申请/专利权人：山西正一康生物科技有限公司

申请日：2018-11-02

公开（公告）日：2019-03-12

公开（公告）号：CN109456411A

主分类号：C07K16/46(2006.01)I

分类号：C07K16/46(2006.01)I;C12N5/0783(2010.01)I;A61K35/17(2015.01)I;A61P35/00(2006.01)I

优先权：

专利状态码：失效-发明专利申请公布后的撤回

法律状态：2020.02.14#发明专利申请公布后的撤回;2019.04.05#实质审查的生效;2019.03.12#公开

摘要：本发明公开了一种靶向NYESO1阳性恶性肿瘤双特异性抗体及制备方法和应用。所述抗体通过下述方法制备得到：1选购Anit‑CD3+，Anti‑NYESO1单克隆抗体；2取人源CD3单克隆抗体，溶于交联剂Traut's试剂中，得到人源CD3单链抗体；3取人源NYESO1单克隆抗体，溶于交联剂Sulfo‑SMCC中，得到人源NYESO1单链抗体；4将人源CD3单链抗体和人源NYESO1单链抗体混合，室温下经Sephrose‑G25凝胶层析柱分离纯化，取出多余的交联剂，得到单链抗体；5将纯化得到的单链抗体立即装入含有缓冲液的透析袋中混合，并于4℃下在缓冲液中透析作用18小时，得到双抗体复合物；6采用SDS‑PAGE凝胶电泳鉴定得到的双抗体复合物分子量，Sephrose‑G25凝胶柱纯化并超滤浓缩，得到双特异性抗体复合物。

主权项：1.一种靶向NYESO1阳性恶性肿瘤双特异性抗体，其特征是通过下述方法制备得到：1选购Anit‑CD3+，Anti‑NYESO1单克隆抗体；2取1mg人源CD3单克隆抗体，溶于0.3‑0.6mM交联剂Traut's试剂中，得到人源CD3单链抗体；3取1mg人源NYESO1单克隆抗体，溶于0.3‑0.6mM交联剂Sulfo‑SMCC中，得到人源NYESO1单链抗体；4将步骤2的人源CD3单链抗体和步骤3的人源NYESO1单链抗体混合，室温下经Sephrose‑G25凝胶层析柱分离纯化，取出多余的交联剂，得到单链抗体；5将步骤4纯化得到的单链抗体立即装入含有缓冲液的透析袋中混合，并于4℃下在缓冲液中透析作用18小时，得到双抗体复合物；6采用SDS‑PAGE凝胶电泳鉴定步骤5得到的双抗体复合物分子量，Sephrose‑G25凝胶柱纯化并超滤浓缩，得到双特异性抗体复合物。

