申请/专利权人：浙江孚诺医药股份有限公司

申请日：2018-08-21

公开（公告）日：2020-11-24

公开（公告）号：CN108977482B

主分类号：C12P21/04(20060101)

分类号：C12P21/04(20060101);C12R1/01(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.11.24#授权;2019.01.04#实质审查的生效;2018.12.11#公开

摘要：本发明提供一种硫酸多粘菌素B的制备方法，其至少包括以下步骤：1多粘菌素B种子制备；2发酵；3精制；其将发酵液中可能影响成品质量的单杂控制到低于1.5％的水平，同时结合有效的精制方法使经该发酵液提取获得的成品质量符合EP8.0及CP2015的标准。

主权项：1.一种硫酸多粘菌素B的制备方法，其特征在于，其至少包括以下步骤：1多粘菌素B种子制备：将产多粘菌素B菌种置于培养基A中进行复苏培养，然后置于培养基B中进行摇床培养，得到活化的产多粘菌素B菌种；2发酵：将步骤1得到的活化的产多粘菌素B菌种加入至培养罐C中，种子罐培养；然后置于培养罐D中，进行发酵罐培养，得到多粘菌素B菌种的发酵液；3精制：对步骤2得到的多粘菌素B菌种的发酵液进行过滤、离子交换树脂处理、大孔树脂处理、解吸液碱结晶、转盐、脱色、纳滤浓缩、真空冷冻干燥，得到硫酸多粘菌素B；所述离子交换树脂为强酸阳离子树脂；所述强酸阳离子树脂为4-磺酰胺苯甲酰亚胺和4-磺酸基吡啶-3-磺酰胺改性732阳离子交换树脂；所述步骤2中发酵罐培养过程中还包括补料过程，所述补料配方中每100ml培养基含有以下组份：L-苏氨酸0.01-0.1g、硫酸铵0.1-0.5g、余量为水；所述步骤1中产多粘菌素B菌种为多粘类芽孢杆菌Paenibacilluspolymyxa。

全文数据：一种硫酸多粘菌素B的制备方法技术领域[0001]本发明涉及微生物发酵技术领域，具体地，本发明涉及一种硫酸多粘菌素B的制备方法。背景技术[0002]硫酸多粘菌素BPolymyxinBsulfate，又称硫酸粘杆菌素B，是一种多肽抗生素，几乎对所有革兰氏阴性菌均有较强的抑制或杀菌作用，如大肠杆菌、绿脓杆菌、副大肠杆菌、肺炎克雷白杆菌、嗜酸杆菌、百日咳杆菌及痢疾杆菌等，尤其对绿脓杆菌有显著作用。世界上许多国家己批准该药作为饲料添加剂使用。硫酸多粘菌素B还作为药品使用，临床上主要用于敏感菌引起的感染及绿脓杆菌引起的泌尿系统感染、脑膜炎、败血症、烧伤感染以及皮肤粘膜感染等。[0003]硫酸多粘菌素B在国内的生产企业仍然是为数不多的，而且国内还没有取得该原料药生产批文的企业，主要还是依赖从国外进口来满足需求，因此，在我国加快开发生产这种市场前景极好的产品已成为当务之急，多粘菌素类原料药的开发被列入优先扶持计划。其中，对于多粘菌素B发酵产物有关物质的控制是一个难点，中国药典中对于多粘菌素B有关物质的规定，任一单杂不得过3.0%，总杂不得过17.0%，如何有效控制发酵的杂质同时兼顾发酵产量是亟需要解决的问题。[0004]因此，针对上述问题，本发明提供一种硫酸多粘菌素B的制备方法，将发酵液中可能影响成品质量的最大单杂控制到低于1.5%的水平，同时结合有效的精制方法使经该发酵液提取获得的成品质量符合EP8.0及CP2015的标准。发明内容[0005]为了解决上述问题，本发明提供一种硫酸多粘菌素B的制备方法，其至少包括以下步骤：[0006]1多粘菌素B种子制备:将产多粘菌素B菌种置于培养基A中进行复苏培养，然后置于培养基B中进行摇床培养，得到活化的产多粘菌素B菌种；[0007]2发酵:将步骤⑴得到的活化的产多粘菌素B菌种加入至培养罐C中，种子罐培养;然后置于培养罐D中，进行发酵罐培养，得到多粘菌素B菌种的发酵液；[0008]3精制：对步骤2得到的多粘菌素B菌种的发酵液进行过滤、离子交换树脂处理、大孔树脂处理、解吸液碱结晶、转盐、脱色、纳滤浓缩、真空冷冻干燥，得到硫酸多粘菌素B0[0009]在一种实施方式中，所述步骤⑴中所述培养基A中每IOOml培养基含有以下组份：蔗糖l-3g、蛋白胨l_5g、磷酸氢二钾0.1-0.58、七水硫酸镁0.2-18、琼脂1_38、余量为水。[0010]在一种实施方式中，所述步骤⑴中所述培养基B中每IOOml培养基含有以下组份：小麦粉7-10g、淀粉酶0.002-0.Olg、酵母粉0.2-0.6g、碳酸钙0.1-0.5g、磷酸氢二钠0.01-〇.〇3g、硫酸铵0.2-0.7g、余量为水。[0011]在一种实施方式中，所述步骤2中所述培养罐C中每IOOml培养基含有以下组份：小麦粉7-10g、淀粉酶0.002-0.Olg、酵母粉0.2-0.6g、碳酸钙0.1-0.5g、磷酸氢二钠0.01-0.03g、硫酸铵0.2-0.7g、消泡剂0.01-0.05g、余量为水。[0012]在一种实施方式中，所述步骤2中所述培养罐D中每IOOml培养基含有以下组份：小麦粉l〇_15g、淀粉酶0.002-0.Olg、酵母粉0.5-lg、碳酸钙0.1-0.5g、磷酸氢二钠0.01-〇.〇3g、硫酸铵0.2-0.7g、消泡剂0.01-0.05g、L-苏氨酸0.01-0.lg、余量为水。[0013]在一种实施方式中，所述步骤2中发酵罐培养过程中还包括补料过程，所述补料配方中每IOOml培养基含有以下组份:L-苏氨酸0.01-0.lg、硫酸铵0.1-0.5g、余量为水。[0014]在一种实施方式中，所述步骤⑶中离子交换树脂为强酸阳离子树脂。[0015]在一种实施方式中，所述强酸阳离子树脂为4-磺酰胺苯甲酰亚胺和4-磺酸基吡啶-3-磺酰胺改性732阳离子交换树脂。[0016]在一种实施方式中，所述步骤（3中大孔树脂包括D001、D113、D201、D301、D370、D152中一种。[0017]在一种实施方式中，所述步骤（1中产多粘菌素B菌种为多粘类芽孢杆菌Paenibacillus0[0018]参考以下详细说明更易于理解本申请的上述以及其他特征、方面和优点。具体实施方式[0019]下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。[0020]本发明提供一种硫酸多粘菌素B的制备方法，其至少包括以下步骤：[0021]1多粘菌素B种子制备:将产多粘菌素B菌种置于培养基A中进行复苏培养，然后置于培养基B中进行摇床培养，得到活化的产多粘菌素B菌种；[0022]2发酵:将步骤（1得到的活化的产多粘菌素B菌种加入至培养罐C中，种子罐培养;然后置于培养罐D中，进行发酵罐培养，得到多粘菌素B菌种的发酵液；[0023]3精制：对步骤2得到的多粘菌素B菌种的发酵液进行过滤、离子交换树脂处理、大孔树脂处理、解吸液碱结晶、转盐、脱色、纳滤浓缩、真空冷冻干燥，得到硫酸多粘菌素B0[0024]在一种实施方式中，所述步骤⑴中所述培养基A中每IOOml培养基含有以下组份：蔗糖l-3g、蛋白胨l-5g、磷酸氢二钾0.l-0.5g、七水硫酸镁0.2-lg、琼脂l-3g、余量为水;优选地，所述步骤⑴中所述培养基A中每IOOml培养基含有以下组份:蔗糖l-3g、蛋白胨l-3g、磷酸氢二钾〇.2-0.3g、七水硫酸镁0.3-0.8g、琼脂I-3g、余量为水;更优选地，所述步骤（I中所述培养基A中每IOOml培养基含有以下组份:蔗糖2g、蛋白胨2g、磷酸氢二钾0.25g、七水硫酸镁〇.6g、琼脂2g、余量为水。