申请/专利权人：中国农业科学院农业基因组研究所

申请日：2016-11-11

公开（公告）日：2019-08-20

公开（公告）号：CN106566828B

主分类号：C12N15/10(20060101)

分类号：C12N15/10(20060101);C40B50/06(20060101);C12Q1/6869(20180101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2019.08.20#授权;2017.05.17#实质审查的生效;2017.04.19#公开

摘要：本发明公开了一种高效的全基因组染色质构象技术eHi‑C。本发明提供了一种细胞eHi‑C测序技术，包括如下步骤：1裂解细胞得到染色质；2将所述染色质依次经酶切、DNA末端标记、钝端环化连接、DNA纯化，得到纯化后环状DNA；3引入作为内参的环状共沉淀DNA分子；4超声打断；5免疫磁珠抓取带有所述标记物的DNA片段；6用所述带有所述标记物的DNA片段制备eHi‑C测序文库。本发明的实验证明了，本发明的方法细胞需要量少，较易获得实验材料，节约收集材料时间，大大降低细胞培养成本，试剂耗材成本，降低试验误差。

主权项：1.一种细胞eHi-C测序文库的制备方法，包括如下步骤：1）裂解细胞得到染色质；所述裂解为先裂解所述细胞的细胞膜，得到细胞核；再裂解所述细胞核，得到染色质；2）将所述染色质依次经酶切、DNA末端标记、钝端环化连接、DNA纯化，得到纯化后环状DNA；3）将纯化后环状DNA和作为内参的环状共沉淀DNA分子混匀，得到混合物；再将所述混合物依次经外切酶酶切去除线性化DNA和再次进行所述DNA纯化的步骤，得到纯化后环状共沉淀DNA和环状DNA混合物；4）将所述纯化后环状共沉淀DNA和环状DNA混合物超声打断，得到片段化环状共沉淀DNA和环状DNA混合物；5）从所述片段化环状共沉淀DNA和环状DNA混合物中用免疫磁珠抓取带有所述标记物的DNA片段；6）用所述带有所述标记物的DNA片段制备eHi-C测序文库；步骤1）中，所述裂解所述细胞的细胞膜为用含有质量百分含量0.1%SDS和质量百分含量1%PI的裂解缓冲液裂解；所述裂解所述细胞核为先用含有质量百分含量为1%SDS和质量百分含量1%PI的裂解缓冲液裂解，再用含有质量百分含量0.1%SDS和质量百分含量1%PI的裂解缓冲液裂解；步骤1）中，所述细胞的数量为大于等于1million；步骤2）中，所述酶切将所述染色质用限制性内切酶缓冲液重悬，得到重悬后染色质；将所述重悬后染色质和所述限制性内切酶混匀，反应，得到酶切后DNA；步骤2）和步骤3）中，所述DNA纯化采用磁珠纯化的方式；步骤3）中，所述作为内参的环状共沉淀DNA分子为质粒DNA分子；步骤3）中，所述外切酶为Lambda和RecJf。

全文数据：一种高效的全基因组染色质构象技术eHi-C技术领域本发明涉及基因组测序技术领域，具体涉及一种高效的全基因组染色质构象技术eHi-C。背景技术三维3D基因组学是研究基因组三维空间结构及其功能的学科。具体是指对基因组序列、基因结构及其调控元件、基因组序列在细胞核内的三维空间结构及其对基因转录、复制、修复和调控等生物过程中的功能进行研究。三维基因组的相关测序技术，目前主要有JobDekker研发的Hi-CHigh-throughputresolutionchromosomeconformationcapture和阮一骏教授研发的ChIA-PETChromatinInteractionAnalysiswithPaired-EndTagSequencing技术李国亮,阮一骏，2014，科学通报。Hi-C技术是以高通量测序为基础，全基因组范围所有特异和非特异的染色质相互作用捕获技术。利用高通量测序技术，结合生物信息学分析方法，可以研究获得全基因组范围内染色质一维互作连接图、二维相互作用频率热图、全基因组染色质相互作用调控网络和三维结构可视化信息ErezLieberman-Aiden,2009,Science；LucaGiorgetti,2016,Nature，能进行基因组单体型分析JanOKorbel，2013，NatureBiotechnology和辅助基因组组装JoshuaNBurtonetal,2013,NatureBiotechnology，还能揭示较大的核染色质区间真染色质和异染色质及染色质疆域在三维空间位置上的互作、功能关系MatteoVietriRudan，2015，CellReport。