了对所述抗生素无抗性的所述Hp的存在；[0043]-仅标记与所述基因的突变等位基因互补并对所述基因的突变等位基因特异的探针的标记物的存在界定了突变的纯合基因型，且因此界定了对所述抗生素具有抗性的所述Hp的存在;和[0044]-两种标记物的存在界定了具有所述基因的野生型等位基因和突变等位基因的杂合基因型，且因此界定了对所述抗生素具有抗性的所述Hp的存在。[0045]图1示意步骤iii;实际上，这对正向和反向引物跨越每个在一条DNA链上）当突变时负责抗生素抗性的位点。该对使得能够扩增含有作为抗生素抗性原因的突变位点的Hp基因区域。选择探针对使得一个探针与正常野生型）（即非突变基因）区域特异性杂交，且另一个探针与含有突变的基因区域杂交。这两个探针用两种不同的标记物标记，使得一个标记物或两者的检测可以使得能够确定Hp基因型。显然，如果样品中不存在细菌，则不会扩增，因为引物不会发现DNA来配对。根据步骤iv进行的检测使得可能确定所述样品中存在的任何Hp的基因型，如果扩增的基因部分不具有突变，则所述基因型是正常纯合的，或者如果扩增的基因部分具有突变，则所述基因型是突变纯合的，或如果扩增的基因部分是一半非突变的和一半突变的，则所述基因型是杂合的。[0046]因此，扩增产物的存在表示在所述生物样品中存在Hp，因此表示Hp感染，而如上所述的基因分型使得可能确定细菌是否对至少一种抗生素具有抗性。[0047]本发明提及的抗生素是为了治疗性治疗Hp感染的目的通常单独或组合使用的抗生素。优选地，抗生素选自由以下组成的组:克拉霉素、左氧氟沙星、阿莫西林、甲硝唑、替硝唑、四环素、利福布汀及其组合。出于本发明的目的，优选的抗生素选自：克拉霉素、左氧氟沙星、阿莫西林及其组合，最优选克拉霉素。[0048]在本发明的上下文中，对抗生素的抗性是指细菌在这种情况下是Hp对根除疗法中使用的抗生素或抗生素混合物pool变得抗性的机制。正在提及的抗生素是上面提到的抗生素。[0049]因此，本发明的方法使得可能确定监测个体中的Hp感染并同时确定任何确定监测的Hp菌株的抗生素抗性。因此，本发明的方法还使得能够确定与Hp感染相关的病状，首先是影响胃系统的病状，优选地胃炎、消化性溃疡、胃癌或MALT淋巴瘤、消化不良、缺铁性贫血、特发性血小板减少性紫癜、以及胃十二指肠外病理。[0050]在本发明的一个优选实施方案中，该方法对从个体分离的粪便样品进行。[0051]粪便样品可以由个体自己收集，即该方法的步骤⑴可以由个体自主地进行。[0052]通常，使用适合收集粪便的任何装置收集粪便样品。优选地，该装置包括用于收集粪便并将它们溶解在含有增溶工具的增溶室中的部分。增溶工具优选地是盐水溶液，如PBS。增溶使得粪便样品能够均匀化，并且优选地通过剧烈摇动样品来进行通过剧烈摇动样品而是有利的，例如在Vortex混合器上剧烈摇动几秒钟约30秒）。[0053]优选地，用适于收集适当量的粪便的刷子收集粪便，以实施本发明的方法。特别地，为了实施本发明的方法而收集的量因此该方法的起始材料的量范围从150至250毫克mg;优选地，它是约200mg的奠便。[0054]为了实施本发明的方法的目的，建议在约Iml增溶工具中溶解从150至250mg，优选约200mg的奠便。[0055]增溶室优选通过过滤元件与收集室分隔。以这种方式，溶解的粪便可以例如由重力通过收集室中的滤器。尺寸大于滤器孔的溶解粪便部分不会进入收集室。过滤后的粪便可以从收集室收集，优选地用例如注射器通过可穿透的膜收集。[0056]出于本发明的目的，过滤元件的孔径优选地范围从100至200微米μπι，更优选地从100至150μπι，甚至更优选地从105至120μπι，且甚至更优选地其是约106μπι。因此，将通过的溶解过滤的粪便部分将具有的尺寸等于小于100-200Μ1，优选地等于小于100-150μπι，更优选地等于小于105-120μηι，更优选地等于小于约106μηι。[0057]一旦从个体获得生物样品或一旦粪便如上所述溶解和或过滤，生物样品或溶解过滤的粪便下文称为样品将进行该方法的步骤ii。[0058]为了特定目的，使用本领域技术人员通常已知的方法从样品提取DNA。出于本发明的目的，优选的提取方法包括使用苯酚-氯仿溶液，优选以与待处理的样品1:1的比率。[0059]特别地，本发明的提取方法包括向样品加入Trizol的步骤。优选地，Trizo1与样品之间的比率为1:1。然后优选地将Trizol:样品混合物均勾混合几秒钟，例如在Vortex混合器上混合。[0060]随后优选地将氯仿加入Trizol:样品混合物。优选加入等于Trizol:样品混合物体积110的量的氯仿。[0061]优选地，将Trizol:样品：氯仿混合物均匀混合几秒钟，例如在Vortex混合器上混合。[0062]优选地，在均匀混合后，将Trizol:样品：氯仿混合物分层，优选通过离心进行。