[0025]在一种实施方式中，所述步骤⑴中所述培养基B中每IOOml培养基含有以下组份：小麦粉7-10g、淀粉酶0.002-0.Olg、酵母粉0.2-0.6g、碳酸钙0.1-0.5g、磷酸氢二钠0.01-〇.〇3g、硫酸铵0.2-0.7g、余量为水;优选地，所述步骤（1中所述培养基B中每IOOml培养基含有以下组份:小麦粉8-1Og、淀粉酶0.003-0.008g、酵母粉0.3-0.5g、碳酸钙0.2-0.4g、磷酸氢二钠〇.01-0.〇3g、硫酸铵0.3-0.5g、余量为水;更优选地，所述步骤（1中所述培养基B中每IOOml培养基含有以下组份:小麦粉9g、淀粉酶0.005g、酵母粉0.45g、碳酸钙0.3g、磷酸氢二钠0.015g、硫酸铵0.45g、余量为水。[0026]本发明步骤⑴中进行复苏培养具体如下：[0027]将现配的培养基A在121°C条件下蒸汽消毒25min并摆放斜面，然后接种产多粘菌素B菌种，29±0.5°C条件下培养48h。[0028]本发明步骤⑴中进行摇床培养具体如下：[0029]现配的培养基B在121°C条件下蒸汽消毒25min，用玻璃棒从培养基A中刮起菌苔，置于培养基B中，29±0.5°C条件下摇床培养15-17h，涂片镜检无其他菌种，合格后作为生产菌种。[0030]在一种实施方式中，所述步骤2中所述培养罐C中每IOOml培养基含有以下组份：小麦粉7-10g、淀粉酶0.002-0.Olg、酵母粉0.2-0.6g、碳酸钙0.1-0.5g、磷酸氢二钠0.01-〇.〇3g、硫酸铵0.2-0.7g、消泡剂0.01-0.05g、余量为水;优选地，所述步骤2中所述培养罐：中每1001111培养基含有以下组份:小麦粉8-1^、淀粉酶0.003-0.0088、酵母粉0.3-0.58、碳酸钙0.2-0.4g、磷酸氢二钠0.01-0.03g、硫酸铵0.3-0.5g、消泡剂0.02-0.04g、余量为水;更优选地，所述步骤（2中所述培养罐C中每IOOml培养基含有以下组份：小麦粉9g、淀粉酶0.0058、酵母粉0.458、碳酸钙0.38、磷酸氢二钠0.0158、硫酸铵0.458、消泡剂0.038、余量为水。[0031]在一种实施方式中，所述步骤2中所述培养罐D中每IOOml培养基含有以下组份：小麦粉l〇_15g、淀粉酶0.001-0.Olg、酵母粉0.5-lg、碳酸钙0.1-0.5g、磷酸氢二钠0.01-〇.〇3g、硫酸铵0.2-0.7g、消泡剂0.01-0.05g、L-苏氨酸0.01-0.lg、余量为水;优选地，所述步骤（2中所述培养罐D中每IOOml培养基含有以下组份：小麦粉ll-13g、淀粉酶0.005-0·008g、酵母粉0·6-0.9g、碳酸钙0·2-0.4g、磷酸氢二钠0·01-0·02g、硫酸铵0·2-0.6g、消泡剂0.02-0.04g、L-苏氨酸0.05-0.09g、余量为水;更优选地，所述步骤2中所述培养罐D中每IOOml培养基含有以下组份:小麦粉12g、淀粉酶0.006g、酵母粉0.8g、碳酸钙0.3g、磷酸氢二钠0.015g、硫酸铵0.45g、消泡剂0.03g、L-苏氨酸0.08g、余量为水。[0032]本发明中所述消泡剂为GPE型聚氧乙烯聚氧丙烯甘油醚。[0033]本发明步骤⑵中进行种子罐培养具体如下：[0034]现配的培养罐C在120°C条件下蒸汽消毒20min并降温至29±0.5°C，将步骤（1得到的产多粘菌素B菌种用火焰接种法接入培养罐C中，温度29±0.5°C，罐压0.045_0.055MPa;空气流量0.3-0.5VVM;搅拌时间15-17h，搅拌速度:0-5h为300rpm，6h至反应结束500rpm;pH降至6.0±0.2得到种罐种子，进行移种。[0035]本发明步骤⑵中进行发酵罐培养具体如下：[0036]现配的培养罐D在120°C条件下蒸汽消毒20min并降温至29±0.5°C，将培养好的种罐种子用压差法移至培养罐D中进行培养，温度29±0.5°C，罐压0.045-0.055MPa;空气流量0.3-0.5VVM;培养时间18-20h，搅拌速度:400rpm。[0037]在一种实施方式中，所述步骤2中发酵罐培养过程中还包括补料过程，所述补料配方中每IOOml培养基含有以下组份:L-苏氨酸0.01-0.lg、硫酸铵0.1-0.5g、余量为水;优选地，所述步骤2中发酵罐培养过程中还包括补料过程，所述补料配方中每IOOml培养基含有以下组份:L-苏氨酸0.05-0.Ig、硫酸铵0.3-0.4g、余量为水;更优选地，所述步骤⑵中发酵罐培养过程中还包括补料过程，所述补料配方中每IOOml培养基含有以下组份:L-苏氨酸0.08g、硫酸铵0.3g、余量为水。[0038]本发明中将补料缓慢流加到发酵罐中，继续发酵，温度29±0.5°C，罐压0.045-0.055MPa;空气流量0.5VVM;继续培养18-22h，搅拌速度:400rpm。[0039]补料一般是在发酵进行至大量生成产物的阶段，因合成产物和维持细胞活动的需要，有选择地补充营养物质。合适的补料工艺能够有效地控制微生物的中间代谢，使之向着有利于产物积累的方向发展。补料发酵补加的营养物质大致有五类:①补充菌体所需的能源和碳源，如葡萄糖和液化淀粉等;②补充菌体所需氮源，如蛋白胨、豆饼粉、玉米浆、酵母粉和尿素等有机氮源。有些发酵还采取通入氨气或添加氨水等。③加入某些菌体生长代谢所需的微量元素和无机盐，如磷酸盐、硫酸盐等。④对于产诱导酶的微生物，常在补料中适当加入该酶的作用底物，以提高酶的产量。⑤对一些抗生素发酵，往往需要补充抗生素形成的前体。[0040]前体补料是指在抗生素发酵过程中加入化学前体物质，用于控制抗生素的生物合成方向及增加抗生素产量，可被抗生素生产菌摄取利用并掺入到抗生素合成结构中。[0041]多粘菌素B的化学组成为7个氨基酸组成的环状结构和一个3个氨基酸的侧链，链的末端连接甲基辛酸。整个结构中包含了6个2,4_二氨基丁酸Dab结构，研究发现用L-2，4-二氨基丁酸C14作示踪标记，标记化合物可掺入多粘菌素B内，说明前者是多粘菌素B的前体。并且从多粘杆菌中分离出了L-Dab活化酶，L-Dab活化酶参与多粘菌素B的合成，研究表明失去合成多粘菌素能力的变株都不能活化L-Dab;当多粘杆菌生长在不利于多粘菌素生长的环境下时，L-Dab活化酶活力下降。