大量基因组调控作用元件在人和小鼠全基因组上被发掘和注释，但是他们的靶标基因大部分仍然不清楚。从3C到6C在全基因组覆盖度上和染色质相互作用无偏性上，均比较局限。Hi-C是3C衍生技术，可以说是全基因组3C分析，无论在分辨率、覆盖度、无偏性上正好能解决这些问题FulaiJinetal,2013,Nature。基因组测序研究，样品选择和制备是重要环节，是获取科学有效的生物信息分析成果的前提，而样本准备的难易程度也决定了是否能顺利开展课题、项目，Hi-C技术可以产生无差别的染色质远程交互作用数据,用于建立三维基因组的基本空间结构，用于农业方面的研究和人类健康研究，主要以细胞为研究对象。获得细胞的方法主要是两种：培养细胞系和从组织直接分离细胞。目前，标准Hi-C技术细胞的数量要达到2.5×10725million个ErezLieberman-Aiden,2009,Science。标准试验技术需要的细胞量比较大，收集足够细胞耗时；实验材料数量要求较多，导致细胞培养成本提高；所需细胞数量较大也会导致实验误差增大；所获数据在全基因组范围内互作分辨率低。因此亟需开发一种高效的、基于通用单培养皿细胞量6CM-10CM就能进行Hi-C测序建库的技术——eHi-C。发明内容本发明的一个目的是提供一种细胞eHi-C测序文库的制备方法。本发明提供的方法，包括如下步骤：1裂解细胞得到染色质；所述裂解为先裂解所述细胞的细胞膜，得到细胞核；再裂解所述细胞核，得到染色质；2将所述染色质依次经酶切、DNA末端标记、钝端环化连接、DNA纯化，得到纯化后环状DNA；3将纯化后环状DNA和作为内参的环状共沉淀DNA分子混匀，得到混合物；再将所述混合物依次经外切酶酶切去除线性化DNA和再次所述DNA纯化的步骤，得到纯化后环状共沉淀和环状DNA混合物；4将所述纯化后环状共沉淀和环状DNA混合物超声打断，得到片段化环状共沉淀和环状DNA混合物；5从所述片段化环状共沉淀和环状DNA混合物中用免疫磁珠抓取带有所述标记物的DNA片段；6用所述带有所述标记物的DNA片段制备eHi-C测序文库。步骤6中，用带有所述标记物的DNA片段制备eHi-C测序文库为将带有所述标记物的DNA片段依次经末端修复和加尾反应、加接头、PCR扩增和切胶选择文库的步骤，得到eHi-C测序文库。所述选择文库大小为100bp-700bp。上述方法中，步骤1中，所述裂解所述细胞的细胞膜为用含有质量百分含量0.1％SDS和质量百分含量1％PI的裂解缓冲液裂解；所述裂解所述细胞核为先用含有质量百分含量为1％SDS和质量百分含量1％PI的裂解缓冲液裂解，再用含有质量百分含量0.1％SDS和质量百分含量1％PI的裂解缓冲液裂解。所述含有质量百分含量0.1％SDS和质量百分含量1％PI的裂解缓冲液配方由质量百分含量1％PI、150mMNaCl、1mMEDTA、体积百分含量1％TritonX-100、质量百分含量0.1％脱氧胆酸钠、质量百分含量0.1％SDS和浓度为50mM、pH值为7.5HEPES-KOH缓冲液组成；所述含有质量百分含量为1％SDS和质量百分含量1％PI的裂解缓冲液配方由质量百分含量1％PI、150mMNaCl、1mMEDTA、体积百分含量1％TritonX-100、质量百分含量0.1％脱氧胆酸钠、质量百分含量1％SDS和浓度为50mM、pH值为7.5HEPES-KOH缓冲液组成；上述方法中，步骤2中，所述酶切将所述染色质用限制性内切酶缓冲液重悬，得到重悬后染色质；将所述重悬后染色质和所述限制性内切酶混匀，反应，得到酶切后DNA；或，所述限制性内切酶为HindIII。上述方法中，步骤2中，在所述酶切步骤中，在所述重悬和所述反应之间还包括如下步骤：将在所述重悬后染色质用SDS去除不与DNA直接交联的蛋白的步骤。上述方法中，步骤2中，所述DNA末端标记为将带有标记物的dNTP引入所述酶切得到的产物中；或所述标记物为生物素，所述标记物通过biotin-14-dCTP引入。上述方法中，步骤2中，所述钝端环化连接采用的连接反应液中含有或不含有PEG8000；或所述连接反应液由TritonX-100、BSA、ATP、Tris-HCl、MgCl2、DTT和水组成；或所述连接反应液由TritonX-100、BSA、ATP、Tris-HCl、MgCl2、DTT、PEG8000和水组成。