建议以10000-14000g，优选约12000g离心一段时间，优选约10分钟。分层优选在低温进行，更优选在约4°C进行。[0063]在Trizol:样品:氯仿混合物分层结束时，通常得到3相:水相、中间相和苯酚相。[0064]为了本发明的目的，优选丢弃水相。[0065]因此，DNA从混合物的剩余部分沉淀，即从代表有机相的中间相和苯酚相沉淀。[0066]沉淀优选通过向有机相中加入醇如乙醇，更优选100%乙醇来实现。[0067]然后优选使沉淀的DNA沉降（sediment，例如通过离心。优选的离心条件是约2000g，持续几分钟，优选在低温，例如约4°C。[0068]一旦DNA沉淀实际上，DNA形成团块），优选除去表面相，并用盐水溶液如柠檬酸钠处理沉淀的DNA，优选至少一次，更优选2-3次该步骤是DNA团块的一种洗涤）。该步骤优选在室温进行，更优选持续约30分钟。[0069]用盐水溶液的每次处理之后是沉淀的DNA沉降步骤，优选通过离心，例如在约2000g离心几分钟，优选在低温例如约4°C进行。[0070]随后，沉淀的DNA优选用醇如乙醇，优选75%乙醇处理。所述处理优选进行约20-30分钟，更优选在室温进行。[0071]在用醇处理结束时，优选使沉淀的DNA沉降沉淀，例如通过在约2000g离心几分钟，优选在低温例如约4°C进行。[0072]然后优选干燥沉淀的DNA，以允许醇完全蒸发。[0073]干燥的DNA优选重悬于碱性溶液中，更优选重悬于NaOH例如Na0H8mM中。[0074]在步骤⑴结束时，优选以最大速度约HOOOg进行最终离心步骤10分钟左右，优选在室温进行。转移上清液（即，未沉淀的部分并向其加入缓冲液，例如HEPES-EDTA，优选在pH7-8。[0075]在将DNA用于随后的步骤（iii之前，建议定量和或定性地评价上述纯化的DNA，例如通过本领域技术人员已知的技术260280nm分光光度计读取、琼脂糖凝胶上DNA样品的显现等）。[0076]扩增Hp基因的至少一部分的步骤通过PCR，优选实时PCR，更优选使用TaqMan化学的实时PCR进行，所述Hp基因的至少一部分包含在突变时负责对所述抗生素的抗性的至少一个核苷酸位点。[0077]在实时PCR系统中，由于寡核苷酸探针的标记，监测扩增扩增的）产物的积累成为可能。[0078]用于该方法的步骤（iii中的每种寡核苷酸探针用至少两种不同的标记物标记，优选荧光标记物。特别地，高强度荧光标记物和第二标记物，高强度荧光标记物被定义为报道物，例如修饰的荧光素，第二标记物优选低强度或非荧光标记物，被称为猝灭剂，例如修饰的罗丹明。[0079]优选地，报道分子与探针的5’末端键合和或优选地，猝灭剂与探针的3’末端键合。[0080]由于猝灭剂的非荧光性，实时PCR系统能够以更高的准确度测量报道物荧光染料的输入。当报道物和猝灭剂彼此接近靠近时，探针本身-猝灭剂-吸收报道物的荧光，因此其不能被测量。事实上，在这些条件下唯一可检测的荧光是猝灭剂的低荧光。[0081]在PCR期间，每个探针在跨越引物对正向引物和反向引物-参见图1的区域中与其互补序列进行特异性退火配对）。[0082]DNA聚合酶不仅复制靶DNA，而且由于其5’-3’核酸内切酶活性，它还通过分离两个荧光标记物降解与其杂交的寡核苷酸探针，并从而使报道物的发射完全可检测。鉴于对于在实时PCR期间复制的每个DNA对，发生报道物（荧光标记物）的释放，在扩增过程期间累积的相对荧光在每个时刻与扩增的DNA的量成比例。在实时PCR反应的整个持续期间，通过发射光谱采集程序，例如序列检测系统SequenceDetectionSystem，SDS，可能将由程序测量的报道物的荧光变化转换为扩增动力学的实时表示。[0083]不是仅仅由于系统的“背景噪声”的变化，而是由于特定的扩增事件，达到报道物的荧光阈值的PCR循环被定义为反应的阈值循环Ct。在本发明的方法中，靶DNA在阈值循环，因此当PCR反应处于指数期时定量。[0084]由于一个用于Hp基因的正常等位基因，且另一个用于突变等位基因（即携带负责Hp的抗生素抗性的突变的等位基因）的两种寡核苷酸探针用两种不同的报道物发射的荧光信号不同）标记，将可能追踪已经扩增的等位基因并因此可能追踪细菌的基因型。[0085]因此，扩增步骤使得能够对细菌菌株进行基因分型，也就是说，它使得能够确定样品的未知基因型。通过本发明的扩增，优选地可能区分与单核苷酸突变相关的多态性，即点突变或SNP单核苷酸多态性）。在这种情况下，SNP落入当突变时负责抗生素抗性的Hp基因内。可选地，本发明的扩增将使得可能区分这样的单核苷酸的突变，该单核苷酸的突变决定了其中所述核苷酸所属于的三联体的翻译落入与正常蛋白中存在的氨基酸不同的氨基酸中。[0086]优选地，在本发明的上下文中，单核苷酸多态性SNP意指一种多态性，即基因材料DNA中的（遗传变异，其影响单个核苷酸，并且使得多态性等位基因在群体中以大于1%的比例存在。