申请/专利权人：深圳华大基因股份有限公司

申请日：2013-09-25

公开（公告）日：2019-04-23

公开（公告）号：CN104450871B

主分类号：C12Q1/6883(2018.01)I

分类号：C12Q1/6883(2018.01)I;C12Q1/32(2006.01)I;C12N15/11(2006.01)I

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2019.04.23#授权;2016.05.25#专利申请权、专利权的转移;2015.04.22#实质审查的生效;2015.03.25#公开

摘要：本发明涉及遗传性眼科疾病领域，具体而言涉及小眼畸形领域。本发明提供了小眼畸形和无眼畸形相关基因突变、其检测方法及其用途，所述基因突变是突变的ALDH1A3基因或ALDH1A3蛋白：c.521GA、p.Cys174Tyr。

主权项：1.一种小眼畸形和无眼畸形的生物标记物，所述生物标记物包括突变的ALDH1A3基因或ALDH1A3蛋白：c.521GA、p.Cys174Tyr。

全文数据：小眼畸形和无眼畸形相关基因突变、其检测方法及其用途技术领域本发明涉及遗传性眼科疾病领域，具体而言涉及小眼畸形领域。背景技术小眼畸形（microphthalmia）和无眼畸形（anophthalmia）是一种罕见的眼科类畸形病，表现为明显的小眼球或无眼球。无眼畸形是指眶内的眼组织缺失，完全没有眼球、眼睑、结膜、睫毛和泪器。小眼畸形是指眼眶内的眼球畸形，包括形态、体积和结构的畸形，角膜直径一般小于10mm，眼球前后轴直径小于20mm，部分眼附属器和眼睑可表现为正常。小眼畸形和无眼畸形通常双侧发病，单独的小眼畸形也常以单侧发病出现。它们可以单一发病也可以是某综合征的一部分，调查显示约50%的小眼畸形或无眼畸形患者还伴随有其他畸形。无眼畸形发病率为3100000，而小眼畸形的发病率为14100000，其综合发病率在17100000左右。并且在失明儿童中，由小眼畸形引起的部分高达11%。小眼畸形和无眼畸形的诊断标准是指眼球的全轴长totalaxiallength,TAL小于该年龄段正常均值2个标准差。眼球后部长度posteriorsegmentlength,PSL是小眼畸形和无眼畸形的诊断的一个重要指标，小眼畸形的严重度取决于PSL潜在的畸形程度。该类疾病的精确诊断往往需要将临床检查和超声、CT以及MRI等辅助检查手段相结合。小眼畸形和无眼畸形的可能致病原因有很多，包括染色体结构变异、单基因突变和环境因素影响。其中单基因因素中，大部分病例都被报道与SOX2基因上的突变相关，除此之外ALDH1A3、PAX6、OTX2等与眼睛发育相关的基因上的一些突变均被证实会导致小眼畸形和无眼畸形的发生，但已知的致病基因仍然只能解释Ap.C174Y。在第一方面，本发明涉及小眼畸形和无眼畸形的生物标记物，即突变的ALDH1A3基因或ALDH1A3蛋白，所述生物标记物是具有选自如下的突变基因或蛋白：ALDH1A3基因c.521GAp.C174Y。在一个实施方案中，本发明的突变ALDH1A3基因为具有以下突变的SEQIDNO:1：c.521GA。在第二方面，本发明涉及一种小眼畸形和无眼畸形的检测方法，所述方法包括检测受试者的ALDH1A3基因或ALDH1A3蛋白中是否存在突变位点，如果有纯合突变位点，则所述受试者被鉴定为患有小眼畸形和无眼畸形或易患小眼畸形和无眼畸形，或者其后代会患有小眼畸形和无眼畸形或易患小眼畸形和无眼畸形，所述突变位点为ALDH1A3基因c.521GAp.C174Y。在一个实施方案中，ALDH1A3基因为SEQIDNO:1的序列表示。在一个实施方案中，本发明的检测小眼畸形和无眼畸形的方法包括如下引物扩增的步骤：SEQIDNO:3和SEQIDNO:4。在一个实施方案中，本发明的检测小眼畸形和无眼畸形的方法中检测突变位点通过选自如下的技术进行：测序、电泳、核酸杂交、原位杂交、PCR、逆转录酶链反应和变性高效液相色谱。