上述方法中，步骤2和步骤3中，所述DNA纯化采用磁珠纯化的方式；或所述磁珠纯化中的磁珠为磁珠原液或磁珠原液的稀释液；或所述磁珠原液的稀释液为将所述磁珠原液稀释10倍得到的稀释液；所述稀释采用的稀释缓冲液为Beadssolution，其由质量百分含量30％PEG8000水溶液:5MNaCl水溶液按照体积比1:1混匀得到。或步骤3中，所述作为内参的环状共沉淀DNA分子为质粒DNA分子；或步骤3中，所述外切酶为Lambda和RecJf；或步骤4中，所述超声打断的Intensity为105。上述方法中，步骤1中，所述细胞的数量为大于等于1million；或所述细胞的数量为1-3million。由上述的方法制备的eHi-C测序文库也是本发明保护的范围。或上述方法或所述制备的eHi-C测序文库在细胞eHi-C测序中的应用也是本发明保护的范围；本发明第三个目的是提供一种细胞eHi-C测序方法。本发明提供的方法，包括如下步骤：1用上述的建库法的步骤，得到eHi-C测序文库；2对所述eHi-C测序文库进行测序。本发明第四个目的是提供一种用于细胞eHi-C测序的试剂盒。本发明提供的试剂盒，包括上述的建库法中所有试剂的任一种或任意组合。本发明在标准方法5_Standard组，即为对照组的基础上根据以上三个优化步骤又增设了1_Option组、2_Beads组、3_3M组仅细胞量在该组改为3million、4_T4组和6_Phix建库对照，为ΦX174噬菌体的DNA，序列是已知，无Index，如图2。其中1_Option、2_Beads、4_T4各组之间仅在所述步骤优化，其余步骤与3_3M、5_Standard组一样。以上任一优化组自由组合，均可以达到制备高质量eHi-C文库。所述建库方法，主要针对少量1-3million细胞进行群体细胞高效全基因组染色质构象技术eHi-C测序建库。与ErezLieberman-Aiden的方法需要25million个细胞.Science,2009、MatteoVietriRudan的方法需要10million.CellReport,2015相比，细胞需要量少，较易获得实验材料，节约收集材料时间，大大降低细胞培养成本，试剂耗材成本，降低试验误差。本发明所提供的方法适用于低至1million的群体细胞全基因组染色质构象技术eHi-C测序建库，与Hi-C标准方法ErezLieberman-Aiden，Science,2009和国内主流Hi-C测序公司需求细胞数量25million甚至100milion相比，具有以下优点：1应用本发明技术方案，能对数量低至1million细胞的进行全基因组染色质构象技术eHi-C建库测序。大大降低细胞需要量、细胞培养成本和建库成本。本发明方法操作简单、与时俱进，能够适用于包括小鼠C2C12细胞系在内的哺乳动物体外培养的多种细胞系。2改良了标准Hi-C测序步骤，选择采用0.1％SDSFA细胞裂解缓冲液穿孔裂解细胞膜和1％SDSFA细胞核裂解缓冲液穿孔裂解细胞核膜，效果显著。DNA磁珠纯化中无需再进行酚仿抽提和RNA酶消化。对于环化连接效率检测，创新性的引入了环化的共沉淀DNA，环化效率一目了然。Lambda和RecJf外切酶切碎线性DNA，尽量消除未环化DNA“噪音”。且与JobDekke的标准Hi-C相比，将生物素DNA免疫磁珠纯化步骤提前，加上出库前PCR时才进行切胶纯化反应，大大降低了样品损耗。3全程利用磁珠纯化方式，与标准Hi-C的酚仿抽提相比，简化了步骤，节约了试剂，尤其Tris-饱和酚和氯仿都是剧毒试剂。4本发明升级版本,在如下步骤可以替换：DNA纯化时采用30％PEG8000Beads稀释溶液达到同样纯化效果同时进一步节约成本；酶切前增加1％SDS去除液A和10％TrionX-100去除液B除净与DNA未交联的蛋白，增加酶切、环化效率；末端环化连接时替换T4连接酶缓冲液中超纯水为质量百分含量7.5％PEG8000可稍微调低连接效率，根据需要进行负向调整。5目前市场上未有Hi-C建库试剂盒，本发明能开发成适用于与现阶段最流行的Miseq,Hiseq2500和Hiseq3000测序仪的一种细胞易得省时、操作快捷省事、商业前景广阔省心的高效全基因组染色质构象技术eHi-C建库试剂盒及其升级版。也能基于此试剂盒开发成一种可用于1-3milion群体细胞的自动加样eHi-C建库装置。附图说明图1为本发明主要步骤流程图。图2为本发明细胞数量优化标准处理及其他步骤备选优化处理。图3为试验一一中C2C12细胞汇合率达到70-80％时a细胞状态和b细胞自动计数仪结果。