低于此阈值，人们通常称为罕见的变体。[0087]优选地，遗传变异可以由_中碱基的取代、缺失或插入引起，并且可以与编码区和非编码区相关。多态性基因座是至少2%的群体对其是杂合的那些基因座。这些多态性的后果可以是沉默的，此时蛋白变异不改变蛋白的功能或结构。可选地，所述多态性可以具有非沉默的后果，特别是当人们观察到表型的变化时，例如当蛋白在功能上改变时。[0088]基因分型步骤通过用与Hp基因序列的至少一部分的区域互补的至少一对寡核苷酸（引物对扩增所述部分来进行，所述Hp基因序列的至少一部分包含在突变时负责抗生素抗性的位点。实际上，引起抗生素抗性的至少一个突变位点落在引物对之间，即用引物对扩增的区域包含Hp基因序列的含有至少一个负责抗生素抗性的突变位点的部分。[0089]所述基因优选地选自：23SrRNA、gyrA和PBP-1。[0090]如果突变，23SrRNA基因负责对克拉霉素的抗性。特别地，在这种情况下，利用本发明的方法，可能确定落入23SrRNA基因中负责大部分克拉霉素抗性的最广泛的突变的至少一个。优选地，负责克拉霉素抗性的所述突变选自：A2143G突变（即位置2143的腺嘌呤被修饰成鸟嘌呤）、A2142C突变和A2142G突变。[0091]如果突变，gyrA基因负责对左氧氟沙星的抗性。特别地，在这种情况下，利用本发明的方法，可能确定影响位置87处的氨基酸天冬酰胺的至少一个突变，该天冬酰胺由于突变而变成赖氨酸。具体地，在位置87,可以存在两种正常野生型变体，编码氨基酸天冬酰胺的AAC三联体或AAT三联体。影响这些三联体的第三个碱基并将它们转化为AAA或AAG的突变导致天冬酰胺被赖氨酸取代。因此，优选地，负责左氧氟沙星抗性的所述突变选自：C26IA和C261G突变。[0092]此外，利用本发明的方法，可能确定影响在位置91的天冬氨酸的突变，该天冬氨酸由于突变而变成甘氨酸、或天冬酰胺、或丙氨酸、或酪氨酸。[0093]具体而言，在位置91的三联体，S卩GAT序列（其编码天冬氨酸），在第一个核苷酸碱基的位点被GGT三联体其编码甘氨酸或TAT三联体其编码酪氨酸取代。[0094]因此，用本发明的方法确定的负责左氧氟沙星抗性的突变优选地选自：G271A、G271T和A272G〇[0095]如果突变，PBP-I基因负责对阿莫西林的抗性。特别是，该突变导致在位置413的丝氨酸被精氨酸氨基酸取代（Ser-413Arg。编码丝氨酸的AGC三联体可以在第三个碱基中突变成编码精氨酸的三联体AGA或AGG。[0096]优选地，用本发明的方法确定的负责阿莫西林抗性的突变选自：C413A和C413G。[0097]特别地，所述Hp基因序列的扩增部分选自SEQIDNO:1-4,其中SEQIDNO:1和或2指23S基因，SEQIDNO:3指gyrA基因，且SEQIDNO:4指PBP-I基因。[0098]优选地，该对引物包含SEQIDNO:5和SEQIDNO:6。所述引物对使得能够扩增序列SEQIDNO:1和或2,即Hp的的23SrRNA基因序列的包含负责Hp的克拉霉素抗性的至少一个突变位点的部分。[0099]可选地，该对引物包含SEQIDN0:9和SEQIDNO:10。所述引物对使得能够扩增序列SEQIDNO:3,即Hp的gyrA基因序列的包含负责Hp的左氧氟沙星抗性的至少一个突变位点的部分。[0100]可选地，该对引物包含SEQIDNO:13和SEQID0:14。所述引物对使得能够扩增序列SEQIDN0:4,即Hp的I3BP-I基因序列包含负责Hp的阿莫西林抗性的至少一个突变位点的部分。[0101]任选地，可以在单个扩增反应中使用多于一对引物以同时确定监测Hp的多于一种抗生素抗性，特别是确定监测Hp菌株的克拉霉素抗性和或左氧氟沙星抗性和或阿莫西林抗性。[0102]除了引物对之外，使用至少两种寡核苷酸探针进行扩增。每种寡核苷酸探针在一个末端，优选5’末端用高强度标记物报道物标记，且在另一末端，优选3’末端用非荧光或低强度标记物猝灭剂标记。此外，在两种寡核苷酸探针中，一种是与所述基因的正常等位基因互补并对所述基因的正常等位基因是特异性的，一种是与负责所述抗生素抗性的突变等位基因互补并对所述抗生素抗性的突变等位基因是特异性的参见图1。[0103]寡核苷酸探针优选用选自以下的标记物标记:FAM具有红色荧光）、VIC具有绿色荧光）、HEX、JOE、NED、SYBER、TAMRA、TET和ROX。[0104]如之前详细解释的，当这两种荧光标记物存在于同一寡核苷酸探针上时，猝灭剂隔离吸收）由报道物发出的荧光，而当它们分离时，例如由于被DNA聚合酶降解而发生的，报道物的荧光不被猝灭剂吸收，且因此可以被检测测量。[0105]因此，在本发明的上下文中，猝灭剂是指低能荧光标记物（荧光团，例如修饰的罗丹明），其熄灭报道物的荧光，且因此，当探针完整时，仅其自身的荧光是可测量的。