[0042]L-苏氨酸结构为2-氨基-3-羟基丁酸，与L-Dab结构相似，利用L-苏氨酸-C14作示踪标记，再加入氯霉素，放线菌素D抑制标记物掺入蛋白质合成中，而更多的被生产菌利用，可刺激多粘菌素的形成。所以L-苏氨酸是多粘菌素合成的潜在底物，可用于发酵补料方式增加产量和杂质控制。L0044」在一种实施方式中，所述步骤⑶中离子交换树脂为强酸阳离子树脂。[0045]在一种实施方式中，所述强酸阳离子树脂为4-磺酰胺苯甲酰亚胺CAS号：54951-45-0和4-磺酸基吡啶-3-磺酰胺CAS号:72810-60-7改性732阳离子交换树脂。[0046]所述强酸阳离子树脂的制备方法包括以下步骤：[0047]1向反应器中加入732氢离子型聚苯乙烯-二乙烯苯磺酸阳离子树脂，三氯甲烷，室温下溶胀30h，滴加氯化亚砜三氯甲烷的混合溶液所述氯化亚砜与所述三氯甲烷的质量体积比为1:3，升温至75°C，保温反应10h，降温至室温，过滤，用二氯甲烷洗涤3次，得到氯化732氢离子型聚苯乙烯-二乙烯苯磺酸阳离子树脂;所述732氢离子型聚苯乙烯-二乙烯苯磺酸阳离子树脂与所述三氯甲烷的重量比为1:6;所述732氢离子型聚苯乙烯-二乙烯苯磺酸阳离子树脂与所述氯化亚砜的摩尔比为I:I.I;[0048]2向反应器中加入步骤⑴得到的氯化732氢离子型聚苯乙烯-二乙烯苯磺酸阳离子树脂、4-磺酸基吡啶-3-磺酰胺与三氯甲烷的混合溶液所述4-磺酸基吡啶-3-磺酰胺与所述三氯甲烷重量体积比为1:3、三氯甲烷，升温至70°C，保温反应6h，加入4-磺酰胺苯甲酰亚胺与三氯甲烷的混合溶液所述4-磺酰胺苯甲酰亚胺与所述三氯甲烷重量体积比为1:2，保温反应8h，降温至室温，过滤，用二氯甲烷洗涤2次、丙酮洗涤3次，60°C减压干燥24h，得到强酸阳离子树脂;所述氯化732氢离子型聚苯乙烯-二乙烯苯磺酸阳离子树脂与所述4-磺酸基吡啶-3-磺酰胺、所述4-磺酰胺苯甲酰亚胺的摩尔比为1:0.3:0.7;所述氯化732氢离子型聚苯乙烯-二乙烯苯磺酸阳离子树脂与所述三氯甲烷的重量比为1:6。[0049]本发明中通过4-磺酰胺苯甲酰亚胺和4-磺酸基吡啶-3-磺酰胺改性732阳离子交换树脂，得到的强酸阳离子树脂对金属离子具有优异的分离性能，4-磺酸基吡啶-3-磺酰胺引入基团磺酸基和吡啶基中的配位原子对金属离子的络合作用；同时4-磺酰胺苯甲酰亚胺和4-磺酸基吡啶-3-磺酰胺中带负电荷的磺酸基与带正电荷的金属离子间的静电作用，两者协同作用，促进强酸阳离子树脂对金属离子具有分离；另外通过4-磺酰胺苯甲酰亚胺和4-磺酸基吡啶-3-磺酰胺改性732阳离子交换树脂能够提高强酸阳离子树脂的再生性能及对杂质的分离效果，提高产品的质量。[0050]本发明中所述金属离子至少包括钙离子。[0051]本发明中所述水为无菌纯化水。[0052]在一种实施方式中，所述步骤（3中大孔树脂包括D001、D113、D201、D301、D370、Dl52中一种;优选地，所述步骤⑶中大孔树脂为Dl52。[0053]本发明步骤⑶中进行过滤具体如下：[0054]将发酵液用冷冻离心机离心10_30min，收集一次上清液，用草酸调节上清液pH至3.0，搅拌0.5-lh，再用冷冻离心机离心10-30min，收集二次上清液，并降温至5-10°C。[0055]本发明步骤⑶中进行离子交换树脂处理具体如下：[0056]将离子交换树脂进行装柱，先用lmolL盐酸处理至出口料液pH2.0，浸泡2h，纯化水洗酸至pH5.0以上，再用lmolL氢氧化钠水溶液处理至淋洗液pH彡10.0，浸泡2h，用纯化水洗碱至pH9.0以下，将降温至5-10°C的二次上清液进行过柱处理，得脱钙液;所述二次上清液与所述离子交换树脂的配比为5-10:1;二次上清液质量以Kg计，离子交换树脂体积以L计;所述盐酸溶液与所述离子交换树脂的配比为（1-3:1;盐酸溶液质量以Kg计，离子交换树脂体积以L计;所述氢氧化钠水溶液与所述离子交换树脂的配比为（1-3:1;氢氧化钠水溶液质量以Kg计，离子交换树脂体积以L计;所述纯化水与所述离子交换树脂的配比为3-6:1;纯化水质量以Kg计，离子交换树脂体积以L计；[0057]本发明步骤⑶中进行大孔树脂处理具体如下：[0058]将大孔树脂进行装柱，先用lmolL盐酸处理至出口料液pH彡2.0，浸泡2h，纯化水洗酸至pH5.0以上，再用Imo1L氢氧化钠水溶液处理至出口料液pH彡10.0，浸泡2h，纯化水洗碱至pH9.0以下，将脱钙液用lmolL氢氧化钠水溶液调节pH值至6.0-6.2并降温至5-10°C的脱钙液进行过柱吸附，用纯化水洗柱，直至流出液470nm下的透光率大于95%，然后用0.2molL的硫酸溶液进行解吸，至流出液单位小于2000单位停止收集，得解吸液，所述脱钙液与所述大孔树脂的配比为5-10:1;脱钙液质量以Kg计，大孔树脂体积以L计;所述氢氧化钠水溶液与所述大孔树脂的配比为（1-3:1;氢氧化钠水溶液质量以Kg计，大孔树脂体积以L计;所述纯化水与所述大孔树脂的配比为3-6:1;纯化水质量以Kg计，大孔树脂体积以L计;所述盐酸溶液与所述大孔树脂的配比为（1-3:1;盐酸溶液质量以Kg计，大孔树脂体积以1^计。[0059]本发明步骤⑶中进行解吸液碱结晶具体如下：[0060]将解吸液降温至0_5°C，用lmolL氢氧化钠水溶液调节pH值至12.0，以0.05-0.15°Cmin升温至20°C，升温过程保持以20-30rpm搅拌2-6h，过滤，用13倍解吸液体积的70°C纯化水进行洗涤3次，得到多粘菌素B粗品。[0061]本发明步骤⑶中进行转盐具体如下：[0062]向多粘菌素B粗品中用质量分数为9.5-10.5%的硫酸调节值至4.8-5.2，搅拌至多粘菌素B粗品完全溶解，得到硫酸多粘菌素B溶解液。[0063]本发明步骤⑶中进行脱色具体如下：[0064]向硫酸多粘菌素B溶解液升温至50-60°C，加入活性炭，保温搅拌0.5-lh，过滤得到硫酸多粘菌素B脱色液，470nm下测吸光值应低于0.01510000ygml。所述硫酸多粘菌素B与所述活性炭的重量比为1:0.02。[0065]本发明步骤⑶中进行纳滤浓缩具体如下：[0066]将硫酸多粘菌素B脱色液进行纳滤浓缩，加压栗压力1.0-1.5MPa，浓缩出料液回母罐循环过柱，顶洗纯化水，至流出废液电导率降到30以下，收集浓缩液，得到纳滤浓缩后硫酸多粘菌素B溶液。[0067]本发明步骤⑶中进行真空冷冻干燥具体如下：[0068]将纳滤浓缩后硫酸多粘菌素B溶液进行真空冷冻干燥，所述真空冷冻干燥的温度为-30°C〜35°C—阶段：-30°C保温8h，变温速率0·7°Cmin;二阶段：-10°C保温6h，变温速率0.1°Cmin;三阶段:0°C保温7h，变温速率0.1°Cmin;四阶段：15°C保温4h，变温速率0.1°Cmin;五阶段:35°C保温3h，变温速率0.1°Cmin;，真空度5-10Pa，得到高纯度硫酸多粘菌素B。