图4为试验五一中预试验2结果，图4a各泳道依次为：M,1kbMarker；质粒,NgAgo质粒；HindIII线性化，HindIII线性化质粒后的结果；Mixture，200ng质粒和200ng线性DNA混合的得到的Mixture；整个图中一共三条带相应分别为开环DNA、线性DNA和超螺旋。图4b各泳道依次为：M,1kbMarker；质粒,NgAgo质粒；HindIII线性化，HindIII线性化质粒后的结果；Lambda和RecJf外切酶消化Mixture，一倍酶量、两倍酶量和三倍酶量的结果；质粒,NgAgo质粒。图4上样量统一为100ng。图5为试验五二中环化的DNA被Covaris220超声波片段化后的E-gel电泳检测结果。图5a,打断前对照；图5b,打断后。1—5为五个处理组；M为100bpMarker.图6为试验六2XKAPAHiFiHotStartPCRE-gel检测结果。a为切胶前，b为切胶后。M，100bpMarker；PCR设定了18循环和28循环，1—5为五个处理组。图7为试验六上机测序结果质控—Q值热图。图8为试验六上机测序结果质控—碱基比例图％。图9为试验六上机测序结果质控—错误率Errorrate。图10为试验六上机测序结果质控—大于Q30Q值≥30的值所占的百分比。图11为试验六上机测序结果质控—Q值分布柱形图。图12为试验六上机测序结果质控—混合样本的均一度及对应数据表。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到，均为自常规测序建库生化试剂商店ThermoFisher、NEB、KAPA、Illumina等购买，所用水均为UltrapureDistilledWaterThermoFisher。以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。除主要建库步骤外的其余三种优化步骤，均可根据需要与主要步骤替换进行。下面将结合参考附图和实施例来详细说明本发明。实施例1、细胞eHi-C测序文库的制备及其在测序中的应用5-standard图1为本发明主要步骤流程图。一、裂解细胞制备染色质一、细胞收集与交联固定1、当培养皿10CM中细胞汇合率达到70-80％的时候C2C12细胞CRL-1772TM数约2million，如图3，a,细胞状态放大倍数100×；b,细胞自动计数仪结果，通过移液枪吸量的方式检测培养液的体积；2、向其中加入质量百分含量37％甲醛水溶液280ul，使其终浓度为1％，将培养皿放到旋转器上常温摇晃10分钟或37℃培养箱孵育10min；3、向其中加入2.5M甘氨酸水溶液0.89ml，使其终浓度为0.2M猝灭甲醛，放回旋转器常温振荡5分钟或常温摇晃几下，均匀后，静置5分钟；4、去除培养液，用预冷的1×PBS10ml洗细胞两次。5、去除大部分PBS并在盘中剩余0.5mlPBS，用细胞铲刀将细胞刮下，用移液器将细胞吸入新1.5ml离心管中，放在冰上，用1ml质量百分含量0.5％BSAPBS冲洗细胞，收集剩余的细胞到该离心管中。6、350g4℃离心5min。去除上清，得到固定后细胞，冻存-80℃或直接进行下一步。二、细胞膜裂解1、取四管-80℃冻存的一管约2million固定后细胞，解冻团块，放于冰上,加入冰冷的1×PBS分装五管四管1million，一管3million，如图2，一管1million进行如下eHi-C标准步骤。2、用1.0ml0.1％SDSFA细胞裂解缓冲液质量百分含量1％PI，50mMpH7.5HEPES-KOH，150mMNaCl，1mMEDTA，体积百分含量1％TritonX-100，质量百分含量0.1％脱氧胆酸钠，质量百分含量0.1％SDS重悬上述1的细胞团；在4℃冷室中旋转仪器名字：QB-210Multipurposeshaker裂解15min.4℃500g离心5min.去除上清。3、重复步骤2，收集沉淀，得到细胞核团块。细胞团块主要是细胞核，呈白色。-80℃保存细胞核团块或者继续进行细胞核裂解。三、细胞核裂解1、解冻-80℃保存上述二得到的细胞核团块，放于冰上。2、先用1.0ml1％SDSFA细胞核裂解缓冲液质量百分含量1％PI，50mMpH7.5HEPES-KOH，150mMNaCl，1mMEDTA，1％体积百分含量TritonX-100，质量百分含量0.1％脱氧胆酸钠，质量百分含量1％SDS重悬细胞团；在4℃冷室中旋转裂解15min；10℃20,000g离心15min.去除上清。