申请/专利权人：南方医科大学

申请日：2018-08-21

公开（公告）日：2019-01-11

公开（公告）号：CN109180805A

主分类号：C07K14/705(2006.01)I

分类号：C07K14/705(2006.01)I;C12N15/12(2006.01)I

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.12.28#授权;2019.02.12#实质审查的生效;2019.01.11#公开

摘要：本发明公开了一种新型SynNotch合成受体及其编码基因。该SynNotch合成受体包含anti‑CD19scFV、斑马鱼Notch核心片段和GAL‑VP64片段，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，对应的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。经本发明改造后的synNotch受体系统，可以更高效的激活下游基因的表达。调控Mcherry荧光蛋白表达的平均荧光强度与原来的synNotch受体系统比较，改造后的synNotch受体系统可以有4.9倍的提升。本发明改造后的synNotch受体可扩展synNotch的应用范围，为细胞改造提供了新的应用前景，具有潜在的重要经济价值和意义。

主权项：1.一种新型SynNotch合成受体，包括胞外域、Notch跨膜核心域和胞内域，其特征在于，所述的Notch跨膜核心域是斑马鱼Notch跨膜核心域。

全文数据：新型SynNotch合成受体及其编码基因技术领域本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种新型SynNotch合成受体及其编码基因。背景技术随着合成生物学和细胞改造的兴起，学术界追求的一个基本目标是让细胞可以识别胞外特定信号并作出特定的反应。在自定义的细胞识别反应系统中，细胞识别机体特定疾病或损伤信号后可起相应的响应，从而得到治疗或修复作用。一个成功的例子就是，CAR-T疗法已经被批准临床用于治疗血液肿瘤。机体细胞表面有许多受体，如何将胞外信号传导入胞内，这也就是科学家们改造细胞的研究热点之一。利用不同的受体类型，研究者们设计出了两大类的受体系统，能够识别可溶性小分子的受体系统和可以识别细胞膜表面配体的受体系统。为了可以灵活改变细胞的输入和输出，以及实现不同输入和输出的组合，WendellA.Lim团队基于Notch信号通路设计出了SynNotch受体系统Morsut,etal.2016。该受体系统可以识别细胞膜表面配体，具有可调控性、简易性、正交性、普适性等特征，是细胞改造的一个强大工具。传统的Notch信号通路包括Notch受体、Notch配体、细胞内效应分子、DNA结合蛋白、受调控的下游基因等。Notch受体是跨膜受体，当胞外域结合到Notch配体后，细胞运动致使S2位点暴露，被金属蛋白酶等识别切割，释放胞内段入核，从而启动下游基因表达。WendellA.Lim团队改造了鼠的Notch1受体，将其胞外域用单链抗体或者纳米抗体替换，胞内域用转录激活或转录抑制的结构域替换，仅保留了可以被蛋白酶识别切割的跨膜核心域，还配备了下游被调控的基因元件。针对不同的疾病或者肿瘤抗原，胞外域采用特异识别该抗原的抗体单链，而胞内域调控预先设定的目标基因或因子的表达。难得的是，在同一细胞中可以设计由不同抗原启动的基因调控环路，并具有很好的正交性。SynNotch系统可以被应用到许多细胞类型中，包括神经细胞、免疫细胞。CAR-T技术和SynNotch系统组合应用到T细胞改造中，可以实现T细胞的与门激活，即只有当细胞同时表达两种特定的表面抗原时，才能将T细胞激活Roybal,etal.2016b。改变SynNotch下游调控的基因元件，T细胞可以在接触特定抗原后，分泌单链抗体、细胞因子等等具有治疗作用的因子，并且在体外、体内都具有抗肿瘤的作用Roybal,etal.2016a。可见SynNotch受体系统，在细胞改造中具有极大的技术优势。原始版的SynNotch系统也具有一些缺点。我们课题组早期在应用该系统时，注意到原始版本的SynNotch被激活后，其下游转录表达调控能力并不是很强，也就是激活下游基因的表达量并不是很高。这样会局限SynNotch的使用，特别是需要要求下游基因或因子能有较高的表达量时。原始版的SynNotch系统，Lim研究组采用鼠的Notch跨膜核心域，它们并没有对这个合成受体进行升级。因此，有必要设计一种新型的SynNotch合成受体，提高SynNotch系统的转录激活效率，使SynNotch被激活后促进下游基因的表达。发明内容本发明的目的是提供一种新型SynNotch合成受体，以增强其对下游基因的激活能力，提高SynNotch系统的应用范围。所述的SynNotch合成受体及其编码基因可显著提高SynNotch系统的转录激活效率，利用该合成受体或编码基因对活体细胞进行改造，让细胞可以识别特定表面抗原，并作出更强烈的特定反应，激活下游基因的表达。本申请人考虑到不同物种和不同家族Notch信号通路其Notch核心区域可能有不同激活能力，通过筛选了人，鼠，斑马鱼，果蝇等Notch跨膜核心域，发现采用斑马鱼Notch3跨膜核心域可以显著提高SynNotch系统对下游基因转录激活的能力和效率，具体地，通过质粒改造的方式将不同物种的Notch跨膜核心域的DNA编码序列连接至胞外与胞内域之间，通过测试我们发现采用斑马鱼Notch跨膜核心域时激活能力及效率最佳。