[0069]在一种实施方式中，所述步骤（1中的产多粘菌素B菌种为多粘类芽孢杆菌Paenibacillus0[0070]本发明中粘类芽孢杆菌Paenibacillus的菌株保藏编号:CPCC140855。[0071]本发明中，如果没有其它说明，所用原料都是市售的，购于国药化学试剂。[0072]为了进一步说明本发明，下面通过以下实施例进行详细说明。[0073]实施例1[0074]—种硫酸多粘菌素B的制备方法，其至少包括以下步骤：[0075]1多粘菌素B种子制备:将产多粘菌素B菌种置于培养基A中进行复苏培养，然后置于培养基B中进行摇床培养，得到活化的产多粘菌素B菌种;所述步骤（1中所述培养基A中每IOOml培养基含有以下组份:蔗糖2g、蛋白胨2g、磷酸氢二钾0.25g、七水硫酸镁0.5g、琼月旨2g、余量为水;所述步骤⑴中所述培养基B中每IOOml培养基含有以下组份:小麦粉9g、淀粉酶0.005g、酵母粉0.45g、碳酸钙0.3g、磷酸氢二钠0.015g、硫酸铵0.45g、余量为水；[0076]2发酵:将步骤⑴得到的活化的产多粘菌素B菌种加入至培养罐C中，种子罐培养;然后置于培养罐D中，进行发酵罐培养，补料，继续进行发酵罐培养，得到多粘菌素B菌种的发酵液;所述步骤⑵中所述培养罐C中每IOOml培养基含有以下组份:小麦粉9g、淀粉酶0.0058、酵母粉0.458、碳酸钙0.38、磷酸氢二钠0.0158、硫酸铵0.458、消泡剂0.038、余量为水；所述步骤（2中所述培养罐D中每IOOml培养基含有以下组份：小麦粉12g、淀粉酶0.006〖、酵母粉0.8〖、碳酸|150.3〖、磷酸氢二钠0.015〖、硫酸铵0.45〖、消泡剂0.03〖、1^-苏氨酸0.08g、余量为水;所述补料配方中每IOOml培养基含有以下组份:L-苏氨酸0.08g、硫酸铵〇.3g、余量为水;所述消泡剂为GPE型聚氧乙烯聚氧丙烯甘油醚；[0077]3精制：对步骤2得到的多粘菌素B菌种的发酵液进行过滤、离子交换树脂处理、大孔树脂处理、解吸液碱结晶、转盐、脱色、纳滤浓缩、真空冷冻干燥，得到硫酸多粘菌素B;所述步骤3中离子交换树脂为强酸阳离子树脂;所述强酸阳离子树脂为4-磺酰胺苯甲酰亚胺和4-磺酸基吡啶-3-磺酰胺改性732阳离子交换树脂；所述步骤（3中大孔树脂为D152；[0078]本发明步骤⑴中进行复苏培养具体如下：[0079]将现配的培养基A在121°C条件下蒸汽消毒25min并摆放斜面，然后接种产多粘菌素B菌种，29±0.5°C条件下培养48h。[0080]本发明步骤⑴中进行摇床培养具体如下：[0081]现配的培养基B在121°C条件下蒸汽消毒25min，用玻璃棒从培养基A中刮起菌苔，置于培养基B中，29±0.5°C条件下摇床培养15-17h，涂片镜检无其他菌种，合格后作为生产菌种。[0082]本发明步骤⑵中进行种子罐培养具体如下：[0083]现配的培养罐C在120°C条件下蒸汽消毒20min并降温至29±0.5°C，将步骤（1得到的产多粘菌素B菌种用火焰接种法接入培养罐C中，温度29±0.5°C，罐压0.045_0.055MPa;空气流量0.5VVM;培养时间17h，搅拌速度:0-5h为300rpm，6h至反应结束500rpm;pH降至6.0±0.2得到种罐种子，进行移种。[0084]本发明步骤⑵中进行发酵罐培养具体如下：[0085]现配的培养罐D在120°C条件下蒸汽消毒20min并降温至29±0.5°C，将培养好的种罐种子用压差法移至培养罐D中进行培养，温度29±0.5°C，罐压0.045-0.055MPa;空气流量0.5VVM;培养时间20h，搅拌速度:400rpm。[0086]本发明步骤⑶中进行过滤具体如下：[0087]将发酵液用冷冻离心机离心30min，收集一次上清液，用草酸调节上清液pH至3.0，搅拌0.5h，再用冷冻离心机离心30min，收集二次上清液，并降温至6°C。[0088]本发明步骤⑶中进行离子交换树脂处理具体如下：[0089]将离子交换树脂进行装柱，先用lmolL盐酸处理至出口料液pH至2.0，浸泡2h，纯化水洗酸至pH5.0，再用lmolL氢氧化钠水溶液处理至淋洗液pH至10.0，浸泡2h，用纯化水洗碱至pH9.0，将降温至5-10°C的二次上清液进行过柱处理，得脱钙液;所述二次上清液与所述离子交换树脂的配比为8:1;二次上清液质量以Kg计，离子交换树脂体积以L计;所述盐酸溶液与所述离子交换树脂的配比为2.4:1;盐酸溶液质量以Kg计，离子交换树脂体积以L计;所述氢氧化钠水溶液与所述离子交换树脂的配比为2:1;氢氧化钠水溶液质量以Kg计，离子交换树脂体积以L计;所述纯化水与所述离子交换树脂的配比为5:1;纯化水质量以Kg计，离子交换树脂体积以L计；[0090]本发明步骤⑶中进行大孔树脂处理具体如下：[0091]将大孔树脂进行装柱，先用lmolL盐酸处理至出口料液pH至2.0,浸泡2h，纯化水洗酸至pH5.0，再用lmolL氢氧化钠水溶液处理至出口料液pH至10.0，浸泡2h，纯化水洗碱至pH9.0，将脱钙液用lmolL氢氧化钠水溶液调节pH值至6.0并降温至5-10°C的脱钙液进行过柱吸附，用纯化水洗柱，直至流出液470nm下的透光率大于95%，然后用0.2moIL的硫酸溶液进行解吸，至流出液单位小于2000单位停止收集，得解吸液，所述脱钙液与所述大孔树脂的配比为8:1;脱钙液质量以Kg计，大孔树脂体积以L计;所述氢氧化钠水溶液与所述大孔树脂的配比为1.2:1;氢氧化钠水溶液质量以Kg计，大孔树脂体积以L计;所述纯化水与所述大孔树脂的配比为4.5:1;纯化水质量以Kg计，大孔树脂体积以L计;所述盐酸溶液与所述大孔树脂的配比为1.3:1;盐酸溶液质量以Kg计，大孔树脂体积以L计。[0092]本发明步骤⑶中进行解吸液碱结晶具体如下：[0093]将解吸液降温至2°C，用lmolL氢氧化钠水溶液调节pH值至12.0，以0.l°Cmin升温至20°C，升温过程保持以20-30rpm搅拌4h，过滤，用13倍解吸液体积的70°C纯化水进行洗涤3次，得到多粘菌素B粗品。[0094]本发明步骤⑶中进行溶解具体如下：[0095]向多粘菌素B粗品中用质量分数为9.5%的硫酸调节值至5.0,搅拌lh，多粘菌素B粗品完全溶解，得到硫酸多粘菌素B溶解液。[0096]本发明步骤⑶中进行脱色具体如下：[0097]向硫酸多粘菌素B溶解液升温至55°C，加入活性炭，保温搅拌Ih，得到硫酸多粘菌素B脱色液;所述硫酸多粘菌素B与所述活性炭的重量比为1:0.02。