3、再加1.0ml0.1％SDSFA细胞裂解缓冲液含1％PI重悬先加300ul,并用1ml移液枪的枪头将团块打碎，再补齐到1.0ml；在4℃冷室中旋转裂解15min.4℃20,000g离心15min.去除上清；得到染色质。二酶切染色质用500ul1×NEBuffer2NEB；#B7002S吹洗上述一获得的染色质团块，4℃20,000g离心15min.去除上清。重复一次。用枪头再次打碎团块，加35.5ul1×NEBuffer2，尽可能重悬混合完全，得到重悬后染色质；再向重悬后染色质中加入2ul共40UHindIIINEB；R0104L37℃裂解过夜，得到酶切后DNA。三、DNA末端标记和钝端环化连接1、取3.3uldNTP混合物1.5ul10mMdATP，1.5ul10mMdGTP，1.5ul10mMdTTP和37.5ul0.4mMbiotin-14-dCTPThermoFisher；19518018和1ul5UulKlenowNEB酶加入酶切后DNA中，混匀，37℃孵育45min,补齐并标记DNA末端，之后放于冰上，得到标记后DNA分子；加入6.8ul质量百分含量10％SDS终浓度约15％65℃孵育30min，将酶灭活。之后迅速放置于冰上。2、向标记后DNA分子中添加新制备的608ul连接反应液59.4ul体积百分含量10％TritonX-100水溶液，59.4ul10×ligationbuffer500mMpH7.5Tris-HCl,100mMMgCl2,100mMDTT；6.4ul10mgmlBSA水溶液；6.4ul100mMATP水溶液；477ul超纯水，混匀后加入4ulT4DNAligase1Uul,16℃孵育过夜，进行钝端连接，得到环状DNA。四、DNA纯化1、为了解耦交联并裂解蛋白，向每个样品管中加入4ulproteinaseK10mgml,65℃孵育至少1h。2、加入792ulAmpureXPbeadsBeckmanCoulter；A63881150ul原装Beads用Beadssolution质量百分含量30％PEG8000水溶液和5MNaCl水溶液按照体积比为1:1混匀稀释10倍，混匀，常温静置5min。3、将含有beads的样品放于磁力架上，静置5分钟，溶液变澄清。4、移液枪吸出上清液，加入700ul新鲜制备的80％EtOH乙醇溶液，体积分数85％，清洗两次。添加时保证样品管始终在磁力架上，每次清洗时，常温孵育30秒。5、第二次清洗时，略微旋转样品管，重新放回磁力架上，用10ul移液枪去除残余的EtOH，常温5min晾干。6、加入38ul超纯水，简单涡旋混合。放回磁力架，约5min后溶液变澄清，将上清液转移到新的1.5ml离心管中，得到纯化后环状DNA。五、引入环状共沉淀DNA1、将3.5ul环状共沉淀DNANLS-NgAgo-pcDNA3.1；Miaolingbio；VT1161-03；添加环状共沉淀DNA，为了作为对照观察打断效果,8246bp，保证500ng-1ug加入到上述四得到的纯化后环状DNA中，得到加入质粒后的样品。2、用LambdaNEB；M0262L和RecJfNEB；M0264L外切酶37℃消化1h尽量消除线性化DNA，增加环化效率；具体：加入质粒后的样品38.5ul,10×Lambda外切酶缓冲液5ul,Lambda外切酶0.5ul,RecJf外切酶3ul，得到消化后产物。六、DNA再次纯化A、再次纯化将五得到的消化后产物再次进行AmpureXPbeads纯化，方法与四相同；具体如下：60ulAmpureXPbeads50ul原装Beads用Beadssolution30％PEG8000水溶液:5MNaCl水溶液＝1:1稀释10倍后使用,剩余放入4℃冰箱下次再用加入消化后产物混匀，常温静置5min；将含有beads的样品放于磁力架上，静置5分钟，溶液变澄清。移液枪吸出上清液，加入500ul新鲜制备的80％EtOH乙醇，体积分数85％，清洗两次。添加时保证样品管始终在磁力架上，每次清洗时，常温孵育30秒。第二次清洗时，略微旋转样品管，重新放回磁力架上，用10ul移液枪去除残余的EtOH，常温5min晾干。加入130ulTE缓冲液，吸打或简单涡旋混合，得到纯化后环状共沉淀和环状DNA混合物。B、两个预试验预试验1、beads原液稀释倍数摸索Qubit3.0测得质粒DNANLS-NgAgo-pcDNA3.1浓度为25.6ngul，取3份20ul质粒512ng，进行三种纯化处理：beads原液组、Beadssolution5倍稀释组和Beadssolution10倍稀释组，处理方式为A中所示的AmpureXPbeads纯化方法，结果如表1所示，表明，Beads稀释在保证效果的前提下节约成本，10倍稀释Beads与5倍稀释效果相当。