优选地，探针是具有小沟结合物MGB化学性质的TaqMan探针。具有小沟结合物化学性质的探针是指其中探针用至少两种不同的荧光物质例如VIC和FAM标记的系统。这种化学性质使得可能升高探针的解链温度1而不增加其长度，且因此使得能够设计短探针。[0106]优选地，探针选自SEQIDNO:13-23。[0107]特别地，SEQIDNO:13和或SEQIDNO:14与引物对SEQIDNO:5和SEQIDNO:6一起使用，SEQIDNO:13与无负责抗生素抗性的突变的23SrRNA基因的至少一部分，优选地SEQIDNO:1和或2互补;且SEQIDNO:14与23SrRNA基因的携带负责抗生素抗性的突变的至少一部分，优选地SEQIDNO:1和或2互补，所述突变优选地选自：A2143G突变、A2142C突变和A2142G突变。或SEQIDN0:3对于正常等位基因是特异性的且SEQIDN0:4对于携带负责克拉霉素抗性的突变的等位基因是特异性的。[0108]优选地，选自以下的至少一种探针：SEQIDN0:15、16、17及其组合与引物对SEQIDNO:7和8—起使用。特别地，SEQIDNO:15-17是与序列SEQIDNO:3的一部分互补并对该部分是特异性的，所述序列SEQIDNO:3的一部分含有负责左氧氟沙星抗性的至少一个突变位点。SEQIDNO:15对于gyrA基因的正常等位基因是特异性的且SEQIDNO:16和17对Asn87Lys突变是特异性的。[0109]优选地，选自以下的至少一种探针：SEQIDN0:18、19、20及其组合与引物对SEQIDNO:9和10—起使用。特别地，SEQIDNO:18-20与序列SEQIDNO:3的一部分互补和并对该部分是特异性的，所述序列SEQIDNO:3的一部分含有负责左氧氟沙星抗性的至少一个突变位点。SEQIDNO:18对于gyrA基因的正常等位基因是特异性的且SEQIDNO:19和20分别对于Asp91Gly突变和Asp91Tyr突变是特异性的。[0110]优选地，选自以下的至少一种探针：SEQIDNO:21、22、23及其组合与引物对SEQIDNO:11和12—起使用。特别地，SEQIDNO:21-23与序列SEQIDN0:4的一部分互补并对该部分是特异性的，所述序列SEQIDN0:4的一部分含有负责阿莫西林抗性的至少一个突变位点。SEQIDN0:21对于PBP-I基因的正常等位基因是特异性的且SEQIDN0:22和23对Ser413Arg突变是特异性的。[0111]表I中显示了本发明方法中使用的序列。特别地，该表显示了序列的SEQIDN0,考虑其在本发明方法中的功能的序列名称和序列本身。[0112]在所附的序列表中提供了本发明的序列。被包含在所附序列表中的序列应理解为被并入本说明书中。[0113]还应认为本发明的主题包括特征为与在表I中列出并全文在所附的序列表中描述的SEQID从：1-23具有至少70%、80%、85%、90%或95%同一性的序列。[0119]根据本发明的方法，在同一扩增反应中将存在至少两种不同的标记的探针，每种探针具有不同的荧光团，并且各自与一个等位基因互补，所述等位基因如果突变，则引起抗生素抗性。因此，在两种荧光团之一的特定波长的荧光增加与给定等位基因的纯合状态匹配，而在两种波长的荧光发射与杂合性状态匹配。[0120]本发明的主题还涉及用于实施根据本发明的方法的试剂盒，即用于确定监测个体中Hp感染并同时确定Hp菌株的抗生素抗性的试剂盒。因此，试剂盒还使得能够确定与Hp感染相关的病状，首先是影响胃系统的病状，优选地胃炎、消化性溃疡、胃癌或MLT淋巴瘤、消化不良、缺铁性贫血、特发性血小板减少性紫癜、以及胃十二指肠外病理。[0121]在本发明的一个实施方案中，本发明的试剂盒包含至少一对寡核苷酸（引物对和至少两种寡核苷酸探针，其中所述引物对在至少一个Hp基因的DNA区域中配对，所述DNA区域包含负责对抗生素的抗性的至少一个突变位点，特别是跨越所述至少一个突变位点，所述寡核苷酸探针用两种不同的标记物标记，并且其中至少一种寡核苷酸探针与所述基因的正常等位基因的基因区域的一部分互补并且对该部分是特异性的，且至少一种寡核苷酸探针与所述基因的负责所述抗生素抗性的突变等位基因的基因区域的一部分互补并且对该部分是特异的。