本发明的新型SynNotch合成受体，包括胞外域、Notch跨膜核心域和胞内域，其中，所述的Notch跨膜核心域是斑马鱼Notch跨膜核心域。优选，所述的新型SynNotch合成受体，包括anti-CD19scFV片段、斑马鱼Notch跨膜核心域和GAL-VP64片段。所述的斑马鱼Notch跨膜核心域的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。所述的编码斑马鱼Notch跨膜核心域的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。所述SynNotch合成受体的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示。本发明的第二个目的是提供一种所述的新型SynNotch合成受体的编码基因。所述SynNotch合成受体的编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。一种表达载体，其特征在于，含有所述SynNotch合成受体的编码基因。一种宿主细胞，其特征在于，含有所述的编码基因或所述的表达载体。一种提高细胞识别特定胞外信号的方法，该方法利用所述的SynNotch合成受体或所述的SynNotch合成受体的编码基因对活体细胞进行改造，让细胞可以识别特定表面抗原，并作出更强烈的特定反应，激活下游基因的表达。与现有技术相比，本发明的优势在于：本发明公开了一种采用斑马鱼Notch核心域的synNotch合成受体，实验证明该改造后的synNotch受体系统，可以更高效的激活下游基因的表达。调控Mcherry荧光蛋白表达的平均荧光强度与原来的synNotch受体系统比较，改造后的synNotch受体系统可以有4.9倍的提升。本发明改造后的synNotch受体可扩展synNotch的应用范围，为细胞改造提供了新的应用前景，具有潜在的重要经济价值和意义。附图说明图1为synNotch系统示意图。当anti-CD19抗体单链结合到CD19抗原后，Notch核心域被蛋白酶切割，GAL4VP64被释放入胞内，GAL4可以特异识别并结合到GAL4结合位点，VP64转录激活元件就会激活下游mcherry基因的转录。图2为包含有不同Notch核心域的synNotch结构示意图。图3为质粒pHR-PGK-antiCD19-zebrasynNotch-Gal4VP64构建流程图。图4为在U2OS细胞系中不同synNotch系统对下游基因激活能力比较。将表达CD19的K562细胞与表达synNotch受体的U2OS细胞共培养48小时后进行检测。图A为荧光显微镜照片比较，M-N表示鼠来源的synNotch系统，也即是原始的系统；ZFN-N表示斑马鱼Notch跨膜核心域升级的synNotch系统。图B为流式细胞仪分析U2OS细胞中表达红色荧光蛋白荧光强度。具体实施方式以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。实施例1含斑马鱼Notch核心域的synNotch合成受体设计synNotch受体的结构包括胞外域、Notch跨膜核心域和胞内域，其中，胞外域可用单链抗体或者纳米抗体替换，胞内域可用转录激活或转录抑制的结构域替换。本发明以antiCD19单链抗体作为胞外域部分，GAL4VP64作为胞内域部分，并以能够被蛋白酶识别切割的斑马鱼Notch跨膜核心域取代鼠的Notch跨膜核心域，获得改造后的synNotch受体，本发明设计改造的synNotch受体的结构如图2所示。图2显示了包含有鼠的或斑马鱼的Notch跨膜核心域的synNotch受体的结构。实施例2含斑马鱼Notch跨膜核心域的表达质粒载体构建含斑马鱼Notch核心域的表达质粒载体pHR-PGK-antiCD19-zebrasynNotch-Gal4VP64构建的流程图见图3所示，具体包括以下步骤：1用Trizol试剂盒提取斑马鱼胚胎RNA，反转成cDNA，采用PCR引物对上游引物F：5’-GGCTGCTCCTCCAAGCCATG-3’和下游引物R：5’-ACGCTTGCGGCGGGCAATCA-3’扩张出斑马鱼Notch跨膜核心域，所述斑马鱼Notch跨膜核心域的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，相应编码的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；2将pHR-PGK-antiCD19-oligo含BamHIXhoI-Gal4VP64质粒由pHR-PGK-antiCD19-synNotch-Gal4VP64addgene#79125改建而得，具体为：将synNotch核心域切去，替换成一个oligo，以便于下一步把斑马鱼Notch核心域连接进入；该质粒中基因片段antiCD19-oligo含BamHIXhoI-Gal4VP64的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示使用BamHIXhoI进行双酶切，然后将步骤1扩张出的斑马鱼Notch跨膜核心域核苷酸序列如SEQIDNO.1所示克隆进入含慢病毒pHR骨架载体的antiCD19与Gal4VP64之间，即得慢病毒表达质粒载体pHR-PGK-antiCD19-zebrasynNotch-Gal4VP64antiCD19-zebrasynNotch-Gal4VP64的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，启动pHR为慢病毒质粒骨架载体，PGK为启动子，antiCD19为表达CD19抗原的scFV，zebrasynNotch为调控跨膜核心域，Gal4VP64为融合的转录激活因子，可激活调控基因；3将构建好的含斑马鱼Notch跨膜核心域的表达质粒载体pHR-PGK-antiCD19-zebrasynNotch-Gal4VP64进行测序验证，测序结果验证了构建成功。