全文数据：一种靶向NYESO1阳性恶性肿瘤双特异性抗体及制备方法和应用技术领域本发明属于生物医药、细胞生物学、肿瘤临床医学等技术领域，具体涉及一种靶向NYESO1阳性恶性肿瘤双特异性抗体及其制备方法和应用。背景技术肿瘤免疫治疗因其副作用小、特异性强等特点，被公认为是治疗恶性肿瘤的有效途径之一，特别是针对恶性肿瘤的特异性T细胞治疗研究更是学术界关注的焦点，目前关于靶向T细胞治疗恶性肿瘤的众多基础及临床研究正在开展，显示特异性CTL细胞具有深远而广阔的应用前景。NY-ESO-1抗原是肿瘤-睾丸抗原CTA家族中的重要成员，除睾丸组织和胎盘组织外，在正常组织中几乎不表达。NY-ESO-1在多种组织类型肿瘤中呈不同程度的表达，表达频率最高的是神经母细胞瘤82％、滑膜肉瘤80％、黑素瘤46％和卵巢上皮癌43％。NY-ESO-1155-163是迄今发现的最具免疫原性的肿瘤抗原之一，可以在NY-ESO-1表达阳性的肿瘤患者体内引起自发性体液免疫反应和特异性T细胞免疫反应。因此，NY-ESO-1155-163抗原理论上可作为肿瘤特异性免疫治疗的靶标。发明内容本发明针对背景技术中的问题，提供一种靶向NYESO1阳性恶性肿瘤双特异性抗体及其制备方法和应用。本发明为解决上述问题而采取的技术方案为：一种靶向NYESO1阳性恶性肿瘤双特异性抗体，通过下述方法制备得到：1选购Anit-CD3+，Anti-NYESO1单克隆抗体；2取1mg人源CD3单克隆抗体，溶于0.3-0.6mM交联剂Traut's试剂中，得到人源CD3单链抗体；3取1mg人源NYESO1单克隆抗体，溶于0.3-0.6mM交联剂Sulfo-SMCC中，得到人源NYESO1单链抗体；4将步骤2的人源CD3单链抗体和步骤3的人源NYESO1单链抗体混合，室温下经Sephrose-G25凝胶层析柱分离纯化，取出多余的交联剂，得到单链抗体；5将步骤4纯化得到的单链抗体立即装入含有缓冲液的透析袋中混合，并于4℃下在缓冲液中透析作用18小时，得到双抗体复合物；6采用SDS-PAGE凝胶电泳鉴定步骤5得到的双抗体复合物分子量，Sephrose-G25凝胶柱纯化并超滤浓缩，得到双特异性抗体复合物。作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的Sephrose-G25凝胶层析柱平衡缓冲体系为20mMTris，100mMNaCl，pH7.3。作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的透析袋孔径大小为10kd。作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的透析袋中缓冲液的组成为：20mMTris，100mMNaCl,pH7.3。一种靶向NYESO1阳性恶性肿瘤双特异性抗体的制备方法，包括以下步骤：1选购Anit-CD3+，Anti-NYESO1单克隆抗体；2取1mg人源CD3单克隆抗体，溶于0.3-0.6mM交联剂Traut's试剂中，得到人源CD3单链抗体；3取1mg人源NYESO1单克隆抗体，溶于0.3-0.6mM交联剂Sulfo-SMCC中，得到人源NYESO1单链抗体；4将步骤2的人源CD3单链抗体和步骤3的人源NYESO1单链抗体混合，室温下经Sephrose-G25凝胶层析柱分离纯化，取出多余的交联剂，得到单链抗体；5将步骤4纯化得到的单链抗体立即装入含有缓冲液的透析袋中混合，并于4℃下在缓冲液中透析作用18小时，得到双抗体复合物；6采用SDS-PAGE凝胶电泳鉴定步骤5得到的双抗体复合物分子量，Sephrose-G25凝胶柱纯化并超滤浓缩，得到双特异性抗体复合物。