[0122]在本发明的一个优选实施方案中，用于确定从个体分离的生物样品中的Hp和或用于确定由选自以下组成的组的23SrRNA基因突变引起的所述Hp对克拉霉素的抗性：A2143G、A2142C和A2142G;和或由选自以下组成的组的gyrA基因突变引起的所述Hp对左氧氟沙星的抗性26^工2616、62714、62711'2726;和或由选自04134和04136组成的组的PBP-1基因突变引起的所述Hp对阿莫西林的抗性的试剂盒，包括：[0123]-至少一对引物，用于通过实时PCR扩增至少一个Hp基因的至少一部分，所述至少一个Hp基因的至少一部分包含至少一个负责对所述抗生素的抗性的突变位点，所述引物对选自：用于23SrRNA基因的SEQIDN0:5和6;用于gyrA基因的SEQIDN0:9和10;和用于pbp-Ι基因的SEQIDNO:13和14;和[0124]-至少两种用两种不同标记物标记的寡核苷酸探针，并且其中至少一种寡核苷酸探针与包含至少一个负责对所述抗生素的抗性的突变位点的至少一个Hp基因的正常等位基因的至少一部分互补并且对该部分是特异性的，且至少一种寡核苷酸探针与至少一个Hp基因的包含至少一个负责对所述抗生素的抗性的突变位点的突变等位基因的至少一部分互补并且对该部分是特异性的，所述寡核苷酸探针选自SEQIDNO:13-23组成的组，其中：[0125]-SEQIDNO:13和或14与引物对SEQIDNO:5和6—起使用，且SEQIDNO:13与无负责克拉霉素抗性的突变的23SrRNA基因的至少一部分，优选地SEQIDNO:1和或2互补；且SEQIDNO:14与23SrRNA基因的具有负责克拉霉素抗性的突变的至少一部分，优选地SEQIDNO:1和或2互补，所述负责克拉霉素抗性的突变选自由以下组成的组:A2143G、A21423A2142G;[0126]-SEQIDNO:15、16和17与引物对SEQIDNO:7和8—起使用，且SEQIDNO:15与无负责左氧氟沙星抗性的突变的gyrA基因的至少一部分，优选地SEQIDNO:3互补；SEQIDNO:16和或17与gyrA基因的具有负责左氧氟沙星抗性的Asn87Lys突变的至少一部分，优选地SEQIDNO:3互补；[0127]-SEQIDNO:18、19和20与引物对SEQIDNO:9和10—起使用，且SEQIDNO:18与无负责左氧氟沙星抗性的突变的gyrA基因的至少一部分，优选地SEQIDN0:3互补；SEQIDNO:19与gyrA基因的具有Asp91Gly突变的至少一部分互补;和或SEQIDNO:20与gyrA基因的具有负责左氧氟沙星抗性的Asp91Ty突变的至少一部分，优选地SEQIDNO:3互补；[0128]-SEQIDN0:21、22和23与引物对SEQIDN0:11和12—起使用，且SEQIDN0:21与无负责阿莫西林抗性的突变的Pbp-I基因的至少一部分，优选地SEQIDN0:4互补；且SEQID勵:22和或23与??-1基因的具有负责阿莫西林抗性的5虹4134作突变的至少一部分互补。[0129]任选地存在于试剂盒中的还有至少一种酶和至少一种缓冲液，例如酶诸如DNA聚合酶、核苷酸、阳性对照序列、阴性对照序列等。实施例[0130]细菌DNA的提取。[0131]将约200mg粪便溶解于2ml磷酸盐缓冲盐水PBS中。[0132]随后，通过在Vortex混合器上振荡约30秒使溶解的粪便均质化。[0133]然后用无菌注射器抽取500μ1匀浆并转移到新的1.5ml试管中。向匀浆加入500μ1Triazol，将其剧烈混合几秒钟。[0134]随后，将100μ1氯仿加入到匀浆-Triazol混合物，将其剧烈混合15秒并在4°C以12000g离心15分钟。[0135]该处理导致形成三个不同的相:水相表面）、中间相（中间）和苯酚相底部）。[0136]弃去水相。[0137]向含有DNA的剩余相（中间相和苯酚相加入150μ1100%乙醇。通过倒置混合样品并在室温孵育2-3分钟。[0138]随后，通过在4°C以2000g离心2分钟使DNA沉降。[0139]然后除去含有蛋白的表面相，并向DNA团块加入Iml柠檬酸钠，将其在室温孵育30分钟。在该处理之后，将样品在4°C以2000g离心5分钟并除去上清液。[0140]重复柠檬酸钠步骤2次；[0141]然后向团块加入2ml75%乙醇，将其在室温孵育20分钟，并在4°C以2000g离心5分钟。完全除去乙醇，并留下DNA团块干燥15-20分钟。[0142]将DNA团块溶解在500μ1的8mMNaOH中。然后将溶解的样品在室温以HOOOg离心10分钟以除去不溶物质。在离心步骤结束时，将上清液转移到新的试管中，并将DNA重悬于60μ1的0·IMHEPES和5·5μ1的IOOmMEDTA中。[0143]幽门螺杆菌23SrRNA序列核苷酸序列）的初步组装[0144]SEQIDNO:1是幽门螺杆菌的23SrRNA基因的核苷酸序列。[0145]该序列是负责对克拉霉素的抗性的点突变的位点。[0146]基因分型实验是用于确定未知样品的基因型的终点实验。通过这种类型的实验，可能区分由于单核苷酸突变引起的多态性SNP，如幽门螺杆菌的情况。[0147]特别是，在对克拉霉素抗性的情况下，基因分型实验的目的是确定未知样品是否为：[0M8]•对A纯合具有不携带突变的核苷酸序列的样品[0149]•对G纯合具有携带突变的核苷酸序列的样品[0150]•杂合具有在一个等位基因上携带突变且在另一个等位基因上不携带突变的核苷酸序列的样品）[0151]用于基因分型实验的PCR反应包括以下组分：[0152]•阴性对照-含有水或缓冲液而非样品的样本也称为无模板对照-NTC。