[0098]本发明步骤⑶中进行纳滤浓缩具体如下：[0099]将硫酸多粘菌素B脱色液进行纳滤浓缩，加压栗压力1.0-1.5Mpa，浓缩出料液回母罐循环过柱，顶洗纯化水，至流出废液电导率降到30以下，收集浓缩液，得到纳滤浓缩后硫酸多粘菌素B溶液。[0100]本发明步骤⑶中进行真空冷冻干燥具体如下：[0101]将纳滤浓缩后硫酸多粘菌素B溶液进行真空冷冻干燥，所述真空冷冻干燥的温度为-30°C〜35°C—阶段：-30°C保温8h，变温速率0·7°Cmin;二阶段：-10°C保温6h，变温速率0.1°Cmin;三阶段:0°C保温7h，变温速率0.1°Cmin;四阶段：15°C保温4h，变温速率0.1°Cmin;五阶段:35°C保温3h，变温速率0.1°Cmin;，真空度5-10Pa，得到高纯度硫酸多粘菌素B。[0102]所述强酸阳离子树脂的制备方法包括以下步骤：[0103]1向反应器中加入732氢离子型聚苯乙烯-二乙烯苯磺酸阳离子树脂，三氯甲烷，室温下溶胀30h，滴加氯化亚砜三氯甲烷的混合溶液所述氯化亚砜与所述三氯甲烷的质量体积比为1:3，升温至75°C，保温反应10h，降温至室温，过滤，用二氯甲烷洗涤3次，得到氯化732氢离子型聚苯乙烯-二乙烯苯磺酸阳离子树脂;所述732氢离子型聚苯乙烯-二乙烯苯磺酸阳离子树脂与所述三氯甲烷的重量比为1:6;所述732氢离子型聚苯乙烯-二乙烯苯磺酸阳离子树脂与所述氯化亚砜的摩尔比为1:1.1;[0104]2向反应器中加入步骤⑴得到的氯化732氢离子型聚苯乙烯-二乙烯苯磺酸阳离子树脂、4-磺酸基吡啶-3-磺酰胺与三氯甲烷的混合溶液所述4-磺酸基吡啶-3-磺酰胺与所述三氯甲烷重量体积比为1:3、三氯甲烷，升温至70°C，保温反应6h，加入4-磺酰胺苯甲酰亚胺与三氯甲烷的混合溶液所述4-磺酰胺苯甲酰亚胺与所述三氯甲烷重量体积比为1:2，保温反应8h，降温至室温，过滤，用二氯甲烷洗涤2次、丙酮洗涤3次，60°C减压干燥24h，得到强酸阳离子树脂;所述氯化732氢离子型聚苯乙烯-二乙烯苯磺酸阳离子树脂与所述4-磺酸基吡啶-3-磺酰胺、所述4-磺酰胺苯甲酰亚胺的摩尔比为1:0.3:0.7;所述氯化732氢离子型聚苯乙烯-二乙烯苯磺酸阳离子树脂与所述三氯甲烷的重量比为1:6。[0105]实施例2[0106]—种硫酸多粘菌素B的制备方法，其至少包括以下步骤：[0107]1多粘菌素B种子制备:将产多粘菌素B菌种置于培养基A中进行复苏培养，然后置于培养基B中进行摇床培养，得到活化的产多粘菌素B菌种;所述步骤（1中所述培养基A中每IOOml培养基含有以下组份:蔗糖2g、蛋白胨2g、磷酸氢二钾0.25g、七水硫酸镁0.5g、琼月旨2g、余量为水;所述步骤⑴中所述培养基B中每IOOml培养基含有以下组份:小麦粉9g、淀粉酶0.005g、酵母粉0.45g、碳酸钙0.3g、磷酸氢二钠0.015g、硫酸铵0.45g、余量为水；[0108]2发酵:将步骤⑴得到的活化的产多粘菌素B菌种加入至培养罐C中，种子罐培养;然后置于培养罐D中，进行发酵罐培养，补料，继续进行发酵罐培养，得到多粘菌素B菌种的发酵液;所述步骤⑵中所述培养罐C中每IOOml培养基含有以下组份:小麦粉9g、淀粉酶0.0058、酵母粉0.458、碳酸钙0.38、磷酸氢二钠0.0158、硫酸铵0.458、消泡剂0.038、余量为水；所述步骤（2中所述培养罐D中每IOOml培养基含有以下组份：小麦粉12g、淀粉酶0.006〖、酵母粉0.8〖、碳酸|150.3〖、磷酸氢二钠0.015〖、硫酸铵0.45〖、消泡剂0.03〖、1^-苏氨酸0.08g、余量为水;所述补料配方中每IOOml培养基含有以下组份:L-苏氨酸O.Olg、硫酸铵〇.37g、余量为水;所述消泡剂为GPE型聚氧乙烯聚氧丙烯甘油醚；[0109]3精制：对步骤2得到的多粘菌素B菌种的发酵液进行过滤、离子交换树脂处理、大孔树脂处理、解吸液碱结晶、转盐、脱色、纳滤浓缩、真空冷冻干燥，得到硫酸多粘菌素B;所述步骤3中离子交换树脂为强酸阳离子树脂;所述强酸阳离子树脂为4-磺酰胺苯甲酰亚胺和4-磺酸基吡啶-3-磺酰胺改性732阳离子交换树脂；所述步骤（3中大孔树脂为D152；[0110]本发明步骤⑴中进行复苏培养、本发明步骤⑴中进行摇床培养、本发明步骤2中进行种子罐培养、本发明步骤⑵中进行发酵罐培养、本发明步骤⑶中进行过滤、本发明步骤⑶中进行离子交换树脂处理、本发明步骤⑶中进行大孔树脂处理、本发明步骤⑶中进行解吸液碱结晶、本发明步骤3中进行溶解、本发明步骤3中进行脱色、本发明步骤3中进行纳滤浓缩、本发明步骤3中进行真空冷冻干燥、所述强酸阳离子树脂的制备方法同实施例1。[0111]实施例3[0112]—种硫酸多粘菌素B的制备方法，其至少包括以下步骤：[0113]1多粘菌素B种子制备:将产多粘菌素B菌种置于培养基A中进行复苏培养，然后置于培养基B中进行摇床培养，得到活化的产多粘菌素B菌种;所述步骤（1中所述培养基A中每IOOml培养基含有以下组份:蔗糖2g、蛋白胨2g、磷酸氢二钾0.25g、七水硫酸镁0.5g、琼月旨2g、余量为水;所述步骤⑴中所述培养基B中每IOOml培养基含有以下组份:小麦粉9g、淀粉酶0.005g、酵母粉0.45g、碳酸钙0.3g、磷酸氢二钠0.015g、硫酸铵0.45g、余量为水；[0114]2发酵:将步骤⑴得到的活化的产多粘菌素B菌种加入至培养罐C中，种子罐培养;然后置于培养罐D中，进行发酵罐培养，补料，继续进行发酵罐培养，得到多粘菌素B菌种的发酵液;所述步骤⑵中所述培养罐C中每IOOml培养基含有以下组份:小麦粉9g、淀粉酶0.0058、酵母粉0.458、碳酸钙0.38、磷酸氢二钠0.0158、硫酸铵0.458、消泡剂0.038、余量为水；所述步骤（2中所述培养罐D中每IOOml培养基含有以下组份：小麦粉12g、淀粉酶0.006〖、酵母粉0.8〖、碳酸|150.3〖、磷酸氢二钠0.015〖、硫酸铵0.45〖、消泡剂0.03〖、1^-苏氨酸0.08g、余量为水;所述补料配方中每IOOml培养基含有以下组份:L-苏氨酸O.lg、硫酸铵0.28g、余量为水;所述消泡剂为GPE型聚氧乙烯聚氧丙烯甘油醚；[0115]3精制：对步骤2得到的多粘菌素B菌种的发酵液进行过滤、离子交换树脂处理、大孔树脂处理、解吸液碱结晶、转盐、脱色、纳滤浓缩、真空冷冻干燥，得到硫酸多粘菌素B;所述步骤3中离子交换树脂为强酸阳离子树脂;所述强酸阳离子树脂为4-磺酰胺苯甲酰亚胺和4-磺酸基吡啶-3-磺酰胺改性732阳离子交换树脂；所述步骤（3中大孔树脂为D152；[0116]本发明步骤⑴中进行复苏培养、本发明步骤⑴中进行摇床培养、本发明步骤2中进行种子罐培养、本发明步骤⑵中进行发酵罐培养、本发明步骤⑶中进行过滤、本发明步骤⑶中进行离子交换树脂处理、本发明步骤⑶中进行大孔树脂处理、本发明步骤⑶中进行解吸液碱结晶、本发明步骤3中进行溶解、本发明步骤3中进行脱色、本发明步骤3中进行纳滤浓缩、本发明步骤3中进行真空冷冻干燥、所述强酸阳离子树脂的制备方法同实施例1。