作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的Sephrose-G25凝胶层析柱平衡缓冲体系为20mMTris，100mMNaCl，pH7.3。作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的透析袋孔径大小为10kd。作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的透析袋中缓冲液的组成为：20mMTris，100mMNaCl,pH7.3。本发明靶向NYESO1阳性恶性肿瘤双特异性抗体用于治疗恶性肿瘤。本发明用于治疗恶性肿瘤之前对非特异性T细胞进行前处理，具体的处理方法包括以下步骤：1抽取人体外周血，利用淋巴细胞分离液将单个核细胞PBMC进行分离1900-2300rpmmin,离心10-20分钟；2PBMC细胞加30-50mlT细胞培养液，过夜培养，第二天悬浮的细胞倒入另一个无菌细胞培养瓶中_Tc1；3上述Tc1细胞加入CD3+单克隆抗体，800-1200Uml白介素2IL-2，培养3-5天；4上述细胞隔天添加新鲜T细胞养基联合培养5-9天；5检测T细胞亚群及细胞因子分泌能力，流式鉴定T细胞亚型及细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4分泌水平。为进一步表明本发明对恶性肿瘤的治疗作用，本发明进行了如下验证：双特异性抗体复合物诱导CTL细胞毒性T淋巴细胞并对高表达NYESO1恶性肿瘤细胞株体外杀伤，验证的具体步骤如下：1收集上述培养的T细胞，用生理盐水洗涤2次，利用本发明制备的“双特异抗体复合物”对T细胞进行“装载”，诱导高效靶向NYESO1的CTL；2荧光定量PCR鉴定恶性肿瘤细胞株：A375、SW1990，肺癌细胞株A549，肠癌细胞株DLD1，白血病细胞株K562中NYESO1抗原基因表达水平，作Westrenblot鉴定，以恶性肿瘤细胞株作为靶细胞，LDH法检测不同效靶比下对肿瘤细胞杀伤活性，显微镜观察T细胞靶向NYESO1恶性肿瘤细胞能力；3结果显示，利用上述双特异性抗体装载的T细胞，对NYESO1高表达的恶性肿瘤细胞具有较强的杀伤活性，同时显微镜观察记录结果显示，利用“Anti-CD3+*Anti-NYESO1”双抗体复合物装载T细胞后，具有很强的趋向性，能够显示较强的T细胞浓度差异，具体表现如图1-8，说明T细胞可以自发寻找NYESO1+肿瘤细胞，同时根据不同浓度效靶比及时间梯度观察结果显示，T细胞具有较强的细胞因子分泌能力及肿瘤细胞杀伤能力，实验结果显示18小时后肿瘤细胞基本完全杀灭。本发明采用上述技术方案，利用双抗体偶联技术，选择Anti-CD3+单抗及恶性肿瘤高表达抗原NYESO1的单克隆抗体Anti-NYESO1单抗，利用SMCC定向偶联技术，构建“Anti-CD3+×Anti-NYESO1双特异性抗体”，并用以诱导特异性T淋巴细胞毒性效应，对高表达NYESO1恶性肿瘤细胞株进行体杀伤检测，以验证该技术不仅能高靶向性杀灭肿瘤细胞，对肿瘤的发展、转移也能起到抑制性作用，利用抗原—抗体特异性吸附引发的ADCC效应诱导特异性CTL，具有极强的靶向性及抗原特异性，可在抗原—抗体分子水平做到“精准治疗”。同时该技术的建立，可针对不同肿瘤表达的特异性抗原偶联合成“双特异性抗体复合物”，为广大肿瘤患者治疗带来新的希望。