申请/专利权人：天津大学

申请日：2016-06-08

公开（公告）日：2019-01-18

公开（公告）号：CN105919989B

主分类号：A61K31/235(2006.01)I

分类号：A61K31/235(2006.01)I;A61P35/00(2006.01)I;A61P37/02(2006.01)I

优先权：

专利状态码：失效-未缴年费专利权终止

法律状态：2022.06.10#未缴年费专利权终止;2016.10.05#实质审查的生效;2016.09.07#公开

摘要：本发明公开了2R,3R‑二苯甲酰酒石酸在制备BLyS拮抗剂的用途，竞争ELISA实验结果表明：2R,3R‑二苯甲酰酒石酸能够抑制BLyS与TACI‑Fc的结合。抑制作用与2R,3R‑二苯甲酰酒石酸的浓度呈正相关。2R,3R‑二苯甲酰酒石酸能够抑制BLyS与BCMA‑Fc的结合；抑制作用与2R,3R‑二苯甲酰酒石酸的浓度呈正相关。2R,3R‑二苯甲酰酒石酸可以作为潜在的BLyS小分子拮抗剂。

主权项：1.2R,3R‑二苯甲酰酒石酸在制备B淋巴细胞刺激因子BLyS拮抗剂的用途。

全文数据：2R,3R-二苯甲酰酒石酸在制备BLyS拮抗剂的用途技术领域本发明属于生物医药领域，涉及2R,3R-二苯甲酰酒石酸在制备BLyS拮抗剂的用途。背景技术B淋巴细胞刺激因子Blymphocytestimulator,BLyS，又称为B细胞激活因子BcellactivatingfactorbelongingtotheTNFfamily,BAFF，是TNF家族中的一员。由单核细胞和巨噬细胞持续合成、分泌。BLyS能够结合B细胞表面的三种受体，B细胞成熟抗原Bcellmatureantigen,BCMA，跨膜激活物和CAML结合物TransmembraneactivatorandCAML-interactor,TACI以及BAFF受体3BR3。受体结合BAFF后，减少成熟B细胞的凋亡。如果敲除BAFF，小鼠体内的成熟B细胞完全缺失。由于BLyS在B淋巴细胞活化、增殖中发挥重要作用，而B淋巴细胞产生的抗体所介导的体液免疫在众多已发现的自身免疫性疾病当中处于中心地位。目前认为BLyS在体内的过量表达与某些自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮SLE、类风湿性关节炎RA等病程的发生、发展密切相关。因此，以阻断BLyS生物学功能为策略，探讨BLyS抑制拮抗剂治疗系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎等自身免疫性疾病和B细胞肿瘤疾病的研究正在国外如火如荼的进行中。目前，针对BLyS的抑制剂的研究主要集中在研制具有中和BLyS作用的BLyS诱饵受体decoyreceptor、抗BLyS抗体和拮抗肽[1-3]。2011年3月美国FDA批准由人类基因科学公司HumanGenomeSciences和葛兰士-史克GlaxoSmithKline公司联合研发的抗BLyS抗体BENLYSTABelimumab治疗系统性红斑狼疮。这是50年来，FDA首次批准治疗该类疾病的药物。但是蛋白抑制剂作为治疗药物具有一定的局限性，例如来源较少和分离纯化难度大以及药物稳定性较差，另外还存在口服的生物利用度较低，主要是因为体内各种酶对多肽类药物的降解性高，从而会导致这一类药物的作用半衰期大大缩短。因此，开发小分子化合物作为BLyS抑制剂的研究具有重要的现实意义。目前，尚未有2R,3R-二苯甲酰酒石酸在制备BLyS拮抗剂的用途的报道。1.JianSun*孙剑,ZhouLin,JiannanFeng,YanLi,BeifenShen.2008BAFF-targetingtherapy,apromisingstrategyfortreatingautoimmunediseases.EurJPharmacol597:1–5.2.YacongZhao,XiafeiHao,JiannanFeng,BeifenShen,JingWei*魏静,JianSun*孙剑2015,ThecomparisonofBLyS-bindingpeptidesfromphagedisplaylibraryandcomputer-aideddesignonBLyS–TACIinteraction.IntImmunopharmacol,24:219–223.3.XiafeiHao,YanfengZhu,ChangZheng,XuegangFu,JiannanFeng,BeifenShen,JingWei*魏静,JianSun*孙剑.AcomparisonofbiologicalactivityofBlymphocytestimulatorBLySantagonistpeptibodiesandtheelucidationofpossibleBLySbindingsites.Protein&PeptideLetters,2016,23,17-234.XuegangFu,LiyanXuan,YuzheWang,JingWei*魏静,JianSun*孙剑.MolecularmechanismoftheaffinityinteractionsbetweenBAFFanditspeptidesbymolecularsimulations.Protein&PeptideLetters,2015,22,992-999.