阴性对照将不经历扩增。[0153]•阳性对照-含有已知基因型的样本。[0154]•样品-其中目标基因型未知的样本。[0155]•重复-包含相同组分和体积的相同反应。[0156]基因分型实验要求两个步骤：[0157]⑴热循环PCR扩增）；和[0158]ii信号终点检测。[0159]对于大规模突变的基因分型，使用TaqMaii®化学品的实时PCR方法。必须用合适的引物预先扩增靶序列。位于两个引物之间的探针识别含有感兴趣突变的序列。[0160]下面显示的是SEQIDN0:2,即含有AG突变位置的23SrRNA基因的DNA序列部分，AG突变引起Hp的克拉霉素抗性。[0161]引物的位置以粗体显示，且探针以灰色突出显示。可以看出，引物跨越含有负责克拉霉素抗性的可能突变位点的区域，并且探针与该区域的可能的突变的位点所在的一部分精确地互补（即与其配对）。[0163]因此用于PCR的引物如下：[0165]使用的探针为：[0167]特别地，用荧光团VIC标记的探针用于区分碱基A，而用荧光团FAM标记的探针用于区分碱基G在突变的情况下）。[0168]在双等位系统中，如在所讨论的情况下，在相同的反应中，存在标记有不同的荧光团（在这种情况下对于正常等位基因是FAM™，且对于突变等位基因是VIC™的两种不同的探针，每个与正在分析的SNP的等位基因之一互补。在配对退火阶段期间，每个探针将与其特异性链杂交。结果将是，两种荧光标记物荧光团）之一的特定波长处的荧光增加，其与给定等位基因的纯合状态相匹配;而在两种波长的荧光发射与杂合性状态相匹配。[0169]通常，只有它们通过质量控制测试才合成等位基因鉴别测定：[0170]•每个引物和每种寡核苷酸探针通过质谱法单独测试以验证正确的合成；[0171]•必须产生至少一个易于解释的等位基因鉴别簇，即至少一组从其组成和或位置的角度来看，彼此相似或相近的单位;例如，在这种情况下，它是基因簇或具有相同遗传组成的一组相似或密切相关的产物例如显示突变的幽门螺杆菌的一组样品和或具有正常野生型幽门螺杆菌的一组样品）；[0172]•其引物和寡核苷酸探针未达到性能标准的测定不能通过质量控制测试；[0173]•在有关的SNP旁边的序列已经过格式化、验证和排序。[0174]如前所述，在基因分型实验中，PCR包括针对每个等位基因的用荧光标记物（荧光团）标记的特异性探针包括多态性位点的短核苷酸序列）。每个探针含有不同的高强度荧光标记物荧光报道物），用于区分每个等位基因。[0175]可能在我们拥有的AppliedBiosystems7900HT系统上使用TaqMan®小沟结合物MGB探针。[0176]每个MGBTaqMan®探针包含：[0177]•在每个探针5’末端的荧光染料报道物；[0178]-在这种情况下，荧光染料VIC®与野生型等位基因探针的5’末端键合；[0179]-荧光染料FAM™与突变等位基因探针的5’末端键合；[0180]•小沟结合物MGB。[0181]MGB化学性质增加探针的解链温度Tm而不增加它们的长度Afonina等，1997;Kutyavin等，1997，因此使得能够设计更短的探针。因此，TaqManMGB探针显示配对和未配对探针之间Tm值的更大差异;Tm值的更大差异提供了准确的基因分型。[0182]•在探针3’末端的非荧光猝灭剂NFQ。[0183]在所讨论的情况下，在96孔光学读板上建立实时PCR，其中每孔加入以下量的样品：[0185]TaqMan®LniversalPCRMasterMixAppliedBiosystems，FosterCity,CA包含缓冲液、dNTP和TaqGold聚合酶。[0186]SNP基因分型测定包含两个引物正向和反向）和对每个等位基因特异性的探针，一个在5’末端用荧光标记物FAM™标记-具有红色荧光，另一个用荧光标记物VIO®标记-具有绿色荧光。[0187]在以下实验条件下扩增DNA:[0188]-读数前在60°C1分钟：以检测初始的荧光发射[0189]-在50°C2分钟[0190]-在95°C10分钟[0191]-在95°C15秒[0192]-在60°C1分钟。40个循环[0193]-读数后在60°C1分钟：以检测三种不同基因型的聚类。[0194]使用提供的SDS软件分析和读取结果。[0195]通过将上述测试与目前可用于诊断幽门螺杆菌感染的侵入性和非侵入性检查进行比较来评估该方法的灵敏度和特异性。[0196]分析了一组组织学上对Hp阳性的患者。[0197]为此，我们将上述方法与目前被认为是Hp诊断的金标准的测试，即组织学检查，和从组织中提取的DNA进行了比较。分析了72名Hp阳性患者。[0198]从石蜡包埋的组织提取细菌DNA，并进行上述分子分析，用于鉴定负责抗性的突变。[0199]两种分子分析之间的一致性是100%。[0200]鉴于存在少量仅通过分子分析可检测到的假阴性，与组织学诊断的一致性为92%〇[0201]我们的测试和粪便抗原Ag测试之间的比较显示68%的一致性。[0202]因此，本发明的分子方法还使得能够鉴定由组织学检查和使用的其他方法奠便Ag产生的少数但显著的假阴性。[0203]A2143G突变的频率为26%，与文献中的数据一致。