因此，与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：1本发明利用SMCC化学偶联法制备Anti-CD3+*Anti-NYESO1双特异性抗体复合物，抗体偶联产率高，技术可行性较强，不需要复杂的基因工程技术，该技术所选抗体均为已商业化单抗药物或试剂，保证了本双抗体复合物的安全性及有效性；2本发明可诱导高效的T淋巴细胞毒性效应，同时通过抗原-抗体反应使T细胞具备强效的肿瘤靶向性，可对抗原特异表达肿瘤进行高效的杀灭，并且该技术实施过程中抗体使用量少，具备很好的市场推广前景；3本发明通过双抗体偶联技术与过继免疫细胞治疗紧密结合，通过T细胞体外扩增技术大量培养CD3+T细胞，再进行双抗体靶向诱导，可将T细胞快速吸附在肿瘤细胞上，为肿瘤的“精准治疗”探索一条安全、可行、简便、高效的治疗方法及模式；4本发明根据患者肿瘤细胞表达抗原不同选择不同的单克隆抗体，制备不同的双抗体复合物，同时该双抗体复合物可以单独使用，可为一种新药的研发提供前期基础研究。附图说明图1是本发明T细胞扩增曲线图2是本发明T细胞因子分泌能力分析，结果显示IFN-γ，IL-2分泌水平显著提升。图3是本发明贴壁培养的NYESO1+恶性肿瘤细胞；图4是本发明未加双特异性抗体的T细胞与NYESO1+恶性肿瘤细胞混合。未见明显杀伤及T细胞的浓度趋向性；图5是本发明添加双特异性抗体组结果显示，T细胞具有较强的靶细胞趋向性；图6是本发明添加NYESO1+双特异性抗体后结果显示,T细胞发挥较强的肿瘤细胞杀伤功能；图7是本发明12小时内靶细胞杀伤率对比图，结果显示添加NYESO1双特异性抗体组12小时杀伤率可达90％以上；图8是本发明对不同种类肿瘤细胞8小时杀伤率比较效靶比30:1，结果显示经本发明双特异性抗体装载的T细胞对NYESO1+肿瘤细胞具有较较强的杀伤能力。具体实施方式实施例1一种靶向NYESO1阳性恶性肿瘤双特异性抗体，通过下述方法制备得到：1选购Anit-CD3+，Anti-NYESO1单克隆抗体；2取1mg人源CD3单克隆抗体，溶于0.3-0.6mM交联剂Traut's试剂中，得到人源CD3单链抗体；3取1mg人源NYESO1单克隆抗体，溶于0.3-0.6mM交联剂Sulfo-SMCC中，得到人源NYESO1单链抗体；4将步骤2的人源CD3单链抗体和步骤3的人源NYESO1单链抗体混合，室温下经平衡缓冲体系为20mMTris，100mMNaCl，pH7.3的Sephrose-G25凝胶层析柱分离纯化，取出多余的交联剂，得到单链抗体；5将步骤4纯化得到的单链抗体立即装入含有缓冲液的孔径大小为10kd的透析袋中混合，并于4℃下在缓冲液中透析作用18小时，得到双抗体复合物，透析袋中缓冲液的组成为：20mMTris，100mMNaCl,pH7.3；6采用SDS-PAGE凝胶电泳鉴定步骤5得到的双抗体复合物分子量，Sephrose-G25凝胶柱纯化并超滤浓缩，得到双特异性抗体复合物。实施例2一种靶向NYESO1阳性恶性肿瘤双特异性抗体的制备方法，包括以下步骤：1选购Anit-CD3+，Anti-NYESO1单克隆抗体；2取1mg人源CD3单克隆抗体，溶于0.3-0.6mM交联剂Traut's试剂中，得到人源CD3单链抗体；3取1mg人源NYESO1单克隆抗体，溶于0.3-0.6mM交联剂Sulfo-SMCC中，得到人源NYESO1单链抗体；4将步骤2的人源CD3单链抗体和步骤3的人源NYESO1单链抗体混合，室温下经平衡缓冲体系为20mMTris，100mMNaCl，pH7.3的Sephrose-G25凝胶层析柱分离纯化，取出多余的交联剂，得到单链抗体；5将步骤4纯化得到的单链抗体立即装入含有缓冲液的孔径大小为10kd的透析袋中混合，并于4℃下在缓冲液中透析作用18小时，得到双抗体复合物，透析袋中缓冲液的组成为：20mMTris，100mMNaCl,pH7.3；6采用SDS-PAGE凝胶电泳鉴定步骤5得到的双抗体复合物分子量，Sephrose-G25凝胶柱纯化并超滤浓缩，得到双特异性抗体复合物。