在本发明第二方面的方法中，优选检测纯合的突变ALDH1A3基因。在第三方面，本发明涉及一种检测突变ALDH1A3基因或ALDH1A3蛋白的方法，所述方法包括检测受试者的ALDH1A3基因或ALDH1A3蛋白中是否存在突变位点，所述突变位点为ALDH1A3基因c.521GAp.C174Y。在一个实施方案中，ALDH1A3基因为SEQIDNO:1的序列表示。在一个实施方案中，本发明的检测小眼畸形和无眼畸形的方法包括如下引物扩增的步骤：SEQIDNO:3和SEQIDNO:4。在一个实施方案中，本发明的检测突变ALDH1A3基因或ALDH1A3蛋白的方法中检测突变位点通过选自如下的技术进行：测序、电泳、核酸杂交、原位杂交、PCR、逆转录酶链反应和变性高效液相色谱。在第四方面，本发明涉及通过PCR检测突变ALDH1A3基因或ALDH1A3蛋白中使用的引物对，所述突变为ALDH1A3基因c.521GAp.C174Y。其中所述引物对分别基于选自如下的位臵在基因组序列或cDNA序列上前后设计，使得扩增该位臵：ALDH1A3基因cDNA序列第521位。在第五方面，本发明涉及与突变ALDH1A3基因互补的核酸探针，所述突变为ALDH1A3基因c.521GAp.C174Y。在一个具体实施方案中，所述探针包含TGTCTATGGGG（SEQIDNO:5）或为TGTCTATGGGG；更优选包含ATTGGTGTCTATGGGGCCATC（SEQIDNO:6）或为ATTGGTGTCTATGGGGCCATC。在第六方面，本发明涉及检测突变ALDH1A3基因或ALDH1A3蛋白的试剂盒，包含一组或多组引物对，其中所述突变为ALDH1A3基因c.521GAp.C174Y。其中所述引物对分别基于选自如下的位臵在基因组序列或cDNA序列上前后设计，使得扩增该位臵：ALDH1A3基因cDNA序列第521位。在一个实施方案中，所述检测突变ALDH1A3基因或ALDH1A3蛋白的试剂盒包含如下引物：SEQIDNO:3和SEQIDNO:4。在第七方面，本发明涉及检测突变ALDH1A3基因的试剂盒，包含一个或多个核酸探针，其中所述突变为ALDH1A3基因c.521GA。所述探针与突变ALDH1A3基因上包含选自如下位臵的基因组序列或cDNA序列上的区域互补：ALDH1A3基因cDNA序列第521位。在第八方面，本发明涉及ALDH1A3基因的突变外显子5。在本发明中，引物对SEQIDNO:3和SEQIDNO:4用于扩增ALDH1A3基因的野生型或突变外显子5。本发明人发现，本发明的ALDH1A3基因的杂合突变并不致病，如本文中患者的父母（图1中III-2和III-3）及一个表型正常的兄弟（IV-2）。本发明的具有ALDH1A3基因突变的患者的临床病症有差别。本发明人发现，小眼畸形和无眼畸形相关致病基因的1个新的突变位点，对该基因位点的检测可以用于小眼畸形和无眼畸形患者的辅助诊断，并且可以有利于明确小眼畸形和无眼畸形患者的分子诊断。因此，本发明的检测突变ALDH1A3基因或ALDH1A3蛋白的方法可以用于诊断小眼畸形和无眼畸形的目的，例如产前诊断、植入前遗传学诊断（PGD）、患者筛查。然而，本发明的方法并不仅限于用于诊断疾病的目的。另外，本发明的检测突变ALDH1A3基因或ALDH1A3蛋白的方法也可以用于非诊断疾病的目的。所述的非检测疾病的目的包括但不限于研究SNP分布和多态性，用于家族演化研究。本发明可以对小眼畸形和无眼畸形的发病机理提供重要线索，对小眼畸形和无眼畸形的诊断治疗具有十分重要的意义。这样的应用也是本领域技术人员可以理解的。例如，根据本文的描述可以看出，有些个体携带本发明所述的突变ALDH1A3基因但不患小眼畸形和无眼畸形，例如仅一条染色体携带突变的杂合基因型是不患小眼畸形和无眼畸形。对这部分人群的检测可以不涉及任何诊断疾病的目的，因为这些个体并不患病。