权利要求：1.一种用于确定从个体分离的生物样品中的幽门螺杆菌Helicobacterpylori和或用于确定所述幽门螺杆菌对至少一种抗生素的抗性的体外方法，所述方法包括以下步骤：1.获得从个体分离的生物样品；II.从所述样品纯化分离DNA;和III.扩增幽门螺杆菌的至少一个基因的至少一部分，所述至少一个基因的至少一部分包含负责对所述抗生素的抗性的至少一个突变位点，所述扩增通过实时PCR，使用至少一对寡核苷酸（引物对和至少两种寡核苷酸探针进行，其中所述引物对在跨越所述突变位点的DNA区域中杂交，且其中每种寡核苷酸探针在5’和3’末端用两种不同标记物标记，并且其中至少一种寡核苷酸探针与所述基因的野生型等位基因的至少一个基因部分互补并对该基因部分是特异性的，并且至少一种寡核苷酸探针与所述基因的负责所述抗生素抗性的突变等位基因的至少一个基因部分互补并对该基因部分是特异性的；IV.通过以优选地PCR循环阈值测量标记所述寡核苷酸探针的标记物的水平，来定量扩增的野生型和或突变的DNA，其中仅标记与所述野生型等位基因的至少一个基因部分互补并对该基因部分特异的探针的标记物的存在界定了正常的纯合基因型，且因此界定了对所述抗生素无抗性的所述Hp的存在;仅标记与所述基因的突变等位基因的至少一个基因部分互补并对该基因部分特异的探针的标记物的存在界定了突变的纯合基因型，且因此界定了对所述抗生素具有抗性的所述Hp的存在;并且两种标记物的存在界定了具有所述基因的野生型等位基因和突变等位基因的杂合基因型，且因此界定了对所述抗生素具有抗性的所述Hp的存在。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物样品是粪便样品。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述抗生素选自由以下组成的组:克拉霉素、左氧氟沙星、阿莫西林、甲硝唑、替硝唑、四环素、利福布汀及其组合。4.根据权利要求1-3的任一项所述的方法，其中每种寡核苷酸探针在5’末端用高强度荧光标记物报道物标记，且在3’末端用非荧光或低强度标记物猝灭剂标记。5.根据权利要求1-4的任一项所述的方法，其中所述标记物选自：VIC、FAM、HEX、JOE、NED、SYBER、TAMRA、TET和ROX。6.根据权利要求1-5的任一项所述的方法，其中幽门螺杆菌的所述基因选自：23SrRNA、gyrA和pbp-1。7.根据权利要求1-6的任一项所述的方法，其中所述突变是点突变或单核苷酸多态性SNP〇8.根据权利要求1-7的任一项所述的方法，其中所述突变选自：23SrRNA基因的A2143G、A2142C和A2142G;gyrA基因的〇261厶、〇2616、6271厶、62711'和厶2726;和口匕口-1基因的〇413八和C413G，23SrRNA基因的所述突变负责所述Hp的克拉霉素抗性，gyrA基因的所述突变负责所述Hp的左氧氟沙星抗性，且pbp-Ι基因的所述突变负责所述Hp的阿莫西林抗性。9.根据权利要求1-8的任一项所述的方法，其中幽门螺杆菌的至少一个基因的所述至少一部分选自SEQIDNO:1-4或其组合，SEQIDNO:1和2是关于23SrRNA基因的，SEQIDNO:3是关于gyrA基因的且SEQIDNO:4是关于pbp-Ι基因的。10.根据权利要求1-9的任一项所述的方法，其中所述至少一对引物选自由以下组成的组：SEQIDN0:5-14,其中SEQIDN0:5和6用于扩增23SrRNA基因的所述至少一部分，优选地SEQIDNO:1和或2;SEQIDNO:9和10用于扩增gyrA基因的所述至少一部分，优选地SEQIDNO:3;且SEQIDNO:13和14用于扩增pbp-Ι基因的所述至少一部分，优选地SEQIDNO:4〇11.根据权利要求1-10的任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸探针被修饰具有小沟结合物化学性质。12.