发明内容本发明的目的是克服现有技术的不足，提供2R,3R-二苯甲酰酒石酸在制备BLyS拮抗剂药物的用途。本发明的技术方案概述如下：2R,3R-二苯甲酰酒石酸在制备BLyS拮抗剂的用途。本发明的优点：1.对于BLyS结合TACI具有显著抑制作用竞争ELISA实验结果表明：2R,3R-二苯甲酰酒石酸浓度在1mgmL时能够抑制2.71±2.51％BLyS与TACI-Fc的结合；在3mgmL时能够抑制12.36±6.38％BLyS与TACI-Fc的结合；在5mgmL时能够抑制79.68±2.68％BLyS与TACI-Fc的结合。抑制作用与2R,3R-二苯甲酰酒石酸抑制剂的浓度呈正相关。非结合BAFF的小分子化合物苯甲酸，即阴性对照，对BLyS与TACI的相互作用没有明显抑制作用、且没有剂量依赖关系。证明2R,3R-二苯甲酰酒石酸的抑制作用是特异和有效的。2.对于BLyS结合BCMA具有显著抑制作用竞争ELISA实验结果表明：2R,3R-二苯甲酰酒石酸浓度在1mgmL时能够抑制5.59±2.01％BLyS与BCMA-Fc的结合；在3mgmL时能够抑制8.91±4.36％BLyS与BCMA-Fc的结合；在5mgmL时能够抑制83.72±0.89％BLyS与BCMA-Fc的结合。抑制作用与2R,3R-二苯甲酰酒石酸的浓度呈正相关。阴性对照化合物苯甲酸对BLyS与BCMA的相互作用没有明显抑制作用、且没有剂量依赖关系。证明2R,3R-二苯甲酰酒石酸的抑制作用是特异和有效的。附图说明图1为BLyS结合受体的关键残基，其中+表示关键残基。图2为BLyS结合口袋的分子表面和关键残基，D1表示保守性结合区域，D2表示特异性结合区域。图3为虚拟筛选流程图。图4为2R,3R-二苯甲酰酒石酸结构式。图5为2R,3R-二苯甲酰酒石酸与BLyS的相互作用的模式。图6为2R,3R-二苯甲酰酒石酸抑制TACI对BLyS的结合作用。**代表p0.01；没有星号代表p0.05。图7为2R,3R-二苯甲酰酒石酸抑制BCMA对BLyS的结合作用。**代表p0.01。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。众多研究已经详细阐述BLyS与受体相互作用的可能模式及关键氨基酸。我们在前期工作中通过分子动力学模拟，基于BLyS和其受体BCMA的晶体结构，通过计算机模拟BLyS与其三个天然受体的相互作用模式，探究其参与保守性结合作用和亲和力选择性的关键残基。在此基础上，利用“锁钥原理”，针对关键结合区域进行商业化化学小分子数据库进行分子虚拟筛选，预测得到一系列具有潜在抑制作用的小分子化合物，获得其实体并进行体外活性测定发现，二元酸类化合物2R,3R-二苯甲酰酒石酸具有一定的抑制BLyS结合TACI和BCMA的作用。为开发有临床应用前景的新药先导药物奠定了实验研究基础。下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。本发明的实施例是为了使本领域的技术人员能够实施，但并不对本发明作任何限制。其中的常用试剂的公开了是为了使本领域的技术人员更好的实施本发明，但并不对本发明作任何限制。BLyS蛋白：孙剑,黎燕,冯建男,孙瑛勋,胡美茹,沈倍奋,.人可溶性B淋巴细胞刺激因子基因的克隆及在大肠杆菌中的表达[J].细胞与分子免疫学杂志,2006,2SEQIDNO.8所示。TACI-Fc蛋白：冀丽军,白乌仁图雅,柴琳,孙剑,.TACI-Fc融合蛋白的基因构建、原核表达及生物活性鉴定[J].生物技术,2013,3.SEQIDNO.9所示BCMA-Fc蛋白：孙剑,冯建男,林周，黎燕,沈倍奋.计算机辅助设计可溶性BLyS受体,eBCMA-Fc融合蛋白及其在大肠杆菌中的表达.中国生物化学与分子生物学报,2008,242SEQIDNO.9所示。Fc蛋白：吴真.BCMA-Fc作为潜在药物的研究[D].天津大学,2012SEQIDNO.10所示包被液：称量出33.6g碳酸氢钠和63.6g无水碳酸钠,将其放入烧杯中，向内加入600ml蒸馏水，搅拌至溶质全部溶解，再加入蒸馏水中定容到1L。将其放在4℃下保存。PBST的配制：取250μl吐温-20加入500ml的1×PBS中，混合均匀至完全融合。在室温下保存。5％脱脂奶粉的配制：称取脱脂奶粉1g，搅拌下溶解于10ml0.01MPBS中，加PBS定容至20ml，于4℃保存TMB显色液：取4.95ml底物缓冲液，0.05ml1％TMB储液，临用前加入5μl30％过氧化氢。