但对于他们进行检测的结果可以作为例如有用信息使用，例如作为育前检查的重要指标，指导生育，或者用于突变携带者筛查，或者作为SNP分布和多态性研究的工具或者追踪基因突变或家族演化。附图说明图1患者家系图及ALDH1A3突变位点的检测图，示出患者（IV-3、IV-4和IV-5）及其父母（III-1、III-2和III-3）、兄弟（IV-1和IV-2）和祖辈（I-1和I-2；II-1、II-2、II-3和II-4）的关系图。圆框表示女性，方框表示男性。框下方的序列图中显示的为其突变位点ALDH1A3基因c.521GA的检测图。父母III-2和III-3和一个表型正常孩子IV-2具有杂合位点GA;一个患色素性视网膜炎的孩子IV-1则为纯合野生型GG;患者IV-3、IV-4和IV-5）则为纯合突变AA。图2患者（Pt1、Pt2）疾病表型图，其中图A所示为患者Pt2IV-4左眼，可见晶状体及瞳孔异位，和轻微角膜血管翳；图B所示为患者Pt1IV-3右眼，可见和虹膜缺损角膜血管翳。图3突变ALDH1A3基因结构图和突变位臵，以及突变ALDH1A3蛋白图解。图4ALDH1A3蛋白的三级结构模型。图4A所示为羊肝中I型醛脱氢酶四聚体的三级结构。灰色区域所示为4个亚基，红色区域所示为寡聚化结构域的一个β折叠。Cys174（绿色区域所示）落在寡聚化区域的底部，当该位点的半胱氨酸突变为酪氨酸后，会延长酪氨酸侧链，从而在空间结构上与Ile171（蓝色区域所示，落在寡聚化结构域的β-string6的C端）相撞。图4B所示为在原酶中Cys174残基及周围区域，可以看出Cys174残基周围有足够的空间。箭头所指的地方为寡聚化结构域。图4C所示为Cys174Tyr突变蛋白，并示出Tyr174与Ile171（红色圆圈标注部分）相冲撞的地方。这很可能导致β-string6的空间构型改变，从而影响寡聚化结构域的整个结构。野生型ALDH1A3基因的cDNA和所编码的蛋白序列说明（下划线示出本发明相关的突变发生的位臵）：ALDH1A3的cDNA，示出野生型ALDH1A3基因的cDNA的核苷酸序列，1899nt（SEQIDNO:1）：ATGGCCACCGCTAACGGGGCCGTGGAAAACGGGCAGCCGGACAGGAAGCCGCCGGCCCTGCCGCGCCCCATCCGCAACCTGGAGGTCAAGTTCACCAAGATATTTATCAACAATGAATGGCACGAATCCAAGAGTGGGAAAAAGTTTGCTACATGTAACCCTTCAACTCGGGAGCAAATATGTGAAGTGGAAGAAGGAGATAAGCCCGACGTGGACAAGGCTGTGGAGGCTGCACAGGTTGCCTTCCAGAGGGGCTCGCCATGGCGCCGGCTGGATGCCCTGAGTCGTGGGCGGCTGCTGCACCAGCTGGCTGACCTGGTGGAGAGGGACCGCGCCACCTTGGCCGCCCTGGAGACGATGGATACAGGGAAGCCATTTCTTCATGCTTTTTTCATCGACCTGGAGGGCTGTATTAGAACCCTCAGATACTTTGCAGGGTGGGCAGACAAAATCCAGGGCAAGACCATCCCCACAGATGACAACGTCGTGTGCTTCACCAGGCATGAGCCCATTGGTGTCTGTGGGGCCATCACTCCATGGAACTTCCCCCTGCTGATGCTGGTGTGGAAGCTGGCACCCGCCCTCTGCTGTGGGAACACCATGGTCCTGAAGCCTGCGGAGCAGACACCTCTCACCGCCCTTTATCTCGGCTCTCTGATCAAAGAGGCCGGGTTCCCTCCAGGAGTGGTGAACATTGTGCCAGGATTCGGGCCCACAGTGGGAGCAGCAATTTCTTCTCACCCTCAGATCAACAAGATCGCCTTCACCGGCTCCACAGAGGTTGGAAAACTGGTTAAAGAAGCTGCGTCCCGGAGCAATCTGAAGCGGGTGACGCTGGAGCTGGGGGGGAAGAACCCCTGCATCGTGTGTGCGGACGCTGACTTGGACTTGGCAGTGGAGTGTGCCCATCAGGGAGTGTTCTTCAACCAAGGCCAGTGTTGCACGGCAGCCTCCAGGGTGTTCGTGGAGGAGCAGGTCTACTCTGAGTTTGTCAGGCGGAGCGTGGAGTATGCCAAGAAACGGCCCGTGGGAGACCCCTTCGATGTCAAAACAGAACAGGGGCCTCAGATTGATCAAAAGCAGTTCGACAAAATCTTAGAGCTGATCGAGAGTGGGAAGAAGGAAGGGGCCAAGCTGGAATGCGGGGGCTCAGCCATGGAAGACAAGGGGCTCTTCATCAAACCCACTGTCTTCTCAGAAGTCACAGACAACATGCGGATTGCCAAAGAGGAGATTTTCGGGCCAGTGCAACCAATACTGAAGTTCAAAAGTATCGAAGAAGTGATAAAAAGAGCGAATAGCACCGACTATGGACTCACAGCAGCCGTGTTCACAAAAAATCTCGACAAAGCCCTGAAGTTGGCTTCTGCCTTAGAGTCTGGAACGGTCTGGTGAGTTGACTGTGTGTGTATTTCAGCTCTCCTGAGTTGCTTCTTGCTAAGTTCATTATTCTTCTATTAACTGAGAGTTTCTCATTGTTTACATTGTATATTATATACCAAGCCCTGTCTCAGTGCTTCCTTCCATCCTCATGACCATCTTCTGAGGTAGCTGCCATTATGTCTCCATTTCAGAGATGAGAAAATTGAGGCACAGAGAGATGAAGTGACTTGCCCAGGGTCACACAGCTAGCAGATGGCCGAGAGGGCTCCAGTACCTGTGCCTGTGGCCCCTGTGCTGTACTGCCCCTCGTGCCAGGAGCCAGGGGGTCTTCTCCAGATGACTCTGAGCTTTCTTCCATTCTTTTCTAGGATCAACTGCTACAACGCCCTCTATGCACAGGCTCCATTTGGTGGCTTTAAAATGTCAGGAAATGGCAGAGAACTAGGTGAATACGCTTTGGCCGAATACACAGAAGTGAAAACTGTCACCATCAAACTTGGCGACAAGAACCCCTGAALDH1A3蛋白序列，示出ALDH1A3cDNA序列编码的I型醛脱氢酶蛋白3的氨基酸序列，512aa（SEQIDNO:2）：MATANGAVENGQPDRKPPALPRPIRNLEVKFTKIFINNEWHESKSGKKFATCNPSTREQICEVEEGDKPDVDKAVEAAQVAFQRGSPWRRLDALSRGRLLHQLADLVERDRATLAALETMDTGKPFLHAFFIDLEGCIRTLRYFAGWADKIQGKTIPTDDNVVCFTRHEPIGVCGAITPWNFPLLMLVWKLAPALCCGNTMVLKPAEQTPLTALYLGSLIKEAGFPPGVVNIVPGFGPTVGAAISSHPQINKIAFTGSTEVGKLVKEAASRSNLKRVTLELGGKNPCIVCADADLDLAVECAHQGVFFNQGQCCTAASRVFVEEQVYSEFVRRSVEYAKKRPVGDPFDVKTEQGPQIDQKQFDKILELIESGKKEGAKLECGGSAMEDKGLFIKPTVFSEVTDNMRIAKEEIFGPVQPILKFKSIEEVIKRANSTDYGLTAAVFTKNLDKALKLASALESGTVWINCYNALYAQAPFGGFKMSGNGRELGEYALAEYTEVKTVTIKLGDKNP具体实施方式ALDH1A3基因：I型醛脱氢酶蛋白3基因。