申请/专利权人：西安医学院

申请日：2017-05-09

公开（公告）日：2020-07-17

公开（公告）号：CN107050008B

主分类号：A61K31/192(20060101)

分类号：A61K31/192(20060101);A61P35/00(20060101)

优先权：

专利状态码：失效-未缴年费专利权终止

法律状态：2022.04.15#未缴年费专利权终止;2017.09.12#实质审查的生效;2017.08.18#公开

摘要：本发明公开的灰叶酸在制备治疗骨肉瘤的药物中的应用，药物中灰叶酸的浓度不小于50μmolL；药物的给药方式是骨肉瘤瘤内注射；每立方毫米骨肉瘤中灰叶酸注射剂量为0.1ml。本发明提出了灰叶酸的新用途，这些用途基于其新的功能发现和证实，通过瘤内注射灰叶酸能有效杀伤骨肉瘤细胞，显著抑制骨肉瘤的生长，同时并无明显副作用，灰叶酸对骨肉瘤的高杀伤作用和对机体的低毒副作用使其成为治疗骨肉瘤等肿瘤的良好的药物。

主权项：1.灰叶酸在制备治疗骨肉瘤的药物中的应用。

全文数据：灰叶酸在制备治疗骨肉瘤的药物中的应用技术领域[0001]本发明属于灰叶酸应用技术领域，具体涉及一种灰叶酸在制备治疗骨肉瘤的药物中的应用。背景技术[0002]骨肉瘤多发于青年和儿童，恶性程度局，预后较差。尽管临床治疗手段不断改进，但骨肉瘤的生存率在过去三十年没有进一步提高。化学药物治疗是手术之外最主要的骨肉瘤治疗方法，虽然加大化疗药物剂量可以达到更显著的杀伤肿瘤细胞的作用，但是目前所用化疗药物在高剂量应用时产生另患者难以忍受的毒副作用，这限制了其杀伤肿瘤细胞的应用。因此，寻找更为安全和有效的抗肿瘤药物意义重大。[0003]灰叶酸grifolicacid是从地花菌中提取的一个天然产物，关于灰叶酸药理作用的研究报道目前很少，目前普遍认为，灰叶酸是一个游离脂肪酸受体的激动剂，可激动G蛋白偶联受体120GPR120。灰叶酸的一个类似物奇果菌素grifolin被发现具有显著的抗肿瘤作用，可杀死多种肿瘤细胞，但是灰叶酸的作用并不清楚。[0004]经过研究表明，灰叶酸可抑制细胞的ATP生成，细胞内ATP水平对于细胞活性至关重要，胞内ATP由线粒体产生，线粒体通过氧化磷酸化的方式把来源于葡萄糖和脂肪酸等产生的乙酰辅酶A通过三羧酸循环生成C02,同时把氢离子通过递氢体沿呼吸链传递，在此过程中建立线粒体内膜两侧的氢离子浓度差，并将此势能差用于ATP生成，氢离子最后氧化生成水。线粒体膜电位是维持ATP生成的能量来源，膜电位消失将导致ATP生成减少，进而导致细胞因能量缺乏而死亡。虽然灰叶酸可以通过抑制细胞ATP生成进而杀死肿瘤细胞，但是灰叶酸在体是否具有杀伤肿瘤的作用和是否具有明显的毒副作用仍属未知。发明内容[0005]本发明的目的是提供一种灰叶酸在制备治疗骨肉瘤的药物中的应用，为抑制骨肉瘤细胞的增殖、有效杀伤骨肉瘤细胞提供了新的思路。[0006]本发明所采用的技术方案是，灰叶酸在制备治疗骨肉瘤的药物中的应用。[0007]本发明所采用的另一个技术方案技术方案是，一种制备治疗骨肉瘤的药物，药物中含有灰叶酸组分。[0008]本发明的特征还在于，[0009]药物中灰叶酸的浓度不小于50WI101L。[0010]药物的给药方式是骨肉瘤瘤内注射。[0011]灰叶酸的注射剂量是:每立方毫米骨肉瘤中注射灰叶酸体积为〇.1ml。[0012]本发明的有益效果是:本发明提出了灰叶酸的新用途，这些用途基于其新的功能发现和证实。通过瘤内注射灰叶酸能有效杀伤骨肉瘤细胞，显著抑制骨肉瘤的生长，同时并无明显副作用，灰叶酸对骨肉瘤的高杀伤作用和对机体的低毒副作用使其成为治疗骨肉瘤等肿瘤的良好的药物。