申请/专利权人：东北农业大学

申请日：2017-04-05

公开（公告）日：2021-01-05

公开（公告）号：CN106892982B

主分类号：C07K19/00(20060101)

分类号：C07K19/00(20060101);C12N15/62(20060101);A61K39/395(20060101);A61K38/17(20060101);A61P29/00(20060101);A61P37/02(20060101);A61P19/02(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.01.05#授权;2017.07.21#实质审查的生效;2017.06.27#公开

摘要：本发明公开了一种靶向IL‑17和TNFα的新型融合多肽及其应用。本发明所提供的新型融合多肽是通过抗体的铰链区将抗人IL‑17的单链抗体与可溶性肿瘤坏死因子受体1相连接，并且在所述可溶性肿瘤坏死因子受体1的C端连接免疫球蛋白的Fc片段后得到的。本发明提供的融合多肽Anti‑IL‑17scFvsTNFR1‑Fc可有效地抑制胶原蛋白和多种前炎症因子的表达，有效地缓解类风湿关节炎的临床症状。本发明对于类风湿关节炎的治疗具有重大应用价值。

主权项：1.一种融合多肽，是通过抗体的铰链区将抗人IL-17的单链抗体与可溶性肿瘤坏死因子受体1相连接，并且在所述可溶性肿瘤坏死因子受体1的C端连接免疫球蛋白的Fc片段后得到的；所述免疫球蛋白的Fc片段为免疫球蛋白IgG4的Fc片段；所述抗人IL-17的单链抗体和所述抗体的铰链区为A片段；所述可溶性肿瘤坏死因子受体I为B片段；所述免疫球蛋白IgG4的Fc片段为C片段；所述A片段的氨基酸序列为序列表中序列1；所述B片段的氨基酸序列为序列表中序列3；所述C片段的氨基酸序列为序列表中序列5。