1％TMB储液：称取1gTMB，搅拌下充分溶解于80mlDMSO中，加DMSO定容至100ml，保存于4℃。底物缓冲液pH5.0：取24.3ml0.1M柠檬酸，25.7ml0.2M磷酸氢二钠，加入约40ml水，调pH至5.0，再加水定容至100ml，保存于室温。TMB工作液现配现用。实施例1：用计算机模拟筛选技术，筛选出BLyS相关小分子化合物。蛋白结构信息获取：从ProteinDateBank蛋白质数据库http:www.rcsb.orgpdb中下载BLyS蛋白结构PDBID：1OQD和1OQE。采用分子动力学等计算方法，从分子水平上探究BLyS与其天然受体BCMA，TACI，BR3的相互作用机制。根据每个氨基酸残基对结合能贡献大小，确定其关键残基。图1和图2分别显示了BLyS靶点天然受体的关键作用残基，以及BLyS靶点的结合口袋和关键残基的相关信息。小分子数据库的获得：小分子数据库含有近万个结构不同的化合物，其主要来源于两个途径：天然产物数据库或商用小分子数据库中的小分子，课题组合成得到的系列化合物。商用小分子数据库主要指百灵威J&K、阿法埃莎Alfa-Aesar、西格玛奥德里奇Sigma-Aldrich三家试剂公司网站得到。对三维小分子结构进行加氢、加电荷处理后，将文件保存成pdbqt文件格式，进行进一步的分子对接研究。虚拟筛选：借助AutoDock4.2软件，将数据库中所有小分子与BLyS活性中心区域进行筛选对接计算。分子对接过程中，将三维小分子结构数据逐一放在BLyS的活性位点处，通过不断优化小分子模型的位置、构象、分子内部可旋转键的二面角，寻找化合物与BLyS作用的最佳构象，并预测其结合模式。分析对接结果，根据给出的小分子预测结合分值，考察化合物与BLyS结合中心的匹配度，以及与关键氨基酸相互关系情况，筛选出潜在具有BLyS亲和力的小分子候选化合物。分值越大，代表化合物与BLyS的亲和力越高，即化合物可能有较好的亲和力。选择综合评价最佳的化合物，获得化合物实体，并进行ELISA实验。图3中描述了虚拟筛选的流程图。实施例2：计算机分析小分子拮抗剂和BLyS结合模式。利用计算机分子对接方法，结合Chimera软件探讨了2R,3R-二苯甲酰酒石酸结构式参见图4与BLyS分子机制研究，分析其与BLyS相互识别的关键氨基酸残基以及关键相互作用图5。发现2R,3R-二苯甲酰酒石酸的一个苯环插入到BLyS的保守性疏水口袋，与His69，Leu70和Ile92形成疏水相互作用，并与Arg124和Arg90残基侧链形成π-cation作用，共同加强小分子2R,3R-二苯甲酰酒石酸与BLyS的结合作用；两个羧基与BLyS的关键残基Arg124和Arg90形成稳定的盐桥作用；另外一个苄位的羰基与Arg124形成氢键相互作用。实施例3：竞争ELISA分析化合物对于BLyS结合TACIBCMA蛋白的抑制作用。如果化合物2R,3R-二苯甲酰酒石酸可以与TACIBCMA竞争结合BLyS活性口袋，则加入的化合物2R,3R-二苯甲酰酒石酸会抑制BLyS结合TACIBCMA；相反，如果化合物2R,3R-二苯甲酰酒石酸不结合BLyS，也就不存在与TACIBCMA竞争。则加入化合物2R,3R-二苯甲酰酒石酸对BLyS结合TACIBCMA没有影响。因此，通过竞争抑制ELISA实验，来测试小分子2R,3R-二苯甲酰酒石酸阻断BLyS与受体TACI和BCMA结合的作用。首先，按常规ELISA方法做BLyS与TACI-FcBCMA-Fc结合的ELISA。确定竞争抑制ELISA实验中使用TACI-FcBCMA-Fc的浓度。最终确定浓度是10μgmL。竞争抑制ELISA的具体操作步骤如下：a包被：20gmL的BLyS与包被液按1:1稀释，制备10μgmL的BLyS液。将稀释的BLyS液按50微升孔包被96孔板。4℃过夜。b洗板后，用5％的脱脂奶粉室温封闭2小时。c洗板，再将10gmL的TACI-Fc或BCMA-Fc与不同体积的2R,3R-二苯甲酰酒石酸水溶液混合，制备小分子化合物2R,3R-二苯甲酰酒石酸终浓度梯度为0、1、3和5mgmL的混合溶液，每孔加入50微升。37℃，温育1小时。未加小分子溶液的混合溶液作为空白对照组。苯甲酸为阴性对照化合物。d洗板，加入HRP标记羊抗人2抗按说明书稀释。e洗板后加入TMB显色剂显色。f终止反应，测450纳米的OD值。化合物竞争BLyS与TACI-FcBCMS-Fc的相互作用的抑制效果用下述公式计算：抑制率％＝[空白对照组OD450-实验组OD450空白对照组OD450]*100％。抑制率见图6和图7

权利要求：1.2R,3R-二苯甲酰酒石酸在制备B淋巴细胞刺激因子BLyS拮抗剂的用途。

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