ALDH1A3蛋白：I型醛脱氢酶蛋白3。发明人收集到一个黎巴嫩裔的近亲结婚家系，父母（如图1中III中的1-3）表型均正常。父亲（III-2）先与其表亲（III-1）结婚，生下四个孩子，其中两个孩子（IV-3和IV-4）出现小眼畸形，一个孩子IV-1患有色素性视网膜炎。III-1死后，父亲再与III-1的妹妹（III-2）结婚，产下一名患者（IV-5）。患者Pt1（图1，IV-3），男，足月生产。经眼科检查发现，他的左眼出现眼睑下垂、角膜血管翳、虹膜缺损和脉络膜及视网膜缺损的症状；右眼（图2B）则表现为晶状体及瞳孔异位。他的双眼皆为远视眼+8,75D+4,25D。精神运动发育正常。患者Pt2（图1，IV-4），女，足月生产。经眼科检查发现，双眼均出现小角膜矾膜化、晶状体及瞳孔移位和小型视神经盘畸形。可能存在虹膜缺损，左眼（图2A）脉络膜缺损，双眼高度近视（-8D）。精神运动发育明显延迟。2岁开始走路，4岁半才能说话。未发现自闭症表征，脑部核磁共振成像（MRI）和脑电图（EEG）结果正常。患者Pt3（图1，IV-5），男，足月生产。经眼科检查发现，右眼表现为无眼畸形，左眼则为小眼，伴随有血管翳、晶状体及瞳孔异位、视神经盘和视网膜缺损。3岁时，左眼发生牵引脱落；现在完全失明。精神运动发育明显延迟。目前9岁，不会说话，可以理解一些简单的命令。具有典型的严重自闭症症状和自残行为。听力正常，无除眼外的其他畸形。脑部MRI结果显示其脑部结构正常，但右视神经很细，左视神经和视神经交叉正常。受试者Pt4（图1，IV-1），男。9岁时被发现有进行性视野缺损。21岁时被诊断出患有色素性视网膜炎。无患小眼畸形的迹象。表型与其他3兄妹相异。整体健康状况及发育正常。根据患者表型，可以确诊3名患者均患有不同程度的小眼畸形和无眼畸形。由于该家系为近亲结婚家系，从系谱图上观察，该疾病很有可能为常染色体隐性单基因遗传病，故发明人利用AgilentSureSelect51MbKit结合IlluminaHiseq2000测序技术对患者Pt1、Pt3和表型正常受试者IV-2（图1）进行了外显子组测序，具体方法参见实施例3。由于家系特点和遗传特征，发明人认为应该优先考虑纯合突变。所以，首先筛选出满足以下要求的突变：2个患者共有的纯合突变；同时，在正常个体中为野生型或杂合突变。然后，通过过滤dbSNP数据库http:hgdownload.cse.ucsc.edugoldenPathhg19databasesnp135.txt.gz中频率大于0.005的变异、千人基因组数据库（www.1000genomes.org）、HapMap8数据库http:snp.cshl.org、YHhttp:yh.genomics.org.cn等公共数据库的过滤，去掉在正常人群中共有的一些常见变异。随后通过去掉同义突变，重点关注剩下的非同义剪接位点突变和微小插入缺失并对其进行优先选择：优先考虑小眼畸形和无眼畸形相关已知致病基因，发明人找到了ALDH1A3基因上的一个新突变，G到A的错义突变c.521GA，导致C174Y的氨基酸改变。基因ALDH1A3编码的一种醛脱氢酶的同工酶，在针对乙醇代谢和脂质过氧化作用中产生的醛类的解毒过程中起着重要的作用。该酶以视黄醛为底物，并参与视黄酸（retinoicacid，RA）的合成。而RA是许多发育和生理过程的信号分子，很多证据都表明RA信号对于眼部正常发育至关重要。RA作为调控基因表达的细胞核受体的配体，在视杯、角膜和眼睑的形成中起着重要的作用。在眼睛发育的早期，ALDH1A3还是沿着背腹轴的RA浓度梯度形成的关键酶。另外，RA还能促进胚胎时期神经系统中神经元的分化。所以ALDH1A3基因很可能与小眼畸形和无眼畸形甚至其他眼科疾病相关。