[0117]对比例1[0118]—种硫酸多粘菌素B的制备方法，其至少包括以下步骤：[0119]1多粘菌素B种子制备:将产多粘菌素B菌种置于培养基A中进行复苏培养，然后置于培养基B中进行摇床培养，得到活化的产多粘菌素B菌种;所述步骤（1中所述培养基A中每IOOml培养基含有以下组份:蔗糖2g、蛋白胨2g、磷酸氢二钾0.25g、七水硫酸镁0.5g、琼月旨2g、余量为水;所述步骤⑴中所述培养基B中每IOOml培养基含有以下组份:小麦粉9g、淀粉酶0.005g、酵母粉0.45g、碳酸钙0.3g、磷酸氢二钠0.015g、硫酸铵0.45g、余量为水；[0120]2发酵:将步骤⑴得到的活化的产多粘菌素B菌种加入至培养罐C中，种子罐培养;然后置于培养罐D中，进行发酵罐培养，补料，继续进行发酵罐培养，得到多粘菌素B菌种的发酵液;所述步骤⑵中所述培养罐C中每IOOml培养基含有以下组份:小麦粉9g、淀粉酶0.0058、酵母粉0.458、碳酸钙0.38、磷酸氢二钠0.0158、硫酸铵0.458、消泡剂0.038、余量为水；所述步骤（2中所述培养罐D中每IOOml培养基含有以下组份：小麦粉12g、淀粉酶0.006〖、酵母粉0.8〖、碳酸|150.3〖、磷酸氢二钠0.015〖、硫酸铵0.45〖、消泡剂0.03〖、1^-苏氨酸0.08g、余量为水;所述补料配方中每IOOml培养基含有以下组份:L-苏氨酸0.08g、葡萄糖〇.3g、余量为水;所述消泡剂为GPE型聚氧乙烯聚氧丙烯甘油醚；[0121]3精制：对步骤2得到的多粘菌素B菌种的发酵液进行过滤、离子交换树脂处理、大孔树脂处理、解吸液碱结晶、转盐、脱色、纳滤浓缩、真空冷冻干燥，得到硫酸多粘菌素B;所述步骤3中离子交换树脂为强酸阳离子树脂;所述强酸阳离子树脂为4-磺酰胺苯甲酰亚胺和4-磺酸基吡啶-3-磺酰胺改性732阳离子交换树脂；所述步骤（3中大孔树脂为D152；[0122]本发明步骤⑴中进行复苏培养、本发明步骤⑴中进行摇床培养、本发明步骤2中进行种子罐培养、本发明步骤⑵中进行发酵罐培养、本发明步骤⑶中进行过滤、本发明步骤⑶中进行离子交换树脂处理、本发明步骤⑶中进行大孔树脂处理、本发明步骤⑶中进行解吸液碱结晶、本发明步骤3中进行溶解、本发明步骤3中进行脱色、本发明步骤3中进行纳滤浓缩、本发明步骤3中进行真空冷冻干燥、所述强酸阳离子树脂的制备方法同实施例1。[0123]对比例2[0124]—种硫酸多粘菌素B的制备方法，其至少包括以下步骤：[0125]1多粘菌素B种子制备:将产多粘菌素B菌种置于培养基A中进行复苏培养，然后置于培养基B中进行摇床培养，得到活化的产多粘菌素B菌种;所述步骤（1中所述培养基A中每IOOml培养基含有以下组份:蔗糖2g、蛋白胨2g、磷酸氢二钾0.25g、七水硫酸镁0.5g、琼月旨2g、余量为水;所述步骤⑴中所述培养基B中每IOOml培养基含有以下组份:小麦粉9g、淀粉酶0.005g、酵母粉0.45g、碳酸钙0.3g、磷酸氢二钠0.015g、硫酸铵0.45g、余量为水；[0126]2发酵:将步骤⑴得到的活化的产多粘菌素B菌种加入至培养罐C中，种子罐培养;然后置于培养罐D中，进行发酵罐培养，补料，继续进行发酵罐培养，得到多粘菌素B菌种的发酵液;所述步骤⑵中所述培养罐C中每IOOml培养基含有以下组份:小麦粉9g、淀粉酶0.0058、酵母粉0.458、碳酸钙0.38、磷酸氢二钠0.0158、硫酸铵0.458、消泡剂0.038、余量为水；所述步骤（2中所述培养罐D中每IOOml培养基含有以下组份：小麦粉12g、淀粉酶0.006〖、酵母粉0.8〖、碳酸|150.3〖、磷酸氢二钠0.015〖、硫酸铵0.45〖、消泡剂0.03〖、1^-苏氨酸0.08g、余量为水;所述补料配方中每IOOml培养基含有以下组份:L-苏氨酸0.08g、硫酸铵〇.2g、葡萄糖O.lg、余量为水;所述消泡剂为GPE型聚氧乙烯聚氧丙烯甘油醚；[0127]3精制：对步骤2得到的多粘菌素B菌种的发酵液进行过滤、离子交换树脂处理、大孔树脂处理、解吸液碱结晶、转盐、脱色、纳滤浓缩、真空冷冻干燥，得到硫酸多粘菌素B;所述步骤3中离子交换树脂为强酸阳离子树脂;所述强酸阳离子树脂为4-磺酰胺苯甲酰亚胺和4-磺酸基吡啶-3-磺酰胺改性732阳离子交换树脂；所述步骤（3中大孔树脂为D152；[0128]本发明步骤⑴中进行复苏培养、本发明步骤⑴中进行摇床培养、本发明步骤2中进行种子罐培养、本发明步骤⑵中进行发酵罐培养、本发明步骤⑶中进行过滤、本发明步骤⑶中进行离子交换树脂处理、本发明步骤⑶中进行大孔树脂处理、本发明步骤⑶中进行解吸液碱结晶、本发明步骤3中进行溶解、本发明步骤3中进行脱色、本发明步骤3中进行纳滤浓缩、本发明步骤3中进行真空冷冻干燥、所述强酸阳离子树脂的制备方法同实施例1。[0129]对比例3[0130]—种硫酸多粘菌素B的制备方法，其至少包括以下步骤：[0131]1多粘菌素B种子制备:将产多粘菌素B菌种置于培养基A中进行复苏培养，然后置于培养基B中进行摇床培养，得到活化的产多粘菌素B菌种;所述步骤（1中所述培养基A中每IOOml培养基含有以下组份:蔗糖2g、蛋白胨2g、磷酸氢二钾0.25g、七水硫酸镁0.5g、琼月旨2g、余量为水;所述步骤⑴中所述培养基B中每IOOml培养基含有以下组份:小麦粉9g、淀粉酶0.05g、酵母粉0.45g、碳酸钙0.3g、磷酸氢二钠0.015g、硫酸铵0.45g、余量为水；[0132]2发酵:将步骤⑴得到的活化的产多粘菌素B菌种加入至培养罐C中，种子罐培养;然后置于培养罐D中，进行发酵罐培养，得到多粘菌素B菌种的发酵液;所述步骤2中所述培养罐C中每IOOml培养基含有以下组份:小麦粉9g、淀粉酶0.05g、酵母粉0.45g、碳酸钙〇.3g、磷酸氢二钠0.015g、硫酸铵0.45g、消泡剂0.03g、余量为水;所述步骤2中所述培养罐D中每IOOml培养基含有以下组份:小麦粉12g、淀粉酶0.6g、酵母粉0.8g、碳酸钙0.3g、磷酸氢二钠〇.〇15g、硫酸铵0.45g、消泡剂0.03g、L-苏氨酸0.08g、余量为水;所述消泡剂为GPE型聚氧乙烯聚氧丙烯甘油醚；[0133]3精制：对步骤2得到的多粘菌素B菌种的发酵液进行过滤、离子交换树脂处理、大孔树脂处理、解吸液碱结晶、转盐、脱色、纳滤浓缩、真空冷冻干燥，得到硫酸多粘菌素B;所述步骤3中离子交换树脂为强酸阳离子树脂;所述强酸阳离子树脂为4-磺酰胺苯甲酰亚胺和4-磺酸基吡啶-3-磺酰胺改性732阳离子交换树脂；所述步骤（3中大孔树脂为D152；[0134]本发明步骤⑴中进行复苏培养、本发明步骤⑴中进行摇床培养、本发明步骤2中进行种子罐培养、本发明步骤⑵中进行发酵罐培养、本发明步骤⑶中进行过滤、本发明步骤⑶中进行离子交换树脂处理、本发明步骤⑶中进行大孔树脂处理、本发明步骤⑶中进行解吸液碱结晶、本发明步骤3中进行溶解、本发明步骤3中进行脱色、本发明步骤3中进行纳滤浓缩、本发明步骤3中进行真空冷冻干燥、所述强酸阳离子树脂的制备方法同实施例1;与实施例1区别在于无补料。