全文数据：靶向IL-17和TNFci的新型融合多肽及其应用技术领域[0001]本发明属于生物医药领域，涉及一种靶向IL-17和TNFa的新型融合多肽及其应用，尤其涉及一种具有同时抵抗白细胞介素-17和肿瘤坏死因子a活性的基因工程双特异性多靶点融合多肽与免疫球蛋白Fc片段融合的新型融合多肽。背景技术[0002]IL-17是一种强大的前炎症细胞因子，也是炎症反应的微调因子（Fine—tuningcytokine。IL-17可刺激角质细胞、成纤维细胞、上皮细胞及内皮细胞释放IL—6、IL—8、前列腺素E2PGE2、金属蛋白酶-1MMP-1、粒细胞集落刺激因子g—csf和单核细胞化学趋化蛋白（MCP-1等细胞因子。目前认为IL-17促进类风湿关节炎RA中骨破坏机制可能包括：诱导TNFa和IL-1的产生，使关节的破坏作用增强;增加核刺激因子受体和核刺激因子受体的数量，破坏骨保护蛋白与两者的平衡而加重骨破坏；IL-17还直接作用于破骨细胞，刺激破骨细胞的分化与活化。[0003]IL-17具有强大的招募中性粒细胞的作用。IL-17与成纤维细胞共培养时，成纤维细胞可以持续促进CD34+造血干细胞的增殖并向中性粒细胞分化；il-6、IL-17、MIP-2的抗体均有抑制中性粒细胞在气道聚集的作用。说明IL-17是T细胞依赖性炎症反应的早期启动子，也在联系造血系统细胞因子网络和免疫系统中起到重要作用。[0004]TNFa是一种主要由激活的巨噬细胞产生的细胞因子，是一种重要的生物活性因子，TNFa除具有较强的肿瘤杀伤活性外，还具有广泛的生物学活性，它能够激活巨噬细胞和多形核细胞，诱导多种细胞因子的产生并协同作用，参与免疫调节，促进组织相容性复合物的表达，增强机体的抗感染能力，参与骨组织的吸收和重塑等。然而，过多TNFa的产生和释放则会破坏机体的免疫平衡，引起严重的炎症反应，并可导致发热、休克、多器官功能衰竭甚至死亡。[0005]TNFa主要通过与细胞膜上的特异性受体TNFR结合发挥生物学活性，TNFR有TNFR1和TNFR2两种，均能与TNFa和TNF0相结合，但所介导的生物学功能不尽相同。在体内，有一部分TNF膜受体胞外区从细胞膜上解离下来，游离在血液中，成为可溶性TNF受体sTNFR。sTNFR不介导信号的传导，但仍能与TNFa结合，中和TNFa的活性，在体内、体外抑制TNFa诱导的细胞毒性和自身免疫反应，是TNFa的天然拮抗剂。[0006]Fc片段作为抗体的一部分可以起到增强抗体半衰期，呈递抗原，介导ADCC与CDC的作用。除此之外，可以增加Fc融合片段可以优化融合蛋白的纯化工艺。目前已上市的抗体与融合蛋白大多根据自己药物的不同需求选择不同类型的免疫球蛋白的Fc片段。[0007]CH0始终是抗体药物表达的主流载体，占到所有已上市抗体药物的一半，通过实验我们也发现，该融合蛋白，相对于原核表达载体，CH0表达载体表达出来的蛋白在活性以及稳定性上均优于原核表达载体。[0008]作为自身免疫疾病的两个重要的靶点，目前国外药品市场中TNFa与IL-17的拮抗剂、抑制剂炙手可热。在2〇16年最畅销药物前5名中有三位是TNFa的抑制剂，与此同时，IL-17抗体的研制在2〇16年也达到了新的高度，多家制药巨头公司着力于研究IL-17的拮抗剂来治疗自身免疫疾病。发明内容[0009]本发明的目的是提供一种靶向IL-17和TNFa的新型融合多肽及其应用。[0010]本发明所提供的融合多肽，具体是通过抗体的较链区将抗人IL-17的单链抗体与可溶性肿瘤坏死因子受体1相连接，并且在所述可溶性肿瘤坏死因子受体1的C端连接免疫球蛋白的Fc片段较链区+CH2+CH3后得到的。[0011]具体而言，所述融合多肽由A片段，B片段和C片段组成；[0012]所述A片段自上游至下游依次由抗人IL-17抗体的重链可变区（VH、连接肽（GSlinker、抗人IL-17抗体的轻链可变区（VL、位于CH1和CH2间的抗体铰链区（hingeregion组成，其氨基酸序列为a或⑹：[0013]a序列表中序列1;[0014]b将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和或缺失和或添加且具有相同功能的由序列1衍生的序列；[0015]所述B片段为可溶性肿瘤坏死因子受体I，其氨基酸序列为c或d:[0016]c序列表中序列3;[0017]d将序列3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和或缺失和或添加且具有相同功能的由序列3衍生的序列。[0018]所述C片段为免疫球蛋白IgG4的Fc片段铰链区、CH2、CH3，其氨基酸序列为e或f[0019]e序列表中序列5;[0020]f将序列5的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和或缺失和或添加且具有相同功能的由序列5衍生的序列。[0021]在本发明中，所述融合多肽中的所述A片段、所述B片段和所述C片段顺次无缝连接。[0022]编码所述融合多肽的核酸分子也属于本发明的保护范围。[0023]所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA;所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。[0024]在本发明中，所述核酸分子具体为DNA组合物。所述DNA组合物由编码所述A片段的DNA分子甲、编码所述B片段的DNA分子乙，以及编码所述C片段的DNA分子丙组成。[0025]所述DNA分子甲具体为如下⑴或⑵或⑶的DNA分子：[0026]1序列表中序列2所示的DNA分子；[0027]⑵在严格条件下与⑴限定的DNA序列杂交且编码所述A片段的DNA分子；[0028]⑶与⑴或⑵限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码所述A片段的DNA分子；[0029]所述DNA分子乙具体为如下⑷或⑸或⑹的DNA分子：[0030]⑷序列表中序列4所示的DNA分子；[0031]⑸在严格条件下与⑷限定的DNA序列杂交且编码所述B片段的DNA分子；[0032]⑹与⑷或⑸限疋的DNA序列具有90%以上同源性且编码所述b片段的DNA分子；[0033]所述DNA分子丙具体为如下⑺或⑻或⑼的DNA分子：[0034]⑺序列表中序列6所示的DNA分子；[0035]⑻在严格条件下与⑺限定的DNA序列杂交且编码所述C片段的DNA分子；[0036]⑼与⑺或⑻限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码所述C片段的DNA分子。