目前已知在3个不同家系中的6个具有ALDH1A3基因突变的小眼畸形和无眼畸形患者同时还存在发育迟缓和或自闭症等精神和运动方面的问题。发明人为了探究导致发育迟缓和或自闭症的可能原因，选取本研究家系中具有比较严重的精神运动发育延迟和自闭的症状的患者IV-5，运用染色体微列阵分析技术（AffymetrixSNP6.0Affymetrix,SantaClara,USA）对IV-5的染色体进行分析。结果在chr5p15.2处发现一个126kb的缺失chr5:11,520,602-11,646,550，影响到CTTNND2基因的外显子3，CTTNND2基因与猫叫综合征患者的智力障碍有关。但该缺失为杂合缺失，且遗传自表型正常的母亲，所以该缺失是否能导致发育迟缓和自闭症的发生尚不能确定。从而，ALDH1A3基因突变与发育迟缓和或自闭症等精神和运动方面的问题是否有关也有待进一步研究。由于外显子组测序存在一定程度的假阳性，接下来，发明人又利用Sanger测序方法，对这个基因的突变位点在家系内进行了验证，ALDH1A3基因在患者Pt1、Pt2和Pt3中均为纯合突变，而在父母III-2和III-3和一个表型正常兄弟IV-2具有杂合位点GA；患色素性视网膜炎的孩子IV-1则为纯合野生型GG。近来发现的ALDH1A3蛋白突变导致小眼畸形和无眼畸形的案例中，通常突变都会导致蛋白的功能或稳定性受影响。所以本发明人对本次发现的突变蛋白进行三维模型构建，来模拟该突变对ALDH1A3蛋白结构功能的影响。本发明人用绵羊肝脏中的I型醛脱氢酶class1aldehydedehydrogenase,PDB数据库ID为1BXS为突变蛋白模板。通过比较野生型和突变蛋白，本发明人发现该突变位点处于寡聚化结构域oligomerizationdomain的基部，这个突变很有可能导致一个大型的酪氨酸侧链在中央β-string6的C端末端与I171发生冲撞。为了避免这种冲突，β-string6可能发生结构变异，从而影响该蛋白的寡聚化结构域。从功能上确定该突变ALDH1A3基因c.521GA为致病突变。与小眼畸形和无眼畸形相关的ALDH1A3基因突变型和与小眼畸形和无眼畸形相关的ALDH1A3基因野生型在序列上的区别是c.521GA。其中c.521GA表示野生型ALDH1A3基因第521位的碱基为G，突变型ALDH1A3基因第521位碱基突变为A。在本发明中，采用本领域通用表示法表示突变。c.521GA表示cDNA第521位核苷酸由G变成A；p.C174Y表示蛋白质水平第174位密码子由C变成Y。在一个实施方案中，突变ALDH1A3基因为SEQIDNO:1的序列表示。在一个实施方案中，ALDH1A3突变蛋白为SEQIDNO:2的序列表示。对于本发明说明书和权利要求书中，提及基因序列，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。例如提及ALDH1A3基因的cDNA序列，实际上包括该序列以及其互补序列。例如，提及SEQIDNO:1，实际包括其互补序列。本领域技术人员还可以理解，利用一条链可以检测另一条链，反之亦然。本申请中的基因序列包括DNA形式或RNA形式，公开其中一种，意味着另一种也被公开。例如提及ALDH1A3基因的cDNA序列，实际也包括相应的RNA序列。下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件（例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社）或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例实施例1样本收集根据世界医学会《赫尔辛基宣言》的要求，患者父母与BGI合作机构丹麦哥本哈根大学附属医院肯尼迪研究中心伦理委员会签署了知情同意书。实施例2样品制备取患者（IV-3，IV-5）和正常受试者（IV-2）的外周静脉血，利用常规酚-氯仿法抽提基因组DNA用于高通量测序。利用分光光度计测量DNA的浓度及纯度，所得的每个标本基因组DNA的OD260OD280均位于1.7-2.0之间，浓度不少于200ngμl，总量不少于6μg。实施例3文库构建和高通量测序1.利用超声波仪（CovarisS2,Massachusetts,USA）将各基因组DNA样本随机打断成100-200bp左右的片段，随后按照制造商提供的操作说明书，在片段两端分别连接上接头制备文库（可参见：http:www.illumina.com提供的IlluminaSolexa标准建库说明书，通过参照将其全文并入本文）。文库检测合格后即可上机测序，以便获得原始测序数据。其中，参照Illumina标准的成簇和测序的步骤进行测序，测序平台为IlluminaHiseq2000。利用IlluminabasecallingSoftware1.7对上述获得的原始测序数据进行处理，经过过滤去污染后，使用SOAPalignerSOAP2（可参见：LiR,LiY,KristiansenK,etal,SOAP:shortoligonucleotidealignmentprogram.Bioinformatics2008,245:713-714；LiR,YuC,LiY,etal.,SOAP2:animprovedultrafasttoolforshortreadalignment.Bioinformatics2009,2515:1966-1967.，通过参照将其全文并入本文）比对到参考基因组GRCh37hg19，以便获得比对到基因组上的唯一比对序列。然后利用SOAPsnp（V.1.03可参见：LiR,LiY,FangX,YangH,etal,SNPdetectionformassivelyparallelwhole-genomeresequencing.GenomeRes2009,196:1124-1132.，通过参照将其全文并入本文）确定靶区域的基因型。Indel采用BWA（version0.5.9-r16）（可参见LiH,DurbinR.Fastandaccuratelong-readalignmentwithBurrows-Wheelertransform.Bioinformatics2010;265:589-595）。2.比对到参考基因组GRCh37hg19，然后利用GATK（versionv1.0.4705）（可参见McKenna,A,HannaM,BanksE,etal.Thegenomeanalysistoolkit:aMapReduceframeworkforanalyzingnext-generationDNAsequencingdata.GenomeResearch2010;209:1297-1303）确定indel的类型。实施例4Sanger法测序验证采集家系内的患者Pt1、Pt2和Pt3及正常受试者III-2、III-3、IV-2和患有色素性视网膜炎的IV-1的外周血，利用常规酚-氯仿法抽提外周血白细胞中的基因组DNA，并利用分光光度计测量DNA的浓度及纯度，所得的每个标本基因组DNA的OD260OD280均位于1.7-2.0之间，浓度不少于200ngμl，总量不少于6μg。样本来源如下：时间地点取样人直接来源2012年7月丹麦哥本哈根市泽伊内普.蒂梅尔原始来源2012年7月丹麦哥本哈根市泽伊内普.蒂梅尔然后，分别对家系内的患者Pt1、Pt2和Pt3及正常受试者III-2、III-3、IV-2和患有色素性视网膜炎的IV-1进行检测，针对ALDH1A3基因5号外显子设计引物，通过PCR扩增、产物纯化、测序的方法获得ALDH1A3基因有关序列，并根据序列测定结果属于突变型还是野生型，验证ALDH1A3与患者临床表型之间的相关性。具体方法步骤如下：1、DNA提取：分别采取家系内的患者Pt1、Pt2和Pt3及正常受试者III-2、III-3、IV-2和患有色素性视网膜炎的IV-1的外周静脉血，按照实施例1的方法提取基因组DNA，分光光度计测定DNA含量。