申请/专利权人：上海市农业科学院

申请日：2017-03-13

公开（公告）日：2020-11-20

公开（公告）号：CN106928305B

主分类号：C07J9/00(20060101)

分类号：C07J9/00(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.11.20#授权;2017.08.01#实质审查的生效;2017.07.07#公开

摘要：本发明公开了一种分离制备灵芝烯酸B的方法，包括以下几个步骤：1提取和富集灵芝烯酸B：将灵芝子实体加入75‑95％乙醇溶液加热提取，提取液浓缩；浓缩液经大孔树脂乙醇梯度洗脱吸附后，进行减压浓缩，2高速逆流色谱法分离纯化制备灵芝烯酸B：用高速逆流色谱进行灵芝烯酸B分离，然后用高效液相色谱法分析检测，收集、浓缩、干燥，分离得到灵芝烯酸B，本发明操作简单，污染小，成本低，灵芝烯酸B的得率、纯度高。

主权项：1.一种灵芝子实体提取物中灵芝烯酸B的制备方法：1取灵芝子实体50kg切片，投入到中试提取设备中，加入8倍体积的87％无水乙醇提取2次，第一次2h，第二次1h；提取温度均为65℃；将这两次的提取液合并，在蒸煮罐中加热浓缩后再用20L旋转蒸发仪加热浓缩，获得灵芝子实体提取物；将灵芝子实体提取物过D101大孔树脂洗脱，用60％乙醇洗脱，用3-5倍溶液体积洗脱，将洗脱组分浓缩，获得富含灵芝烯酸B的组分；2在分液漏斗中配制正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水5:5:2:9，VV两相溶剂系统；向高速逆流色谱仪中泵入上相，固定相，待管路充满上相后，以转速900rmin转动主机；再以2mlmin流速泵入下相，流动相，检测波长为248nm；待两相达到平衡即基线稳定后，用流动相配制浓度为20mgmL的样品20ml，由进样阀进样，紫外检测器在线监测，检测波长为248nm；收集各个流分，用高效液相色谱法分析检测分离情况；并与灵芝烯酸B标准品作对比，收集合并含有灵芝烯酸B的馏分，并用高效液相面积归一法测得纯度为88.3％的灵芝烯酸B29.6mg；灵芝烯酸B的高效液相色谱检测中，利用二极管阵列检测器进行色谱峰的全波段扫描，从而确定峰的纯度；溶剂洗脱条件确定如下；灵芝烯酸B的高效液相色谱法色谱柱AgilentZORBAXSB-Aq4.6mm×250mm，5μm，流动相A为0.01％冰醋酸，B为乙腈梯度洗脱：0min，A：72％；25min，A：70％；50min，A：61％；60min，A：0％；进样量10μL；柱温30℃；检测波长248nm；流速：1mlmin；在该条件下，色谱图中呈现出两个色谱峰；出峰时间为31min的色谱峰即目标化合物灵芝烯酸B，其相对峰面积为88.3％-89.1％；出峰时间为37min的色谱峰为杂质峰，其相对峰面积为10.9％-11.7％；灵芝烯酸B的高效液相图是说明书附图4。