附图说明[0013]图1:灰叶酸体外杀伤多种骨肉瘤细胞的统计结果:不同骨肉瘤细胞在不同浓度的灰叶酸下处理2小时、6小时、12小时和24小时之后，骨肉瘤细胞活性相对于注射灰叶酸前细胞活性的变化比例;A:人MG-63细胞;B:人U-20S细胞;C:人Saos-2细胞;D:小鼠K7M2细胞；以上各组细胞的数目均为n二12;[0014]图2:在不同部位注射灰叶酸对在体骨肉瘤细胞杀伤作用的统计结果:分别对两组小鼠不同部位注射灰叶酸、注射7天后:与空白对照组小鼠的瘤体体积的对比结果（图A;通过组织切片染色对瘤体组织进行分析得到的瘤细胞占肿瘤比例结果（图B;以上每组小鼠数量均为4只；[0015]图3:瘤内注射灰叶酸对小鼠不同器官的组织形态的毒副作用:通过组织切片苏木精-伊红HE染色分析表明对照组与实验组的区别，对照组为不注射灰叶酸的小鼠器官册染色结果，实验组为瘤内注射灰叶酸的小鼠器官HE染色结果;A:对照组小鼠肝脏;B:实验组小鼠肝脏;C:对照组小鼠肾脏;D:实验组小鼠肾脏;E:对照组小鼠肺脏;F:实验组小鼠肺脏；G:对照组小鼠心脏;H:实验组小鼠心脏；[0016]图4:瘤内注射灰叶酸对小鼠的血液指标的统计结果:小鼠的骨肉瘤内注射灰叶酸和不注射灰叶酸的对照组进行血液指标对比数量，A:红细胞数;B:白细胞数;C:血小板数；D:血浆总蛋白；E:谷丙转氨酶;F:谷草转氨酶；[0017]图5:灰叶酸对骨肉瘤负荷小鼠的生存时间的影响:通过l〇g-rank统计学分析三组小鼠的生存曲线，三组小鼠分别为:不进行注射的灰叶酸的小鼠、静脉注射灰叶酸的小鼠和瘤内注射灰叶酸的小鼠，以上三组小鼠每组的数量均为16个。具体实施方式[0018]下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，灰叶酸在制备治疗骨肉瘤的药物中的应用。[0019]—、细胞培养:人和小鼠来源的多种骨肉瘤细胞用于灰叶酸作用的检测。本发明所使用的人MG-63细胞、人u-20S细胞、人Saos-2细胞、小鼠K7M2细胞均用于检测。上述所有细胞均培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液中，在37°C的5%C02培养箱中培养，每2-3天更换培养液，细胞生长至80%后传代。传代用〇•25%胰蛋白酶+〇•〇2%EDTA消化后、按照1:3-5比例传代。培养液和血清以及消化酶均为Gibco公司产品。[0020]二、细胞活性检测:上述所培养的各种细胞均种植于96孔培养板中，待生长至90%之后，更换至无血清培养液，分别加入〇福、1謂、3處、丨如M和30爾不同浓度灰叶酸，孵育2小时、6小时、12小时、24小时；随后加入噻唑蓝MTT终浓度〇.5mgml，MTT能透过细胞膜进入细胞内，活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性MTT还原为难溶于水的蓝紫色的针状结晶并沉积在细胞中；在MTT孵育4小时后，完全去除上清液，每孔加入100ul的二甲基亚砜DMS0，DMS0能溶解结晶物;随后使用酶联免疫检测仪在560nm波长处测定其吸光度0D值），同时也反映出细胞数量。[0021]采用方差分析对各组细胞的的0D值并进行统计学分析，具体结果如图1所示:浓度30uM灰叶酸在作用两个小时后即能显著降低人MG_63细胞、人卜撕细胞、人Saos_2细胞和小帆K7M2细胞的骨肉瘤细胞的活性，并且在孵育12小时后基本全部杀伤骨肉瘤细胞;浓度3WM和10uM灰叶酸同样具有杀伤骨肉瘤细胞细胞作用，但对剂量有一定的依赖性;浓度低至1WM的灰叶酸在24小时内与OuM对照组相比无明显区别，对骨肉瘤细胞杀伤作用不明显。