实施例3一种靶向NYESO1阳性恶性肿瘤双特异性抗体用于治疗恶性肿瘤，在治疗恶性肿瘤之前首选对非特异性DC-T细胞进行前处理，具体的处理方法包括以下步骤：1抽取人体外周血，利用淋巴细胞分离液将单个核细胞PBMC进行分离1900-2300min,离心10-20分钟；2PBMC细胞加30-50ml淋巴细胞培养液，过夜培养，第二天悬浮的细胞倒入另一个无菌细胞培养瓶中Tc1，贴壁细胞用于培养DC细胞Dc1；3上述Dc1细胞培养过程中加入0.5-1.2mM维生素C，与Dc1混合培养3-5天；4上述Tc1细胞加入CD3+单克隆抗体，700-1500Uml白介素二IL-2，培养3-5天；5将1-3与1-4细胞混合培养，利用1-3培养的Dc1细胞增强Tc1细胞，联合培养5-9天；6检测T细胞亚群及细胞因子分泌能力，流式鉴定T细胞亚型及细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4分泌水平。为进一步表明本发明对恶性肿瘤的治疗作用，本发明进行了如下验证：双特异性抗体复合物诱导CTL细胞毒性T淋巴细胞并对高表达NYESO1恶性肿瘤细胞株体外杀伤，验证的具体步骤如下：1收集上述培养的T细胞，用生理盐水洗涤2次，利用本发明制备的“双特异抗体复合物”对T细胞进行“装载”，诱导高效靶向NYESO1的CTL；2荧光定量PCR鉴定恶性肿瘤细胞株：A375、SW1990，肺癌细胞株A549，肠癌细胞株DLD1，白血病细胞株K562中NYESO1抗原基因表达水平，作Westrenblot鉴定，以恶性肿瘤细胞株作为靶细胞，LDH法检测不同效靶比下对肿瘤细胞杀伤活性，荧光显微镜观察T细胞靶向NYESO1恶性肿瘤细胞能力；3结果显示，利用上述双特异性抗体装载的T细胞，对NYESO1高表达的恶性肿瘤细胞具有较强的杀伤活性，同时显微镜观察记录结果显示，利用“Anti-CD3+*Anti-NYESO1”双抗体复合物装载T细胞后，具有很强的趋向性，能够显示较强的T细胞浓度差异，具体表现如图1-8，图1为T细胞培养增长曲线*108，结果显示14天时T细胞生长处于对数生长期；图2为流式细胞仪分析T细胞分泌细胞因子能力，结果显示IFN-γ，IL-2分泌水平显著提升；图3为显微镜下观察NYESO1+肿瘤细胞A375贴壁生长*200倍；图4为未经Anti-CD3+*Anti-NYESO1双特异性抗体处理的T细胞，对NYESO1+肿瘤细胞杀伤能力有限利用ADCC效应聚集在肿瘤细胞周围；图5为经Anti-CD3+*Anti-NYESO1双特异性抗体装载的T细胞具有良好的靶向性，利用ADCC效应聚集在肿瘤细胞周围，效靶比30:1倒置显微镜下x50倍观察结果；图6为经Anti-CD3+*Anti-NYESO1双特异性抗体装载的T细胞具有良好的靶向性，利用ADCC效应聚集在肿瘤细胞周围，效靶比30:1，倒置显微镜下x20倍观察结果；图7为经Anti-CD3+*Anti-NYESO1双特异性抗体装载的T细胞具有良好的杀伤效果，12小时NYESO1+肿瘤细胞杀伤率可达90％以上；图8为双特异性抗体装载的T细胞对不同肿瘤细胞8小时杀伤率效靶比＝30:1，结果显示对NYESO1+肿瘤细胞A375具有很好的杀伤效果，8小时杀伤率可达60％以上，远高于NYESO1-肿瘤细胞。图1-8说明T细胞可以自发寻找肿瘤细胞，同时根据不同浓度效靶比及时间梯度观察结果显示实验结果显示12小时后肿瘤细胞基本完全杀灭。