全文数据：一种灵芝烯酸B的制备方法技术领域[0001]本发明属于天然药物技术领域，具体涉及一种灵芝烯酸B的制备方法。技术背景[0002]灵芝烯酸B为三萜类化合物，CAS号100665-41-6,分子式C3qH42O7,分子量514.65028,分子结构式如下：[0003][0004]灵芝三萜是灵芝的次级代谢产物，具有多种药理活性。文献报道，灵芝烯酸B在体外具有很强的抑制p388、BEL-7402、SGC-7901、HeLa等多种肿瘤细胞的活性，进一步的深入研究表明，灵芝烯酸B有调节ABCBl基因的作用，从而具有解决ABCBl基因介导的多药耐药问题的潜力。[0005]通过文献检索，目前还没有发现灵芝烯酸B的制备方法。发明内容[0006]本发明的目的在于提供一种灵芝烯酸B的制备方法，该方法包括如下步骤：[0007]1提取和富集灵芝烯酸B:将灵芝子实体加入乙醇溶液加热提取，提取液浓缩;浓缩液经大孔树脂乙醇梯度洗脱吸附后，进行减压浓缩。[0008]2高速逆流色谱法分离纯化制备灵芝烯酸B:用高速逆流色谱进行灵芝烯酸B分离，然后用高效液相色谱法分析检测，收集、浓缩、干燥，分离得到灵芝烯酸B。[0009]具体地说，本发明的一种灵芝烯酸B的制备方法，该方法包括如下步骤：[0010]1提取和富集灵芝烯酸B:将灵芝子实体加入5-10倍75-95%乙醇溶液加热50-70°C提取，每次1-3小时，重复2-3次。将提取液加热减压浓缩，浓缩液经过DlOl大孔树脂用60%乙醇洗脱，用3-5倍溶液体积洗脱。将洗脱组分浓缩，获得富含灵芝烯酸B的组分。[0011]2高速逆流色谱法分离灵芝烯酸B:溶剂体系由正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水组成，体积比为3-6:3-6:1-4:5-9，上为固定相，下为流动相;将富含灵芝烯酸B的组分用相溶液溶解并上样，高速逆流色谱流速范围l_3mlmin，转速范围700-900rmin，每4-10mL收集为一个馏分;然后用高效液相色谱法分析检测各试管收集液成分，紫外检测波长为248nm;按出峰情况收集、浓缩、干燥，分离得到灵芝烯酸B。[0012]本发明考察了三种不同的大孔树脂HZ-818，HZ-801和D-101，分别用60%乙醇洗脱，以洗脱物的得率和用高效液相考察灵芝烯酸B的含量为考量，最终选择DlOl大孔树脂。[0013]依据大孔树脂、乙醇浓度的选择，请给出洗脱物的得率和用高效液相考察灵芝烯酸B的含量的具体数据。[0014][0015]本发明考察了正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水体系摸索，按照比例配好体系后充分震荡，分层后取上下相各2ml于试管中，加入含有灵芝烯酸B的组分样品少量，漩涡震荡，记录分层时间，待两相分层完毕后，吸取上下相各200ul于2ml离心管，放水浴锅上烘干溶剂后加1.5ml甲醇溶解，过膜后进行HPLC测定，记录目标物质的峰面积，根据分配系数计算公式算K值，K值应在0.5〜2.0之间。[0016]分配系数计算公式:K=AuAL[0017]式中:K为分配系数;Au为上相峰面积;Al为下相峰面积。[0018]依据正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水体系的比例的选择，给出灵芝烯酸B的K值。[0019][0020]在HSCCC分离中，转速和流速对高速逆流的分离效果会产生一定影响。针对流速的优化，低流速能提高分离效果，但相应的分离时间会加长，根据实验结果考察，流速在1-3mlmin之间，分离效果和分离时间比较适合。线圈转速对固定相的保留影响最大，而固定相保留率直接关系到分离效果的好坏，根据实验结果综合考量，转速范围在700-900rmin之间比较适合灵芝烯酸B的制备。[0021]依据转速和流速的选择，灵芝烯酸B的得率、纯度的具体数据如下：[0022][0023]本发明以含有灵芝烯酸B的组分为分析样品，以灵芝烯酸B的理论塔板数，以及与邻近色谱峰的分离度为考察指标，建立高效液相色谱分析方法。[0024]供试子实体:沪农灵芝1号Ganodermalucidum，由上海市农业科学院食用菌研究所提供。[0025]灵芝稀酸B标准品购自国家标准物质标准样品信息中心。[0026]D-101大孔树脂，净品级，天津海光化工有限公司。[0027]20L旋转蒸发仪:BC-R2001，上海贝凯生物化工设备有限公司；配用SHB-B95型循环水式多用真空栗，郑州长城科工贸有限公司。[0028]高速逆流色谱仪购自上海同田生物技术股份有限公司，仪器型号:TBE-300B。[0029]高效液相色谱仪为Waters公司，仪器型号为2695-717-600E。[0030]3高速逆流色谱是一种无固定相载体的连续液-液分配色谱技术，与传统的色谱技术相比具有很多优势，利用该色谱技术来制备灵芝三萜化合物，不需要固态支持物作载体，不存在不可逆吸附，灵芝三萜的分离效率高、回收率高、分离时间短，此外，在制备过程中，样品分解率较低;溶剂流失也比较少，是一种经济实用获得灵芝三萜化合物的方法。采用本发明的方法制备灵芝烯酸B，成本低，污染小，操作简单，且灵芝烯酸B得率高，纯度高。附图说明：[0031]图1为实施例1的高速逆流色谱图[0032]图2为实施例1中获得的灵芝烯酸B的高效液相图[0033]图3为实施例2的高速逆流色谱图[0034]图4为实施例2中获得的灵芝烯酸B的高效液相图[0035]具体实施方法[0036]实施例1[0037]1取灵芝子实体50kg切片，投入到中试提取设备中，加入8倍体积的87%无水乙醇提取2次，第一次2h，第二次lh。提取温度均为65°C。将这两次的提取液合并，在蒸煮罐中加热浓缩后再用20L旋转蒸发仪加热浓缩，获得灵芝子实体提取物。[0038]将灵芝子实体提取物过DlOl大孔树脂洗脱，用60%乙醇洗脱，用3-5倍溶液体积洗脱。将洗脱组分浓缩，获得富含灵芝烯酸B的组分。[0039]2在分液漏斗中配制正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水5:5:2:9，VV两相溶剂系统。向高速逆流色谱仪中栗入上相（固定相），待管路充满上相后，以转速900rmin转动主机。再以2mlmin流速栗入下相流动相），检测波长为248nm。待两相达到平衡即基线稳定后，用流动相配制浓度为lOmgmL的样品20ml，由进样阀进样，紫外检测器在线监测，检测波长为248nm。收集各个流分，用高效液相色谱法分析检测分离情况，并与灵芝烯酸B标准品作对比，收集合并含有灵芝烯酸B的馏分，并用高效液相面积归一法测得纯度为89.1%的灵芝烯酸B15.2mg。[0040]实施例2[0041]1取灵芝子实体50kg切片，投入到中试提取设备中，加入8倍体积的87%无水乙醇提取2次，第一次2h，第二次lh。提取温度均为65°C。将这两次的提取液合并，在蒸煮罐中加热浓缩后再用20L旋转蒸发仪加热浓缩，获得灵芝子实体提取物。[0042]将灵芝子实体提取物过DlOl大孔树脂洗脱，用60%乙醇洗脱，用3-5倍溶液体积洗脱。将洗脱组分浓缩，获得富含灵芝烯酸B的组分。[0043]2在分液漏斗中配制正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水5:5:2:9，VV两相溶剂系统。向高速逆流色谱仪中栗入上相（固定相），待管路充满上相后，以转速900rmin转动主机。再以2mlmin流速栗入下相流动相），检测波长为248nm。待两相达到平衡即基线稳定后，用流动相配制浓度为20mgmL的样品20ml，由进样阀进样，紫外检测器在线监测，检测波长为248nm。收集各个流分，用高效液相色谱法分析检测分离情况，并与灵芝烯酸B标准品作对比，收集合并含有灵芝烯酸B的馏分，并用高效液相面积归一法测得纯度为88.3%的灵芝烯酸B29.6mg。[0044]实施例3[0045]用高效液相色谱法以峰面积归一法检测试管中灵芝烯酸B的含量，将含量为88%以上的试管合并，旋转蒸发浓缩，再真空离心浓缩干燥，获得高纯度的灵芝烯酸B。[0046]实施例4[0047]灵芝烯酸B的高效液相色谱法[0048]色谱柱AgilentZORBAXSB-Aq4.6mmX250mm，5ym，流动相A为0.01%冰醋酸，B为乙腈）梯度洗脱：〇111；[11，厶:72%;25111；[11，厶:70%;50111；[11，厶:61%;60111；[11，厶:0%。进样量1^1^柱温30°C;检测波长248nm;流速：lmlmin。[0049]实施例5[0050]灵芝烯酸B的高效液相色谱检测中，利用二极管阵列检测器DAD进行色谱峰的全波段扫描，从而确定峰的纯度。当发现峰不纯时，调整洗脱溶剂的条件，最终溶剂洗脱条件确定如实施例4。在该条件下，色谱图中呈现出两个色谱峰。出峰时间为31min的色谱峰即目标化合物灵芝烯酸B，其相对峰面积为88.3%-89.1%;出峰时间为37min的色谱峰为杂质峰，其相对峰面积为10.9%-11.7%。