实施例3含斑马鱼Notch跨膜核心域的synNotch系统在细胞上试验及验证含斑马鱼Notch跨膜核心域的synNotch系统pHR-PGK-antiCD19-zebrasynNotch-Gal4VP64如图1所示。图1显示了synNotch系统提高细胞识别特定胞外信号的具体过程为：当synNotch受体的胞外域部分anti-CD19抗体单链结合到传输细胞sendercell的CD19抗原后，Notch跨膜核心域被蛋白酶切割，GAL4VP64被释放入胞内，GAL4可以特异识别并结合到GAL4结合位点，VP64转录激活元件就会激活下游mcherry基因的转录，促进Mcherry荧光蛋白表达。本发明以K562细胞作为传输细胞，以U2OS细胞作为受体细胞receivercell，对改造后的synNotch系统pHR-PGK-antiCD19-zebrasynNotch-Gal4VP64增强下游基因转录激活的能力进行细胞水平的验证，具体包括以下步骤：1K562细胞系感染慢病毒，可稳定表达CD19和BFP，作为传输细胞。U2OS细胞作为受体细胞，先感染pHR-Gal4UAS-IRES-mC-pGK-tBFPAddgene#79123慢病毒，挑选出能稳定表达pHR-Gal4UAS-IRES-mC-pGK-tBFP的单克隆细胞，然后感染pHR-PGK-antiCD19-zebrasynNotch-Gal4VP64慢病毒。上述用到的pHR-PGK-antiCD19-zebrasynNotch-Gal4VP64慢病毒是将表达质粒pHR-PGK-antiCD19-zebrasynNotch-Gal4VP64和pMD2.G和psPAX2共转染进入含密度为70％的HEK293-FT细胞的六孔板中，三天后收取细胞上清液，使用0.45uM滤器过滤病毒液并行病毒浓缩即得。2取上述稳定表达的U2OS细胞，以细胞密度为3×105个mL接种到24孔板中，加入细胞密度为3×105个mL且能表达CD19的K562细胞共培养48小时后，吸去刺激的K562细胞。使用Nikon倒置荧光显微镜拍摄细胞照片，并使用流式仪BD,bioscience分析细胞表达的荧光强度，结果如图4所示。图4A为荧光显微镜照片比较，M-N表示鼠来源的synNotch系统，也即是原始的系统；ZFN-N表示斑马鱼Notch跨膜核心域升级的synNotch系统antiCD19-zebrasynNotch-Gal4VP64，由图4A可知，与含鼠Notch核心域的synNotch系统M-N比较，含斑马鱼Notch跨膜核心域的synNotch系统ZFN-N可显著提高Mcherry红色荧光蛋白强度。图4B为流式细胞仪分析U2OS细胞中表达Mcherry红色荧光蛋白荧光强度，由图4B可知，使用斑马鱼Notch跨膜核心域的synNotch受体系统ZFN-N荧光表达强度，比原始文章报道的含鼠Notch核心域的synNotch系统M-N具有4.9倍的提升。以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。序列表110南方医科大学120新型SynNotch合成受体及其编码基因1605170SIPOSequenceListing1.02101211978212DNA213斑马鱼Barchydanioreriovar4001ggctgctcctccaagccatgccacaatggaggcttatgtacagaggaaaccagctatcca60ttttttcactgccagtgcaccaatggctggaaaggcaaacgatgtgaacagaaaactggg120ccatcggctccacttccttctccttgccctattgctgactgcttcagcaaggccaatgac180ggtgtgtgtgacaaagaatgcaactccttggactgccgctgggatggaggtgactgttct240cttgctgtaaacccctgggcacgctgtgcagaccctcgatgctggcggctcttcaacaac300agccaatgtgacgagttttgcaataacgcagagtgcctgttcgataatttcgactgcata360aacaaagagaaagtctgcaaccccatctatgaagcatactgtactgaccattatgcagat420ggactctgtgatcaaggatgcaatactgaagaatgtggctgggatggactggattgtgca480aggaagattccagaagaccttgctgaagatatgcttgttattgtagtcctactgccccca540gaggagcttctaaggacacaaacagctttcctgcagaaactaagtgccatcctacgcacc600acgttgcgcttccgtctcgatcgaaatggagattacatgatccgaccttacacaggccgt660gagacgcgcattaaacgggagcttaatcctcaggaggtcattgggtccattgtatatttg720gaaatagacaacaggctgtgctctcagggctcagatgactgcttccgcaatgctgacagt780gctgctgaataccttggtgctctgtctgctcgggaaatgttgcgcttcccataccccatt840aaagaagtgacaagtgaaaaaagagagcccttgattactgagatacctgaatgggctagg900ctactgctagtaggtgtagcttctctcttcttgttggtaatcttgatggttggcatgttg960attgcccgccgcaagcgt9782102211326212PRT213斑马鱼Barchydanioreriovar4002GlyCysSerSerLysProCysHisAsnGlyGlyLeuCysThrGluGlu151015ThrSerTyrProPhePheHisCysGlnCysThrAsnGlyTrpLysGly202530LysArgCysGluGlnLysThrGlyProSerAlaProLeuProSerPro354045CysProIleAlaAspCysPheSerLysAlaAsnAspGlyValCysAsp505560LysGluCysAsnSerLeuAspCysArgTrpAspGlyGlyAspCysSer65707580LeuAlaValAsnProTrpAlaArgCysAlaAspProArgCysTrpArg859095LeuPheAsnAsnSerGlnCysAspGluPheCysAsnAsnAlaGluCys100105110LeuPheAspAsnPheAspCysIleAsnLysGluLysValCysAsnPro115120125IleTyrGluAlaTyrCysThrAspHisTyrAlaAspGlyLeuCysAsp130135140GlnGlyCysAsnThrGluGluCysGlyTrpAspGlyLeuAspCysAla145150155160ArgLysIleProGluAspLeuAlaGluAspMetLeuValIleValVal165170175LeuLeuProProGluGluLeuLeuArgThrGlnThrAlaPheLeuGln180185190LysLeuSerAlaIleLeuArgThrThrLeuArgPheArgLeuAspArg195200205AsnGlyAspTyrMetIleArgProTyrThrGlyArgGluThrArgIle210215220LysArgGluLeuAsnProGlnGluValIleGlySerIleValTyrLeu225230235240GluIleAspAsnArgLeuCysSerGlnGlySerAspAspCysPheArg245250255AsnAlaAspSerAlaAlaGluTyrLeuGlyAlaLeuSerAlaArgGlu260265270MetLeuArgPheProTyrProIleLysGluValThrSerGluLysArg275280285GluProLeuIleThrGluIleProGluTrpAlaArgLeuLeuLeuVal290295300GlyValAlaSerLeuPheLeuLeuValIleLeuMetValGlyMetLeu305310315320IleAlaArgArgLysArg32521032111378212DNA213人工序列antiCD19-oligo含BamHIXhoI-Gal4VP644003gatatacagatgacgcagacaacgtcaagtctttccgccagcttgggagaccgagtgact60atatcttgtagagcaagccaggatatttctaagtatcttaactggtaccaacaaaagccc120gatggaacggttaagctgcttatataccataccagtagactccactccggcgtaccatca180cggttttctggcagtggctccgggaccgactattctttgacgatctctaatctcgaacaa240gaggatattgcaacatacttttgtcagcaaggcaataccttgccatatacgtttgggggc300gggacaaaacttgagataaccggcggcggtggttcaggcggtggcggttccggtggtggg360ggatcagaggttaagcttcaggaatccggaccaggtttggttgcccccagccaatctctc420agcgttacatgcacggtttcaggcgtcagtctccccgattacggtgtaagttggattcgg480caacctccgcgaaagggtctggaatggctgggggttatttgggggagtgagacaacttat540tacaactctgcacttaagagtcggcttaccatcatcaaggataattcaaaatcacaagta600ttcctgaagatgaactcattgcaaacagatgatacagctatatactattgtgccaagcat660tactattatggtggttcttatgcaatggattactgggggcaaggcacgtcagtgacagtg720agttcactcgaggcgaggatccatgaagctgctgagcagcatcgagcaggcctgtgacat780ctgccggctgaagaaactgaagtgcagcaaagaaaagcccaagtgcgccaagtgcctgaa840gaacaactgggagtgccggtacagccccaagaccaagagaagccccctgaccagagccca900cctgaccgaggtggaaagccggctggaaagactggaacagctgtttctgctgatcttccc960acgcgaggacctggacatgatcctgaagatggacagcctgcaggacatcaaggccctgct1020gaccggcctgttcgtgcaggacaacgtgaacaaggacgccgtgaccgacagactggccag1080cgtggaaaccgacatgcccctgaccctgcggcagcacagaatcagcgccaccagcagcag1140cgaggaaagcagcaacaagggccagcggcagctgacagtgtctgctgctgcaggcggaag1200cggaggctctggcggatctgatgccctggacgacttcgacctggatatgctgggcagcga1260cgccctggatgattttgatctggacatgctgggatctgacgctctggacgatttcgatct1320cgacatgttgggatcagatgcactggatgactttgacctggacatgctcggatcatga137821042112346212DNA213antiCD19-zebrasynNotch-Gal4VP64synNotchreceptor4004gatatacagatgacgcagacaacgtcaagtctttccgccagcttgggagaccgagtgact60atatcttgtagagcaagccaggatatttctaagtatcttaactggtaccaacaaaagccc120gatggaacggttaagctgcttatataccataccagtagactccactccggcgtaccatca180cggttttctggcagtggctccgggaccgactattctttgacgatctctaatctcgaacaa240gaggatattgcaacatacttttgtcagcaaggcaataccttgccatatacgtttgggggc300gggacaaaacttgagataaccggcggcggtggttcaggcggtggcggttccggtggtggg360ggatcagaggttaagcttcaggaatccggaccaggtttggttgcccccagccaatctctc420agcgttacatgcacggtttcaggcgtcagtctccccgattacggtgtaagttggattcgg480caacctccgcgaaagggtctggaatggctgggggttatttgggggagtgagacaacttat540tacaactctgcacttaagagtcggcttaccatcatcaaggataattcaaaatcacaagta600ttcctgaagatgaactcattgcaaacagatgatacagctatatactattgtgccaagcat660tactattatggtggttcttatgcaatggattactgggggcaaggcacgtcagtgacagtg720agt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权利要求：1.一种新型SynNotch合成受体，包括胞外域、Notch跨膜核心域和胞内域，其特征在于，所述的Notch跨膜核心域是斑马鱼Notch跨膜核心域。2.根据权利要求1所述的新型SynNotch合成受体，其特征在于，包括anti-CD19scFV片段、斑马鱼Notch跨膜核心域和GAL-VP64片段。3.根据权利要求1或2所述的SynNotch合成受体，其特征在于，所述的斑马鱼Notch跨膜核心域的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。4.根据权利要求3所述的SynNotch合成受体，其特征在于，所述的编码斑马鱼Notch跨膜核心域的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。5.根据权利要求1所述的SynNotch合成受体，其特征在于，所述SynNotch合成受体的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示。6.一种权利要求1所述的新型SynNotch合成受体的编码基因。7.根据权利要求6所述的编码基因，其特征在于，所述SynNotch合成受体的编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。8.一种表达载体，其特征在于，含有权利要求6或7所述的编码基因。9.一种宿主细胞，其特征在于，含有权利要求6所述的编码基因或权利要求8所述的表达载体。10.一种提高细胞识别特定胞外信号的方法，其特征在于，利用权利要求1所述的SynNotch合成受体或权利要求6所述的SynNotch合成受体的编码基因对活体细胞进行改造，让细胞可以识别特定表面抗原，并作出更强烈的特定反应，激活下游基因的表达。

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