权利要求：1.一种靶向NYESO1阳性恶性肿瘤双特异性抗体，其特征是通过下述方法制备得到：1选购Anit-CD3+，Anti-NYESO1单克隆抗体；2取1mg人源CD3单克隆抗体，溶于0.3-0.6mM交联剂Traut's试剂中，得到人源CD3单链抗体；3取1mg人源NYESO1单克隆抗体，溶于0.3-0.6mM交联剂Sulfo-SMCC中，得到人源NYESO1单链抗体；4将步骤2的人源CD3单链抗体和步骤3的人源NYESO1单链抗体混合，室温下经Sephrose-G25凝胶层析柱分离纯化，取出多余的交联剂，得到单链抗体；5将步骤4纯化得到的单链抗体立即装入含有缓冲液的透析袋中混合，并于4℃下在缓冲液中透析作用18小时，得到双抗体复合物；6采用SDS-PAGE凝胶电泳鉴定步骤5得到的双抗体复合物分子量，Sephrose-G25凝胶柱纯化并超滤浓缩，得到双特异性抗体复合物。2.根据权利要求1所述的一种靶向NYESO1阳性恶性肿瘤双特异性抗体，其特征是所述的Sephrose-G25凝胶层析柱平衡缓冲体系为20mMTris，100mMNaCl，pH7.3。3.根据权利要求1所述的一种靶向NYESO1阳性恶性肿瘤双特异性抗体，其特征是所述的透析袋孔径大小为10kd。4.根据权利要求1所述的一种靶向NYESO1阳性恶性肿瘤双特异性抗体，其特征是所述的透析袋中缓冲液的组成为：20mMTris，100mMNaCl,pH7.3。5.权利要求1所述一种靶向NYESO1阳性恶性肿瘤双特异性抗体的制备方法，其特征是包括以下步骤：1选购Anit-CD3+，Anti-NYESO1单克隆抗体；2取1mg人源CD3单克隆抗体，溶于0.3-0.6mM交联剂Traut's试剂中，得到人源CD3单链抗体；3取1mg人源NYESO1单克隆抗体，溶于0.3-0.6mM交联剂Sulfo-SMCC中，得到人源NYESO1单链抗体；4将步骤2的人源CD3单链抗体和步骤3的人源NYESO1单链抗体混合，室温下经Sephrose-G25凝胶层析柱分离纯化，取出多余的交联剂，得到单链抗体；5将步骤4纯化得到的单链抗体立即装入含有缓冲液的透析袋中混合，并于4℃下在缓冲液中透析作用18小时，得到双抗体复合物；6采用SDS-PAGE凝胶电泳鉴定步骤5得到的双抗体复合物分子量，Sephrose-G25凝胶柱纯化并超滤浓缩，得到双特异性抗体复合物。6.根据权利要求5所述一种靶向NYESO1阳性恶性肿瘤双特异性抗体的制备方法，其特征是所述的Sephrose-G25凝胶层析柱平衡缓冲体系为20mMTris，100mMNaCl，pH7.3。7.根据权利要求5所述一种靶向NYESO1阳性恶性肿瘤双特异性抗体的制备方法，其特征是所述的透析袋孔径大小为10kd。8.根据权利要求5所述一种靶向NYESO1阳性恶性肿瘤双特异性抗体的制备方法，其特征是所述的透析袋中缓冲液的组成为：20mMTris，100mMNaCl,pH7.3。9.权利要求1所述的一种靶向NYESO1阳性恶性肿瘤双特异性抗体的应用，其特征是用于治疗恶性肿瘤。10.根据权利要求9所述的一种靶向NYESO1阳性恶性肿瘤双特异性抗体的应用，其特征是用于治疗恶性肿瘤之前对非特异性T细胞进行前处理，具体的处理方法包括以下步骤：1抽取人体外周血，利用淋巴细胞分离液将单个核细胞PBMC进行分离1900-2300rpmmin,离心10-20分钟；2PBMC细胞加30-50mlT细胞培养液，过夜培养，第二天悬浮的细胞倒入另一个无菌细胞培养瓶中_Tc1；3上述Tc1细胞加入CD3+单克隆抗体，800-1200Uml白介素2IL-2，培养3-5天；4上述细胞隔天添加新鲜T细胞养基联合培养5-9天；5检测T细胞亚群及细胞因子分泌能力，流式鉴定T细胞亚型及细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4分泌水平。

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