表1为不同稀释倍数磁珠纯化比较预试验2、Lambda和RecJf外切酶消除线性化DNA是否进行针对Lambda和RecJf外切酶消除线性化DNA进一步详细测试，结果显示线性化消除高效，如图4。质粒NLS-NgAgo-pcDNA3.1；Miaolingbio；VT1161-03用HindIII过夜酶切，酶切体系为：质粒NgAgo，256ngul2ul,HindIII2ul,1×NEBuffer236ul.2个重复，共得到至少800ng线性DNA；取200ng质粒和200ng线性DNA混合的得到Mixture；将线性DNA、质粒和Mixture按照A中所示的AmpureXPbeads纯化方法纯化，电泳，上样量统一为100ng,结果如图4a所示，Mixture中明显分开了三种不同形式的DNA：开环DNA，线性DNA，超螺旋DNA。将Mixture按照表2所示的不同酶切体系进行酶切，得到1倍酶切后Mixture、2倍酶切后Mixture和3倍酶切后Mixture。将质粒、线性DNA、1倍酶切后Mixture、2倍酶切后Mixture和3倍酶切后Mixture分别再按照A中所示的AmpureXPbeads纯化方法纯化，电泳，上样量统一也为100ng.表2不同的倍数的外切酶对Mixture中线性DNA消除结果如图4b，可以看出，1倍外切酶切处理后，消除线性DNA效果就立显与图4a中Mixture对比，随着酶量增多，消除效果增加。七、超声打断将130ul六的A获得的纯化后环状共沉淀和环状DNA混合物Beads已经被除去转移到microTUBEAFACovaris220管中，按程序设定DutyCycle5％，Intensity105，CyclesperBurst200，Time240s打断环化DNA，得到片段化环状共沉淀和环状DNA混合物。检测超声打断效率，取10ul片段化环状共沉淀和环状DNA混合物跑E-gel检测声波降解法的效率，结果如图5所示,图5a为对照设定Intensity5时现有的Hi-C技术设定参数，未打断，图5b为片段化环状共沉淀和环状DNA混合物的打断结果，可以看出，本发明的方法弥散，超声打断效果好。八、免疫磁珠抓取先混匀MyOneTMStreptavidinT1溶液Lifetechnologies；65602，然后向每个PCR管中加入50ul混匀后的Dynabeads原溶液。用150ul2xB&W缓冲液10mMpH7.5Tris-HCl，1mMEDTA，2MNaCl清洗Beads两次清洗时，轻弹管壁，常温800rpm简单旋转，放磁力架MagneticStand-96上至少2min，去除缓冲液。120ul2xB&W缓冲液重悬。转移120ul上述七得到的片段化环状共沉淀和环状DNA混合物到120ul清洗过的Dynabeads悬浮液中总体积240ul。常温孵育，并旋转仪器Intelli-Mixer混匀30min。用150ul1xB&W缓冲液用2×稀释一倍得到清洗Beads两次清洗时，轻弹管壁，常温800rpm简单旋转放磁力架上至少2min，去除缓冲液。加22.5ul超纯水溶解Beads，得到生物素标记DNA片段，去除了环状共沉淀相关片段。之后步骤全伴随免疫磁珠进行。九、文库制备1、末端修复和加尾反应体系为：上述八得到的生物素标记DNA片段样品22.5ul,EndRepair&A-Tailing缓冲液，3.5ul,KAPAFrag缓冲液10X2.5ul,EndRepair&A-Tailing酶1.5ulKAPABiosystems；KK8502.轻轻涡旋震荡，冰浴，转移到PCR仪上立即进行孵育20℃,30min65℃,30min；4℃，∞，得到末端修复和加尾反应产物。2、加接头制备连接混合液末端修复和加尾反应产物30ul,Adapter储存液Illumina；MiSeqReagentKitv3150-cycle；MS-102-30012ul,超纯水3ul,连接缓冲液15ul,DNA连接酶5ul。完全混匀，轻微离心。快速进行Adapter连接。20℃孵育15min，得到加接头后产物。3、PCR扩增制备PCR混合物2XKAPAHiFiHotStartReady预混液KAPABiosystems；KK850210ul,10XKAPA文库扩增引物预混液KAPABiosystems；KK85022ul，2得到的加接头后产物1ul,超纯水9ul，彻底混匀，简单离心。