申请/专利权人：湖南洪江嵩云禽业有限公司

申请日：2019-01-02

公开（公告）日：2019-05-07

公开（公告）号：CN109722483A

主分类号：C12Q1/6888(2018.01)I

分类号：C12Q1/6888(2018.01)I;C12N15/11(2006.01)I

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.06.25#授权;2019.05.31#实质审查的生效;2019.05.07#公开

摘要：本发明公开了一种黑素亲和素MLPH基因及其作为雪峰乌骨鸡胸肌黑色素性状的遗传标记，通过筛选雪峰乌骨鸡MLPH基因多态性，并测定了雪峰乌骨鸡胸肌黑色素含量，然后将MLPH基因多态性与黑色素性状关联分析，发现在雪峰乌骨鸡MLPH基因内含子1上存在一处CT碱基突变，CC基因型雪峰乌骨鸡胸肌黑色素含量显著高于其他基因型。本发明首次为雪峰乌骨鸡胸肌黑色素性状的标记辅助选择提供了分子标记。

主权项：1.一种MLPH基因，其特征在于，所述基因为与表示雪峰乌骨鸡胸肌黑色素沉积相关基因,序列表如SEQ ID NO:1所示。

全文数据：MLPH基因及用作为雪峰乌骨鸡胸肌黑色素沉积相关遗传标记的方法技术领域本发明属于雪峰乌骨鸡分子生物技术及育种领域，主要是测定与胸肌黑色素沉积相关的遗传标记，具体地说是，是测定MLPH基因中的多态性，即与雪峰乌骨鸡胸肌黑色素沉积相关黑素亲和素MLPH基因的单核苷酸多态性Singlenucleotidepolymorphism，缩写为SNP的存在。背景技术雪峰乌骨鸡是原产于湖南省怀化市的国家级遗传资源地方品种，其肉质鲜嫩，营养丰富，具有保健功效。乌骨鸡药用价值与黑色素相关，《本草纲目》就有“其颜色愈黑者，入药愈佳”的记载，消费者也更倾向选购乌色较深的乌鸡。而雪峰乌骨鸡机体黑色素沉积个体间差异较大，乌度不均一，常规选育进程缓慢。随着生物分子技术的发展，使得我们能够从DNA水平寻找与雪峰乌骨鸡黑色素沉积相关的主效基因或分子标记，并在育种中将其应用于标记辅助选择，一提高选育进程，获得更大的经济效应。黑素亲和素melanophilin，MLPH是协助黑色素小体转运的一种重要的结构蛋白。在黑色素细胞中，MLPH与三磷酸鸟苷结合蛋白RAB27A、肌球蛋白5amyosin5a，MYO5A形成复合结构连接肌球蛋白和黑色素小体，协助黑色素小体的转运，使黑素小体在黑素细胞树突末梢聚集，并释放到周围组织中沉积，调控动物皮肤和被毛的颜色。国内外大量研究表明，哺乳动物中，MLPH基因的结构突变，会引起黑色素转运机制障碍，导致黑色素无法沉积机体组织。刘杰等研究发现，MLPH基因在20周龄浙东白鹅母鹅中的表达存在组织特异性，在黑化部位眼睛中表达量最高，在背部皮肤、腹部皮肤及脚蹼中表达量较低，而在心脏、肝脏等部位未检测到表达，这种表达规律与鹅的黑色素沉着规律一致，证明了MLPH基因与黑色素沉积有关。雪峰乌骨鸡DNA遗传标记、遗传多样性和相关功能基因的研究仍处于起步阶段，且没有关于雪峰乌骨鸡MLPH基因的报道。发明内容针对上述现有技术的不足，提供一种MLPH基因及其作为雪峰乌骨鸡胸肌黑色素性状遗传标记的用途；同时筛选与雪峰乌骨鸡胸肌黑色素性状相关的SNP，以期应用于标记辅助选择或标记辅助渗入，并提供上述遗传标记在雪峰乌骨鸡标记辅助选择中的应用。本发明实施例是这样实现的，一种MLPH基因，所述基因为与表示雪峰乌骨鸡胸肌黑色素沉积相关的基因。进一步，所述基因内含子1序列第19bp有一处碱基突变C→T。进一步，克隆包括MLPH基因内含子1序列所用引物如下：正向引物：5’-TCAATGCTTCCTTTCACCCAG-3’反向引物：5’-ATCCCTTCCAACCTAAGACATCC-3’本发明实施例的另一目的在于提供一种用MLPH基因作为雪峰乌骨鸡胸肌黑色素沉积相关遗传标记的方法，包括如下步骤：1根据GenBank中鸡MLPH基因的序列，用Primer5.0设计引物，覆盖该基因内含子1；2以上述雪峰乌骨鸡基因组DNA为模板，PCR扩增，产物纯化，克隆，获得如序列表SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；3鉴定该基因内含子1序列的第19碱基处是否存在多态性。进一步，所述方法选择雪峰乌骨鸡作为研究对象，采用分子生物学的方法筛选雪峰乌骨鸡胸肌黑色素性状相关基因，其步骤如下：1选择相同批次健康雪峰乌骨鸡200只进行饲养试验；2根据MLPH基因的序列设计引物，对样品进行扩增、测序；3筛选与胸肌黑色素沉积相关的SNP。雪峰乌骨鸡相关基因SNP筛选选择相同日龄的健康雪峰乌骨鸡200只进行饲养试验。对该些雪峰乌骨鸡胸肌黑色素含量进行测定，并从高黑色素含量和低黑色素含量样本中分别提取其基因组DNA。根据GenBank中鸡MLPH基因序列，用Primer5.0设计引物，覆盖该基因外显子1及内含子1部分序列，引物序列为：5′-TCAATGCTTCCTTTCACCCAG-3′正向，5′-ATCCCTTCCAACCTAAGACATCC-3′反向，由湖南擎科生物技术有限公司合成。用上述引物分别对雪峰乌骨鸡基因组DNA进行扩增。PCR：20μl反应体系：2×Mastermix12μl，上下游引物10μmolL各0.8μl，DNA模板1μl，超纯水补至所需体积。PCR扩增程序：95℃5分钟预变性后34个PCR循环，参数为：95℃30秒，57.6℃30秒，72℃30秒，最后72℃5分钟。取PCR产物5μl进行凝胶电泳，检测产物片段大小是否符合目的片段大小。取PCR扩增产物30μl，产物纯化后送湖南擎科生物技术有限公司测序，测序结果确证了PCR产物是MLPH基因，序列如表中的SEQIDNO：1所示。图1是突变位点和测序峰图。上述实验结果表明，从雪峰乌骨鸡胸肌提取的黑色素性状相关基因为MLPH基因，并且在该基因序列中筛选到与胸肌黑色素沉积有关的SNP，很可能这就是影响雪峰乌骨鸡胸肌黑色素原因。与雪峰乌骨鸡胸肌黑色素有关的SNP在生产实践中的验证选择相同日龄及相同饲养管理条件的健康雪峰乌骨鸡44只进行饲养试验。所有供试雪峰乌骨鸡于120日龄进行屠宰，测定胸肌黑色素含量。用提取的44只雪峰乌骨鸡胸肌组织样基因组DNA，并利用实施例1中的引物扩增，并按照实施例1的方法检测其SNP。1、PCRPCR反应体系如下表所示：表1PCR反应体系PCR循环参数如下：34个循环：95℃，5min；95℃，30s；57.6℃，30s，72℃，30s；72℃，5min2、MLPH基因SNP位点基因型频率分析通过卡方检验突变位点基因型频率与等位基因频率，结果如表2所示，该位点处于Hardy-Weinberg平衡中P0.05。表2SNP位点基因型和基因频率3、MLPH基因与雪峰乌骨鸡胸肌黑色素性状的相关分析分析不同SNP基因型对雪峰乌骨鸡胸肌黑色素含量的影响，结果见表3，从下表3中可见：不同SNP基因型对雪峰乌骨鸡胸肌黑色素沉积有显著影响；其中CC基因型雪峰乌骨鸡胸肌黑色素含量比CT基因型胸肌黑色素含量高60.20％，达到显著水平P0.05。表2SNP位点基因型和基因频率3、MLPH基因与雪峰乌骨鸡胸肌黑色素性状的相关分析分析不同SNP基因型对雪峰乌骨鸡胸肌黑色素含量的影响，结果见表3，从下表3中可见：不同SNP基因型对雪峰乌骨鸡胸肌黑色素沉积有显著影响；其中CC基因型雪峰乌骨鸡胸肌黑色素含量比CT基因型胸肌黑色素含量高60.20％，达到显著水平P湖南洪江嵩云禽业有限公司MLPH基因及用作为雪峰乌骨鸡胸肌黑色素沉积相关遗传标记的方法1PatentInversion3.11313DNA鸡（chicken）mutation19y=c或t1gtgagtacctgtgcctgcyaatgggagctacgggctccttcatctcgtgttgagcatgga60taaagcggtgggcatggaggagagggctgtaaactgaaggtagtgattgataggtgatgt120tatcagctgtgtcagtgtaaccagggcagttgatggggcagcctgtccggccccgctcag180tatatcccactggctggtgggatccatttcctaaggagtccttagccatgtggttaagtg240gggtcttctgccactgtgttgtctcatatgcttcatagaacagaatcataggatgtctta300ggttggaagggat313