权利要求：1.一种灵芝烯酸B的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤：1提取和富集灵芝烯酸B:将灵芝子实体加入乙醇溶液加热提取，提取液浓缩;浓缩液经大孔树脂乙醇梯度洗脱吸附后，进行减压浓缩，获得富含灵芝烯酸B的组分；2高速逆流色谱法分离纯化制备灵芝烯酸B:用高速逆流色谱进行灵芝烯酸B分离，然后用高效液相色谱法分析检测，收集、浓缩、干燥，分离得到灵芝烯酸B。2.根据权利要求1所述的灵芝烯酸B制备的方法，其特征在于:该方法包括如下步骤：1提取和富集灵芝烯酸B:将灵芝子实体加入5-10倍75-95%乙醇溶液加热50-70°C提取，每次1-3小时，重复2-3次，将提取液加热减压浓缩，浓缩液经过DlOl大孔树脂用60%乙醇洗脱，用3-5倍溶液体积洗脱，将洗脱组分浓缩，获得富含灵芝烯酸B的组分；2高速逆流色谱法分离灵芝烯酸B:溶剂体系由正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水组成，体积比为3-6:3-6:1-4:5-9，上为固定相，下为流动相;将富含灵芝烯酸B的组分用相溶液溶解并上样，高速逆流色谱流速范围l_3mlmin，转速范围700-900rmin，每4-10mL收集为一个馏分;然后用高效液相色谱法分析检测各试管收集液成分，紫外检测波长为248nm;按出峰情况收集、浓缩、干燥，分离得到灵芝烯酸B。

百度查询： 上海市农业科学院 一种灵芝烯酸B的制备方法

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