[0135]对比例4[0136]—种硫酸多粘菌素B的制备方法，其至少包括以下步骤：[0137]1多粘菌素B种子制备:将产多粘菌素B菌种置于培养基A中进行复苏培养，然后置于培养基B中进行摇床培养，得到活化的产多粘菌素B菌种;所述步骤（1中所述培养基A中每IOOml培养基含有以下组份:蔗糖2g、蛋白胨2g、磷酸氢二钾0.25g、七水硫酸镁0.5g、琼月旨2g、余量为水;所述步骤⑴中所述培养基B中每IOOml培养基含有以下组份:小麦粉9g、淀粉酶0.005g、酵母粉0.45g、碳酸钙0.3g、磷酸氢二钠0.015g、硫酸铵0.45g、余量为水；[0138]2发酵:将步骤⑴得到的活化的产多粘菌素B菌种加入至培养罐C中，种子罐培养;然后置于培养罐D中，进行发酵罐培养，补料，继续进行发酵罐培养，得到多粘菌素B菌种的发酵液;所述步骤⑵中所述培养罐C中每IOOml培养基含有以下组份:小麦粉9g、淀粉酶0.0058、酵母粉0.458、碳酸钙0.38、磷酸氢二钠0.0158、硫酸铵0.458、消泡剂0.038、余量为水；所述步骤（2中所述培养罐D中每IOOml培养基含有以下组份：小麦粉12g、淀粉酶0.006〖、酵母粉0.8〖、碳酸|150.3〖、磷酸氢二钠0.015〖、硫酸铵0.45〖、消泡剂0.03〖、1^-苏氨酸0.08g、余量为水;所述补料配方中每IOOml培养基含有以下组份:L-苏氨酸0.08g、硫酸铵〇.3g、余量为水;所述消泡剂为GPE型聚氧乙烯聚氧丙烯甘油醚；[0139]3精制：对步骤2得到的多粘菌素B菌种的发酵液进行过滤、离子交换树脂处理、大孔树脂处理、解吸液碱结晶、转盐、脱色、纳滤浓缩、真空冷冻干燥，得到硫酸多粘菌素B;所述步骤⑶中离子交换树脂为强酸阳离子树脂;所述强酸阳离子树脂为4-磺酸基吡啶_3-磺酰胺改性732阳离子交换树脂;所述步骤3中大孔树脂为D152;[0140]本发明步骤⑴中进行复苏培养、本发明步骤⑴中进行摇床培养、本发明步骤2中进行种子罐培养、本发明步骤⑵中进行发酵罐培养、本发明步骤⑶中进行过滤、本发明步骤⑶中进行离子交换树脂处理、本发明步骤⑶中进行大孔树脂处理、本发明步骤⑶中进行解吸液碱结晶、本发明步骤3中进行溶解、本发明步骤3中进行脱色、本发明步骤3中进行纳滤浓缩、本发明步骤3中进行真空冷冻干燥、所述强酸阳离子树脂的制备方法同实施例1。[0141]对比例5[0142]—种硫酸多粘菌素B的制备方法，其至少包括以下步骤：[0143]1多粘菌素B种子制备:将产多粘菌素B菌种置于培养基A中进行复苏培养，然后置于培养基B中进行摇床培养，得到活化的产多粘菌素B菌种;所述步骤（1中所述培养基A中每IOOml培养基含有以下组份:蔗糖2g、蛋白胨2g、磷酸氢二钾0.25g、七水硫酸镁0.5g、琼月旨2g、余量为水;所述步骤⑴中所述培养基B中每IOOml培养基含有以下组份:小麦粉9g、淀粉酶0.005g、酵母粉0.45g、碳酸钙0.3g、磷酸氢二钠0.015g、硫酸铵0.45g、余量为水；[0144]2发酵:将步骤⑴得到的活化的产多粘菌素B菌种加入至培养罐C中，种子罐培养;然后置于培养罐D中，进行发酵罐培养，补料，继续进行发酵罐培养，得到多粘菌素B菌种的发酵液;所述步骤⑵中所述培养罐C中每IOOml培养基含有以下组份:小麦粉9g、淀粉酶0.0058、酵母粉0.458、碳酸钙0.38、磷酸氢二钠0.0158、硫酸铵0.458、消泡剂0.038、余量为水；所述步骤（2中所述培养罐D中每IOOml培养基含有以下组份：小麦粉12g、淀粉酶0.006〖、酵母粉0.8〖、碳酸|150.3〖、磷酸氢二钠0.015〖、硫酸铵0.45〖、消泡剂0.03〖、1^-苏氨酸0.08g、余量为水;所述补料配方中每IOOml培养基含有以下组份:L-苏氨酸0.08g、硫酸铵〇.3g、余量为水;所述消泡剂为GPE型聚氧乙烯聚氧丙烯甘油醚；[0145]3精制：对步骤2得到的多粘菌素B菌种的发酵液进行过滤、离子交换树脂处理、大孔树脂处理、解吸液碱结晶、转盐、脱色、纳滤浓缩、真空冷冻干燥，得到硫酸多粘菌素B;所述步骤3中离子交换树脂为强酸阳离子树脂;所述强酸阳离子树脂为4-磺酰胺苯甲酰亚胺改性732阳离子交换树脂;所述步骤3中大孔树脂为D152;[0146]本发明步骤⑴中进行复苏培养、本发明步骤⑴中进行摇床培养、本发明步骤2中进行种子罐培养、本发明步骤⑵中进行发酵罐培养、本发明步骤⑶中进行过滤、本发明步骤⑶中进行离子交换树脂处理、本发明步骤⑶中进行大孔树脂处理、本发明步骤⑶中进行解吸液碱结晶、本发明步骤3中进行溶解、本发明步骤3中进行脱色、本发明步骤3中进行纳滤浓缩、本发明步骤3中进行真空冷冻干燥、所述强酸阳离子树脂的制备方法同实施例1。[0147]对比例6[0148]—种硫酸多粘菌素B的制备方法，其至少包括以下步骤：[0149]1多粘菌素B种子制备:将产多粘菌素B菌种置于培养基A中进行复苏培养，然后置于培养基B中进行摇床培养，得到活化的产多粘菌素B菌种;所述步骤（1中所述培养基A中每IOOml培养基含有以下组份:蔗糖2g、蛋白胨2g、磷酸氢二钾0.25g、七水硫酸镁0.5g、琼月旨2g、余量为水;所述步骤⑴中所述培养基B中每IOOml培养基含有以下组份:小麦粉9g、淀粉酶0.005g、酵母粉0.45g、碳酸钙0.3g、磷酸氢二钠0.015g、硫酸铵0.45g、余量为水；[0150]2发酵:将步骤⑴得到的活化的产多粘菌素B菌种加入至培养罐C中，种子罐培养;然后置于培养罐D中，进行发酵罐培养，补料，继续进行发酵罐培养，得到多粘菌素B菌种的发酵液;所述步骤⑵中所述培养罐C中每IOOml培养基含有以下组份:小麦粉9g、淀粉酶0.0058、酵母粉0.458、碳酸钙0.38、磷酸氢二钠0.0158、硫酸铵0.458、消泡剂0.038、余量为水；所述步骤（2中所述培养罐D中每IOOml培养基含有以下组份：小麦粉12g、淀粉酶0.006〖、酵母粉0.8〖、碳酸|150.3〖、磷酸氢二钠0.015〖、硫酸铵0.45〖、消泡剂0.03〖、1^-苏氨酸0.08g、余量为水;所述补料配方中每IOOml培养基含有以下组份:L-苏氨酸0.08g、硫酸铵〇.3g、余量为水;所述消泡剂为GPE型聚氧乙烯聚氧丙烯甘油醚；[0151]3精制：对步骤2得到的多粘菌素B菌种的发酵液进行过滤、离子交换树脂处理、大孔树脂处理、解吸液碱结晶、转盐、脱色、纳滤浓缩、真空冷冻干燥，得到硫酸多粘菌素B;所述步骤⑶中离子交换树脂为强酸阳离子树脂;所述强酸阳离子树脂为732阳离子交换树脂;所述步骤⑶中大孔树脂为Dl52;[0152]本发明步骤⑴中进行复苏培养、本发明步骤⑴中进行摇床培养、本发明步骤2中进行种子罐培养、本发明步骤⑵中进行发酵罐培养、本发明步骤⑶中进行过滤、本发明步骤⑶中进行离子交换树脂处理、本发明步骤⑶中进行大孔树脂处理、本发明步骤⑶中进行解吸液碱结晶、本发明步骤3中进行溶解、本发明步骤3中进行脱色、本发明步骤3中进行纳滤浓缩、本发明步骤⑶中进行真空冷冻干燥同实施例1。