根据权利要求1-11的任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸探针选自由以下组成的组：SEQIDNO:13-23:-SEQIDNO:13和或14与引物对SEQIDN0:5和6—起使用，且：SEQIDNO:13与无负责抗生素抗性的突变的23SrRNA基因的至少一部分，优选地SEQIDNO:1和或2互补；且SEQIDNO:14与23SrRNA基因的具有负责克拉霉素抗性的突变的至少一部分，优选地SEQIDN0:1和或2互补，所述负责克拉霉素抗性的突变选自A2143G、A2142C和A2142G;-SEQIDNO:15、16和17与引物对SEQIDN0:7和8—起使用，且：SEQIDNO:15与无负责左氧氟沙星抗性的突变的gyrA基因的至少一部分，优选地SEQIDNO:3互补；且SEQIDNO:16和或17与gyrA基因的具有负责左氧氟沙星抗性的Asn87Lys突变的至少一部分，优选地SEQIDNO:3互补；-SEQIDNO:18、19和20与引物对SEQIDN0:9和10—起使用，且：SEQIDNO:18与无负责左氧氟沙星抗性的突变的gyrA基因的至少一部分，优选地SEQIDNO:3互补;SEQIDNO:19与gyrA基因的具有负责左氧氟沙星抗性的Asp91Gly突变的至少一部分互补；和SSEQIDNO:20与gyrA基因的具有负责左氧氟沙星抗性的Asp91Ty突变的至少一部分，优选地SEQIDNO:3互补；-SEQIDN0:21、22和23与引物对SEQIDN0:11和12—起使用，且：SEQIDN0:21与无负责阿莫西林抗性的突变的pbp-1基因的至少一部分，优选地SEQIDN0:4互补；SEQID从:22和或23与?口-1基因的具有负责阿莫西林抗性的3614134作突变的至少一部分互补。13.—种用于确定从个体分离的生物样品中的幽门螺杆菌和或用于确定由选自以下组成的组的23SrRNA基因突变引起的所述幽门螺杆菌对克拉霉素的抗性:A2143G、A2142C和A2142G;和或由选自以下组成的组的gyrA基因突变引起的所述幽门螺杆菌对左氧氟沙星的抗性:026^、02616、627^、62711'和42726;和或由选自04134和04136组成的组的口匕口-1基因突变引起的所述幽门螺杆菌对阿莫西林的抗性的试剂盒，所述试剂盒包含：-至少一对引物，用于通过实时PCR扩增至少一个幽门螺杆菌基因的至少一部分，所述至少一个幽门螺杆菌基因的至少一部分包含至少一个负责对所述抗生素的抗性的突变位点，所述引物对选自：用于23SrRNA基因的SEQIDN0:5和6;用于gyrA基因的SEQIDN0:9和10;和用于pbp-1基因的SEQIDNO:13和14;和-至少两种用两种不同标记物标记的寡核苷酸探针，并且其中至少一种寡核苷酸探针与包含负责至少一个对所述抗生素的抗性的突变位点的至少一个幽门螺杆菌基因的野生型等位基因的至少一部分互补并且对该部分是特异性的，且至少一种寡核苷酸探针与至少一个幽门螺杆菌基因的包含至少一个负责对所述抗生素的抗性的突变位点的突变等位基因的至少一部分互补并且对该部分是特异性的，所述寡核苷酸探针选自SEQIDNO:13-23组成的组，其中：-SEQIDNO:13和或14与引物对SEQIDN0:5和6—起使用，且：SEQIDNO:13与无负责克拉霉素抗性的突变的23SrRNA基因的至少一部分，优选地SEQIDNO:1和或2互补;且SEQIDNO:14与23SrRNA基因的具有负责克拉霉素抗性的突变的至少一部分，优选地SEQIDN0:1和或2互补，所述负责克拉霉素抗性的突变选自由以下组成的组:A2143G、A2142C和A2142G;-SEQIDNO:15、16和17与引物对SEQIDN0:7和8—起使用，且：SEQIDNO:15与无负责左氧氟沙星抗性的突变的gyrA基因的至少一部分，优选地SEQIDNO:3互补；且SEQIDNO:16和或17与gyrA基因的具有负责左氧氟沙星抗性的Asn87Lys突变的至少一部分，优选地SEQIDNO:3互补；-SEQIDNO:18、19和20与引物对SEQIDN0:9和10—起使用，且：SEQIDNO:18与无负责左氧氟沙星抗性的突变的gyrA基因的至少一部分，优选地SEQIDNO:3互补;SEQIDNO:19与gyrA基因的具有Asp91Gly突变的至少一部分互补；和或SEQIDN0:20与gyrA基因的具有负责左氧氟沙星抗性的Asp91Ty突变的至少一部分，优选地SEQIDNO:3互补；-SEQIDN0:21、22和23与引物对SEQIDN0:11和12—起使用，且：SEQIDN0:21与无负责阿莫西林抗性的突变的pbp-1基因的至少一部分，优选地SEQIDNO:4互补;且SEQID从:22和或23与?口-1基因的具有负责阿莫西林抗性的3614134作突变的至少一部分互补。

百度查询： THD股份公司 用于确定幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)的方法

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