权利要求：1.一种MLPH基因，其特征在于，所述基因为与表示雪峰乌骨鸡胸肌黑色素沉积相关基因,序列表如SEQIDNO:1所示。2.如权利要求1所述的MLPH基因，其特征在于，所述MLPH基因序列内含子1上第19bp处有TC的碱基突变，导致多态性存在。3.检测如权利要求1或权利要求2所述的MLPH基因，其特征在于：所用引物序列如下：正向引物：5’-TCAATGCTTCCTTTCACCCAG-3’反向引物：5’-ATCCCTTCCAACCTAAGACATCC-3’。4.一种用MLPH基因作为雪峰乌骨鸡胸肌黑色素沉积相关遗传标记的方法，其特征在于，包括如下步骤：1在GenBank下载鸡MLPH基因序列，用Primer5.0设计引物，覆盖该基因内含子1序列；2以雪峰乌骨鸡基因组DNA为模板，PCR扩增，产物纯化，正向测序一个反应，获得如序列表SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；3鉴定该基因内含子1序列的第19碱基处是否存在突变。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法选择雪峰乌骨鸡作为研究对象，采用分子生物学的方法筛选雪峰乌骨鸡胸肌黑色素性状相关基因，其步骤如下:1选择相同批次健康雪峰乌骨鸡200只进行饲养试验；2根据MLPH基因的序列设计引物，对样品进行扩增、测序；3筛选与胸肌黑色素沉积相关的SNP。

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