按如下程序设置PCR。预变性：98℃1min；18或28个循环变性：98℃15s；退火：60℃30s；延伸：72℃30s；终延伸：72℃5min；保存：10℃∞min。得到PCR产物。取5ulPCR产物跑E-gel,进行Smear条带观察质量控制，如图6a，可以看出18个循环即可正好满足250-500bp的切胶范围；28个循环已经扩增过度。4、选择文库使用胶回收试剂盒进行大小100bp-700bp本次取250-500bp片段,即为eHi-C测序文库5-standard组即标准eHi-C得到。十Mi-Seq测序利用Miseq@ReagentKitv3150CyclesPE，带有内参对照Phix对照组试剂盒进行Mi-seq测序,如图6b。上机测序数据通过IlluminaSequencingAnalysisViewer进行结果评估。结果如图7-12，图7为Q值热图；循环整齐均一,中间为Index。图8为碱基比例图％，结果显示无GC或AT分离，含量无偏离。图9为Errorrate错误率，Errorrate中reads错误率小于1.5质量优良。图10为大于Q30的值所占的百分比，所有循环的ReadsQ值大于30的比例，发现最小比例85％以上，说明处理后的数据质量均优良。图11为Q值分布柱形图，反映测序过程中不同阶段的数据质量，Q30平均值为93.2％即总体水平Q值＞30所占比例，测序总体五个处理均包含质量非常好。图12为混合样本的均一度，其中5为本实施例结果。实施例2、细胞eHi-C测序其他方法一、方法图2所示：1、1-Option组：与实施例1的方法基本相同，唯一不同的是二，得到1-Option组eHi-C测序文库：用500ul1×NEBuffer2NEB；#B7002S吹洗上述一获得的染色质团块，4℃20,000g离心15min.去除上清。重复一次。用枪头再次打碎团块，加38ul1×NEBuffer2，尽可能重悬混合完全，得到重悬后染色质。将3.8ul质量百分含量为1％SDS水溶液加入重悬后染色质中，使SDS的终浓度为0.1％，混匀，65℃孵育10min，以去除不与DNA直接交联的蛋白；孵育后立即把离心管放于冰上，加入4.4ul体积百分含量为10％TritonX-100猝灭SDS，小心混匀避免气泡；得到处理后染色质；将处理后染色质中加入2ul共40UHindIIINEB；R0104L37℃裂解过夜，得到酶切后DNA。2、2-Bead组:与实施例1的方法基本相同，唯一不同的是四DNA纯化和六、再次纯化时使用不稀释的Beads原液，得到2-Bead组eHi-C测序文库；3、3-3Mcells组：与实施例1的方法基本相同，唯一不同的是一的二的细胞数量为3million，得到3-3Mcells组eHi-C测序文库；4、4_T4组：与实施例1的方法基本相同，唯一不同的是三的2中连接反应液中的超纯水替换为质量百分含量7.5％PEG8000水溶液，得到4_T4组eHi-C测序文库；改变后的连接体系为：59.4ul体积百分含量10％TritonX-100溶液、59.4ul10×ligationbuffer500mMpH7.5Tris-HCl,100mMMgCl2,100mMDTT、6.4ul10mgmlBSA溶液、6.4ul100mMATP溶液和477ul质量百分含量7.5％PEG8000水溶液。5、5-standard：实施例1的方法，得到5-sndarde组标准eHi-C测序文库；6、Phix对照组：Miseq@ReagentKitv3中的内参对照Phix对照组。二、Mi-Seq测序与实施例1的十相同，测序文库的均一度结果如图12所示，1-5为5个处理组，6为Phix对照组；表示每个样本Reads量是不是一样多；可以看出以5_Standard组为标准eHi-C，1_Option组仅附加SDS和TritonX-100去除不与DNA直接交联的蛋白，其余步骤与5_Standard组一致、2_Bead组仅DNA纯化时使用不稀释的Beads原液，其余步骤与5_Standard组一致和3_3Mcells组仅细胞数量为3million，步骤与5_Standard组一致的Reads比例均大于5_Standard组，4_T4组仅在钝端环化连接步骤超纯水替换为质量百分含量7.5％PEG8000，其余步骤与5_Standard组一致比例降低。所以，1_Option组可以在增加可用Reads量的基础上，除净与DNA未交联的蛋白，进一步增加酶切、环化效率；2_Bead组反映标准eHi-C可以在保证可用Reads量的基础上，达到同样纯化效果同时进一步节约成本，4_T4组可稍微调低连接效率，降低可用Reads量，负向调整。本标准方法的集中优化均能达到目的，并可以按照需求优化组合。

