申请/专利权人：中科晟和干细胞技术有限公司

申请日：2020-04-23

公开（公告）日：2020-07-28

公开（公告）号：CN111454898A

主分类号：C12N5/0775(20100101)

分类号：C12N5/0775(20100101);A61K8/99(20170101);A61Q19/00(20060101);A61Q19/08(20060101);A61Q17/02(20060101)

优先权：

专利状态码：失效-发明专利申请公布后的驳回

法律状态：2023.06.09#发明专利申请公布后的驳回;2020.08.21#实质审查的生效;2020.07.28#公开

摘要：本发明公开了一种间充质干细胞培养基用于化妆品的制备方法，包括以下步骤：11号培养基的制备；2氯化锂母液的制备；32号培养基的制备；4间充质干细胞的分离与培养；5间充质干细胞条件培养基的制备：取第四次传代的细胞，将细胞以1x105ml的密度分别接种于1号培养基和2号培养基中，弃去培养上清，加入适量1XHBSS溶液清洗细胞两次，彻底吸干残留的HBSS溶液，加入无血清的高糖DMEM培养基，去除细胞碎片，向每个上清中加入适量20％无菌蔗糖溶液，将上述液体分装成10ml瓶，转入真空冷冻干燥瓶中，在真空冷冻干燥机中冻干后保存于‑80℃冰箱中备用。本发明与现有技术相比的优点在于：使用效果好、利用率高、成本低。

主权项：1.一种间充质干细胞培养基用于化妆品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：11号培养基的制备：取420ml的高糖MEM倒入容器中，向其中分别加入5ml100X青链霉素混合液、5ml100X丙酮酸钠、5ml100X非必须氨基酸、5ml100X谷氨酰钠和50ml胎牛血清，混匀后，过滤除菌，备用；2氯化锂母液的制备：称取100mg氯化锂固体，溶于8ml高糖MEM中，充分溶解后定容至10ml，此溶液浓度为10mgml；32号培养基的制备：取416ml的高糖MEM倒入容器中，向其中分别加入5ml100X青链霉素混合液、5ml100X丙酮酸钠、5ml100X非必须氨基酸、5ml100X谷氨酰钠和50ml胎牛血清，同时添加氯化锂母液4ml，混匀后，过滤除菌，备用；4间充质干细胞MSC的分离与培养：将脐带组织沿脐带纵向切开，剥离其中的血管；用剪刀分离脐带组织内侧的沃顿胶，将分离的沃顿胶切成1mm3的小块，然后将其接种于细胞培养皿中，加入适量的1号培养液，将培养皿放置于温度为37℃、二氧化碳浓度为5％的培养箱中培养10-14天，期间于第二天适当加液后，每隔三天换1号培养液一次；细胞培养至80％融合度，用0.5％胰酶-EDTA溶液消化已经贴壁的间充质干细胞，并按照1：3的比例进行传代培养，传代后的细胞取其中一部分进行间充质干细胞条件培养基的制备，其余细胞以2x106ml的密度进行冻存；5间充质干细胞条件培养基MSC-CM的制备：取第四次传代的细胞，将细胞以1x105ml的密度分别接种于1号培养基和2号培养基中，待细胞在两种培养基中生长至90％融合度，小心弃去培养上清，加入适量1XHBSS溶液对于10cm细胞培养皿，可加入10ml-15mlHBSS溶液清洗细胞两次，彻底吸干残留的HBSS溶液，加入无血清的高糖DMEM培养基，于温度为37℃、二氧化碳浓度为5％的培养箱中继续培养72h后，将2种细胞培养上清分别收集于50ml离心管中，1000g离心10分钟，去除细胞碎片，测量上清体积，向每个上清中加入适量20％无菌蔗糖溶液，使蔗糖的终浓度达到1％WV，将上述液体分装成10ml瓶青霉素瓶，转入真空冷冻干燥瓶中，-80℃预冷冻后，在真空冷冻干燥机中冻干后保存于-80℃冰箱中备用。两种条件培养基分别标记为MSC-CM1：在1号培养基中培养的MSC所制备的条件培养基；MSC-CM2：2号培养基含氯化锂的培养基中培养的MSC所制备的条件培养基。

全文数据：

权利要求：

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