由此可知，浓度3mio1-30wiio1的灰叶酸对剂量依赖性和时间依赖性显著降低，所检测细胞的活性也逐渐降低。[002^]三、骨肉瘤小鼠模型制备和分组处理:收取K7M2小鼠骨肉瘤细胞，浓缩到5X107细胞毫升。Balbc小鼠用异氟烷吸入麻醉后，局部消毒，在背部皮下注射K7M2细胞悬液1〇〇微升，待小鼠清醒后放于动物房中饲养，自由饮食饮水。在注射14天后，检查局部隆起情况，对成瘤的小鼠分组进行下面实验:第一组为对照组，不进行处理;第二组为小鼠麻醉后尾静脉注射灰叶酸组，注射剂量为5〇MiolL，注射0•5毫升;第三组经麻醉后通过显微注射器瘤内注射灰叶酸50wiiolL，注射0.5毫升。[0023]处理后小鼠在清醒恢复后放置于动物房饲养，在灰叶酸注射后7天，每组取出4只小鼠，麻醉后心脏取血，随后多聚甲醛灌流固定，测量瘤体大小，如图2中图A所示，静脉注射灰叶酸组小鼠的骨肉瘤体积与对照组相比无明显变化，瘤内注射灰叶酸组小鼠的骨肉瘤体积也无显著减少;如图2中图B所示，组织切片染色对瘤体组织分析发现，静脉注射灰叶酸组小鼠的骨肉瘤细胞所占肿瘤面积为92%，与对照组90%无显著区别，瘤内注射灰叶酸组小鼠的瘤体组织主要由坏死组织组成，骨肉瘤细胞所占肿瘤面积为36%，较对照组显著减少。[0024]对上述小鼠瘤体和其他重要脏器包括肝脏、心脏、肾脏和肺脏等进行包埋和切片，进行苏木精-伊红HE染色分析;对上述小鼠血液样本进行血细胞计数和总蛋白、谷草转氨酶、谷丙转氨酶等血液指数水平测定;其余小鼠继续饲养，每天观察小鼠存活情况，记录死亡小鼠数量。[0025]四、苏木精-伊红HE染色:上述小鼠组织切片经二甲苯脱蜡、复水处理后，使用苏木精染色lmin、自来水冲洗lmin，1%盐酸酒精分化lmin、自来水洗lmin，1%稀氨水反蓝0.5tnim、自来水洗lmin，然后用伊红染色lmin、自来水洗后酒精脱水、二甲苯透明后中性树胶封片，并在普通光镜下照相。[0026]如图3所示，组织切片苏木精-伊红HE染色分析表明，瘤内注射灰叶酸组小鼠的肝脏、肾脏、肺脏和心脏的组织结构完整，与对照组无明显区别。[0027]五、血细胞计数和血液生化指标检测：取50微升血液，加入血细胞测定仪，对红细胞、白细胞和血小板进行计数;其余血样离心收集血浆，使用总蛋白检测试剂盒双缩脲比色法测定血浆总蛋白水平；同时使用谷草转氨酶和谷丙转氨酶测定试剂盒检测血浆谷草转氨酶和谷丙转氨酶水平。[0028]如图4所示，瘤内注射灰叶酸组小鼠的红细胞、白细胞、血小板、血浆总蛋白、谷丙转氨酶、谷草转氨酶的水平较对照组小鼠无显著区别。[0029]六、小鼠存活情况监测：继续饲养，每天观察小鼠存活情况，通过记录小鼠的生存数量绘制如图5所示的曲线，结果表明：对照组与静脉注射灰叶酸组小鼠的随时间的延长而逐渐死亡，二组之间无明显区别;瘤内注射灰叶酸组小鼠的死亡数量明显较对照组减少，应用log-rank统计学分析，瘤内注射灰叶酸组小鼠的生存时间较对照组和尾静脉注射灰叶酸组均显著延长。

权利要求：1.灰叶酸在制备治疗骨肉瘤的药物中的应用。么2.—种制备治疗骨肉瘤的药物，其特征在于，所述的药物中含有灰叶酸组分。3.根据权利要求2所述的一种制备治疗骨肉瘤的药物，其特征在于，所述的药物中灰叶酸的浓度不小于50umolL。4.根据权利要求2所述的一种制备治疗骨肉瘤的药物，其特征在于，所述的药物的给药方式是骨肉瘤瘤内注射。5.根据权利要求3所述的一种制备治疗骨肉瘤的药物，其特征在于，所述的灰叶酸的注射剂量是:每立方毫米骨肉瘤中注射灰叶酸体积为0.lml。

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