权利要求：1.一种细胞eHi-C测序文库的制备方法，包括如下步骤：1）裂解细胞得到染色质；所述裂解为先裂解所述细胞的细胞膜，得到细胞核；再裂解所述细胞核，得到染色质；2）将所述染色质依次经酶切、DNA末端标记、钝端环化连接、DNA纯化，得到纯化后环状DNA；3）将纯化后环状DNA和作为内参的环状共沉淀DNA分子混匀，得到混合物；再将所述混合物依次经外切酶酶切去除线性化DNA和再次进行所述DNA纯化的步骤，得到纯化后环状共沉淀DNA和环状DNA混合物；4）将所述纯化后环状共沉淀DNA和环状DNA混合物超声打断，得到片段化环状共沉淀DNA和环状DNA混合物；5）从所述片段化环状共沉淀DNA和环状DNA混合物中用免疫磁珠抓取带有所述标记物的DNA片段；6）用所述带有所述标记物的DNA片段制备eHi-C测序文库；步骤1）中，所述裂解所述细胞的细胞膜为用含有质量百分含量0.1%SDS和质量百分含量1%PI的裂解缓冲液裂解；所述裂解所述细胞核为先用含有质量百分含量为1%SDS和质量百分含量1%PI的裂解缓冲液裂解，再用含有质量百分含量0.1%SDS和质量百分含量1%PI的裂解缓冲液裂解；步骤1）中，所述细胞的数量为大于等于1million；步骤2）中，所述酶切将所述染色质用限制性内切酶缓冲液重悬，得到重悬后染色质；将所述重悬后染色质和所述限制性内切酶混匀，反应，得到酶切后DNA；步骤2）和步骤3）中，所述DNA纯化采用磁珠纯化的方式；步骤3）中，所述作为内参的环状共沉淀DNA分子为质粒DNA分子；步骤3）中，所述外切酶为Lambda和RecJf。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述限制性内切酶为HindIII。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤2）中，在所述酶切步骤中，在所述重悬和所述反应之间还包括如下步骤：将在所述重悬后染色质用SDS去除不与DNA直接交联的蛋白的步骤。4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤2）中，所述DNA末端标记为将带有标记物的dNTP引入所述酶切得到的产物中。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述标记物为生物素。6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤2）中，所述钝端环化连接采用的连接反应液中含有或不含有PEG8000。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述连接反应液由TritonX-100、BSA、ATP、Tris-HCl、MgCl2、DTT和水组成；或所述连接反应液由TritonX-100、BSA、ATP、Tris-HCl、MgCl2、DTT、PEG8000和水组成。8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤4）中，所述超声打断的Intensity为105。9.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述磁珠纯化中的磁珠为磁珠原液或磁珠原液的稀释液。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述磁珠原液的稀释液为将所述磁珠原液稀释5-10倍得到的稀释液。11.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述细胞的数量为1-3million。12.权利要求1-11中任一所述方法在细胞eHi-C测序中的应用。13.一种细胞eHi-C测序方法，包括如下步骤：1）利用权利要求1-11中任一所述方法制备得到eHi-C测序文库；2）对所述eHi-C测序文库进行测序。

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