2、引物设计及PCR反应参考人类基因组序列数据库GRCh37hg19设计ALDH1A3基因外显子特异性引物，具体见下表。aALDH1A3基因外显子5的引物序列5’→3’：上游引物CTTGAATCTGGCACCCTTGT（SEQIDNO:3）下游引物AAAGCCGGTCTTAGGAGAGC（SEQIDNO:4）反应条件Ta:60℃;GoTaqPromegab接着，按以下配比分别配臵各基因组DNA样本的PCR反应体系——基于Generel-HotStar：反应体系：30μLc然后，将各PCR反应体系按照以下反应条件分别进行PCR反应：95℃15分钟；40个循环：95℃1分钟，60℃1分钟，72℃1分钟；72℃7分钟；4℃保持。由此，获得患者和家系内正常受试者的PCR扩增产物。3、测序将步骤2中获得的获自患者Pt1、Pt2和Pt3及正常受试者III-2、III-3、IV-2和患有色素性视网膜炎的IV-1的PCR扩增产物直接进行DNA测序（ABI3130XLgeneticanalyzerAppliedBiosystems,FosterCity,CA）。a配臵DNA样本的测序反应体系——基于BigDyeTerminatorv3.1CycleSequencingKit：反应体系：10μLb将各测序反应体系按照以下反应条件分别进行测序98℃1分钟；25个循环：98℃10秒钟，50℃5秒钟，60℃4分钟；4℃保持。患者Pt1、Pt2和Pt3及正常受试者III-2、III-3、IV-2和患有色素性视网膜炎的IV-1的ALDH1A3基因c.521GA突变位点的Sanger测序验证峰图见图1。综上，在患者家族成员中对ALDH1A3基因5外显子进行突变位点验证发现：患者Pt1、Pt2和Pt3均为c.521GA纯合突变，而家系内检测的其他正常受试者为杂合突变或纯合野生型。ALDH1A3纯合突变导致Pt1、Pt2和Pt3出现小眼畸形和无眼畸形的症状，虽然患者具有不一样的临床表型。

权利要求：1.一种小眼畸形和无眼畸形的生物标记物，所述生物标记物包括突变的ALDH1A3基因或ALDH1A3蛋白：c.521GA、p.Cys174Tyr。2.权利要求1的生物标记物，所述突变ALDH1A3蛋白为SEQIDNO:2的序列中具有以下突变：p.Cys174Tyr。3.一种检测突变ALDH1A3基因或ALDH1A3蛋白的方法，所述方法用于非诊断目的，其中所述突变为ALDH1A3基因521GA或ALDH1A3蛋白Cys174Tyr。4.权利要求3的方法，包括使用如下一组引物对进行扩增的步骤：SEQIDNO:3和SEQIDNO:4。5.检测突变ALDH1A3基因或ALDH1A3蛋白中使用的引物对，其中所述引物对分别基于如下的位置在基因组序列或cDNA序列上前后设计，使得扩增该位置：ALDH1A3基因cDNA序列第521位。6.与突变ALDH1A3基因互补的核酸探针，所述突变为ALDH1A3基因c.521GA。所述探针与突变ALDH1A3基因的互补区包括如下的基因组序列或cDNA序列上的位置：ALDH1A3基因cDNA序列第521位。7.检测突变ALDH1A3基因或ALDH1A3蛋白的试剂盒，包含一组引物对，其中所述引物对是基于如下的位置在基因组序列或cDNA序列上设计，使得其扩增产物涵盖该位置：ALDH1A3基因cDNA序列第521位。8.权利要求7的试剂盒，所述引物对为如下的一组：SEQIDNO:3和SEQIDNO:4。9.检测突变ALDH1A3基因的试剂盒，包含与突变ALDH1A3基因互补的核酸探针，所述突变为ALDH1A3基因c.521GA，所述探针与突变ALDH1A3基因的互补区包括如下的基因组序列或cDNA序列上的位置：ALDH1A3基因cDNA序列第521位。

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