[0153]对比例7[0154]—种硫酸多粘菌素B的制备方法，其至少包括以下步骤：[0155]1多粘菌素B种子制备:将产多粘菌素B菌种置于培养基A中进行复苏培养，然后置于培养基B中进行摇床培养，得到活化的产多粘菌素B菌种;所述步骤（1中所述培养基A中每IOOml培养基含有以下组份:蔗糖2g、蛋白胨2g、磷酸氢二钾0.25g、七水硫酸镁0.5g、琼月旨2g、余量为水;所述步骤⑴中所述培养基B中每IOOml培养基含有以下组份:小麦粉9g、淀粉酶0.005g、酵母粉0.45g、碳酸钙0.3g、磷酸氢二钠0.015g、硫酸铵0.45g、余量为水；[0156]2发酵:将步骤⑴得到的活化的产多粘菌素B菌种加入至培养罐C中，种子罐培养;然后置于培养罐D中，进行发酵罐培养，得到多粘菌素B菌种的发酵液;所述步骤2中所述培养罐C中每IOOml培养基含有以下组份:小麦粉9g、淀粉酶0.005g、酵母粉0.45g、碳酸钙〇.3g、磷酸氢二钠0.015g、硫酸铵0.45g、消泡剂0.03g、余量为水;所述步骤2中所述培养罐D中每IOOml培养基含有以下组份:小麦粉12g、淀粉酶0.006g、酵母粉0.8g、碳酸钙0.3g、磷酸氢二钠〇.〇15g、硫酸铵0.45g、消泡剂0.03g、L-苏氨酸0.08g、余量为水；[0157]3精制：对步骤2得到的多粘菌素B菌种的发酵液进行过滤、离子交换树脂处理、大孔树脂处理、解吸液碱结晶、转盐、脱色、纳滤浓缩、真空冷冻干燥，得到硫酸多粘菌素B;所述步骤⑶中离子交换树脂为强酸阳离子树脂;所述强酸阳离子树脂为732阳离子交换树脂;所述步骤⑶中大孔树脂为Dl52;[0158]本发明步骤⑴中进行复苏培养、本发明步骤⑴中进行摇床培养、本发明步骤2中进行种子罐培养、本发明步骤⑵中进行发酵罐培养、本发明步骤⑶中进行过滤、本发明步骤⑶中进行离子交换树脂处理、本发明步骤⑶中进行大孔树脂处理、本发明步骤⑶中进行解吸液碱结晶、本发明步骤3中进行溶解、本发明步骤3中进行脱色、本发明步骤3中进行纳滤浓缩、本发明步骤3中进行真空冷冻干燥同实施例1;与实施例1区别在于无补料且所述强酸阳离子树脂为732阳离子交换树脂。[0159]性能测试：[0160]表1性能测试结果[0163]从上述数据可以看出，在对数生长末期20h以流加方式补充葡萄糖和NH42S04，考察对于多粘菌素B发酵效价的影响。实验例中数据表明，单独添加葡萄糖和单独添加硫酸铵都可以不同程度的提高发酵液的效价，但是硫酸铵的效果要显著好于葡萄糖。当同时补充葡萄糖和硫酸铵时，效果并不是两者的叠加，比单独补充硫酸铵还要略低。所以，在多粘菌素B发酵至20h开始添加硫酸铵，对发酵液效价有显著的提升作用。本发明提供的硫酸多粘菌素B的制备方法，将发酵液中可能影响成品质量的单杂控制到低于1.5%的水平，同时结合有效的精制方法使经该发酵液提取获得的成品质量符合EP8.0及CP2015的标准。[0164]前述的实例仅是说明性的，用于解释本发明所述方法的一些特征。所附的权利要求旨在要求可以设想的尽可能广的范围，且本文所呈现的实施例仅是根据所有可能的实施例的组合的选择的实施方式的说明。因此，申请人的用意是所附的权利要求不被说明本发明的特征的示例的选择限制。在权利要求中所用的一些数值范围也包括了在其之内的子范围，这些范围中的变化也应在可能的情况下解释为被所附的权利要求覆盖。

权利要求：1.一种硫酸多粘菌素B的制备方法，其特征在于，其至少包括以下步骤：1多粘菌素B种子制备:将产多粘菌素B菌种置于培养基A中进行复苏培养，然后置于培养基B中进行摇床培养，得到活化的产多粘菌素B菌种；2发酵:将步骤（1得到的活化的产多粘菌素B菌种加入至培养罐C中，种子罐培养;然后置于培养罐D中，进行发酵罐培养，得到多粘菌素B菌种的发酵液；3精制：对步骤2得到的多粘菌素B菌种的发酵液进行过滤、离子交换树脂处理、大孔树脂处理、解吸液碱结晶、转盐、脱色、纳滤浓缩、真空冷冻干燥，得到硫酸多粘菌素B。2.根据权利要求1所述硫酸多粘菌素B的制备方法，其特征在于，所述步骤（1中所述培养基A中每IOOml培养基含有以下组份:蔗糖l-3g、蛋白胨l-5g、磷酸氢二钾0.1-0.5g、七水硫酸镁〇.2-lg、琼脂l-3g、余量为水。3.根据权利要求1所述硫酸多粘菌素B的制备方法，其特征在于，所述步骤（1中所述培养基B中每IOOml培养基含有以下组份：小麦粉7-10g、淀粉酶0.002-0.Olg、酵母粉0.2-〇.6g、碳酸钙0.1-0.5g、磷酸氢二钠0.01-0.03g、硫酸铵0.2-0.7g、余量为水。4.根据权利要求1所述硫酸多粘菌素B的制备方法，其特征在于，所述步骤2中所述培养罐C中每IOOml培养基含有以下组份：小麦粉7-10g、淀粉酶0.002-0.Olg、酵母粉0.2-〇.6g、碳酸钙0.1-0.5g、磷酸氢二钠0.01-0.03g、硫酸铵0.2-0.7g、消泡剂0.01-0.05g、余量为水。5.根据权利要求1所述硫酸多粘菌素B的制备方法，其特征在于，所述步骤2中所述培养罐D中每IOOml培养基含有以下组份:小麦粉10-15g、淀粉酶0.002-0.Olg、酵母粉0.5-lg、碳酸钙0·1-0·5g、磷酸氢二钠0·01-0·03g、硫酸铵0·2-0·7g、消泡剂0·01-0·05g、L-苏氨酸0.01-0.1g、余量为水。6.根据权利要求1所述硫酸多粘菌素B的制备方法，其特征在于，所述步骤2中发酵罐培养过程中还包括补料过程，所述补料配方中每IOOrnl培养基含有以下组份：L-苏氨酸0.01-0.lg、硫酸铵0.1-0.5g、余量为水。7.根据权利要求1所述硫酸多粘菌素B的制备方法，其特征在于，所述步骤3中离子交换树脂为强酸阳离子树脂。8.根据权利要求7所述硫酸多粘菌素B的制备方法，其特征在于，所述强酸阳离子树脂为4-磺酰胺苯甲酰亚胺和4-磺酸基吡啶-3-磺酰胺改性732阳离子交换树脂。9.根据权利要求1所述硫酸多粘菌素B的制备方法，其特征在于，所述步骤3中大孔树脂包括D001、D113、D201、D301、D370、D152中一种。10.根据权利要求1所述硫酸多粘菌素B的制备方法，其特征在于，所述步骤（1中产多粘菌素B菌种为多粘类芽孢杆菌PaenibaciIlus0

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