[0037]上述严格条件可为在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后用2XSSC、0•1%SDS和1XSSC、0•1%SDS各洗膜一次。[0038]含有所述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。[0039]所述融合多肽或所述核酸分子或所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围：[0040]1制备用于治疗和或预防自身免疫疾病的药物；[0041]⑵制备用于阻断IL-17和或TNFa引起的炎症通路的制剂。[0042]具有如下（1和2所示功能的产品也属于本发明的保护范围。所述产品的活性成分为所述融合多肽或所述核酸分子或所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；[0043]⑴治疗和或预防自身免疫疾病；[0044]⑵阻断IL-17和或TNFa引起的炎症通路。[0045]在本发明中，所述自身免疫疾病具体为类风湿关节炎。[0046]在本发明中，所述阻断IL-17和或TNFa引起的炎症通路具体体现为：降低IL-17和或TNFa引起的炎症因子的表达;所述IL-17和或TNFa引起的炎症因子有IL-6、IL-8、IL-1KMMP3等。[0047]所述产品具体可为药物。所述药物的疗效可体现为涉及阻断类风湿关节炎的炎症反应，缓解骨损伤。[0048]本发明还请求保护制备所述融合多肽的方法。[0049]制备所述融合多肽的方法，可包括如下步骤:将所述核酸分子导入CH0-K1SV细胞系进行真核表达，并利用其Fc部分利用ProteinA层析柱进行纯化，获得所述融合多肽。[0050]在本发明中，制备所述融合多肽的方法具体包括如下步骤：（1将序列表的序列2和序列4所示的双链DNA分子重叠PCR连接后，然后同样用重叠PCR的方法连接序列6连接，将连接好的片段插入到Peel2.4载体中；（2将（1中获得的真核表达载体转染到CH0-K1SV细胞系中进行培养；（3利用MSX加压筛选系统与流式筛选系统，筛选出能稳定表达所述融合多肽的细胞株；（4挑选出（3中表达量高的细胞株进行培养，并收集细胞上清；（5利用AKTA纯化系统以及ProteinA凝胶柱纯化细胞上清，得到所述融合多肽命名为Anti-IL-17SCFvSTNFRl-FC;⑹随后将所述融合多肽进行buffer置换处理，使其存在于磷酸盐中。[0051]本发明提供了一种以IL-17和TNFa为靶标并与免疫球蛋白Fc片段融合的新型双特异性多靶点多肽类药物Anti-IL-nscFvsTNFRl-Fc融合多肽），具有同时阻断两种细胞因子所引起的炎症反应的能力，由于该融合蛋白采用了CH0-K1SV细胞表达的真核表达方式，相比Anti_IL-17scFvsTNFRl需要变性复性获得蛋白的原核表达，Anti-IL-17scFvsTNFRl-Fc具有更好的结合抗原的能力而且Fc片段不仅增加了蛋白的半衰期，而且经过实验证明，免疫球蛋白的Fc片段还能使新型融合蛋白结构更稳定从而增强其生物活性，除此之外，还优化了该新型融合蛋白的纯化策略，使得产出的蛋白更纯，生物活性更好。[0052]本发明提供的融合多肽Anti-1L-17scFvsTNFR1-Fc可有效地抑制胶原蛋白和多种前炎因子的表达，有效地缓解类风湿关节炎的临床症状，可通过直接应用或优化改造弥补目前临床使用的单靶点抗体药物或融合蛋白的不足，或取代现有抗体药物或融合蛋白，成为新一代多靶点融合蛋白药物，来提高对类风湿关节炎的治疗效果，对于类风湿关节炎的治疗具有重大应用价值。附图说明[0053]图1为Anti-IL-17scFvSTNFRl-FC新型融合多肽的结构组成示意图。[0054]图2为Anti-IL-17SCFvSTNFRl-Fc新型融合多肽的SDS-PAGE图。[0055]图3为Anti-IL-17scFvsTNFRl-Fc新型融合多肽通过ELISA检测其结合抗原的结果，并与原核表达的Anti-IL-17scFvsTNFRl融合多肽结合抗原能力的比较结果。[0056]图4为Anti-IL-17scFvsTNFRl-Fc新型融合多肽阻断THP-1细胞中炎症通路的Real-timePCR结果。[0057]图5为Anti-IL-l7scFvsTNFRl-Fc新型融合多肽阻断RA-FLS细胞中炎症通路的Real-timePCR结果。[0058]图6为Anti-IL-17scFvsTNFRl-Fc新型融合多肽对小鼠RA模型CIA小鼠关节炎发病的影响的结果。[0059]图7为Anti-IL-lkcFvsTNFRl-Fc新型融合多肽对CIA模型小鼠血清中炎症因子蛋白表达量的影响ELISA。[0060]图8为Anti-IL-17scFvsTNFIU-Fc新型融合多肽对CIA模型小鼠脾脏中炎症因子mRNA表达量的影响Real-time-PCR。[0061]图9为Anti-IL-17SCFVSTNFIU-FC新型融合多肽对小鼠RA模型CIA小鼠关节炎发病的影响的结果。具体实施方式[0062]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。[0063]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。[0064]下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。[0065]依那西普sTNFRI-Fc:上海中信国健药业股份公司上海，12.51^支）。[0066]pKappa载体:BioVector质粒载体菌株细胞基因保藏中心。记载于“张雅坤，王文飞,何昆等•快速筛选高水平稳定表达成纤维细胞生长因子-21真核细胞株新方法的建立.中国生物化学与分子生物学报，2012，288:768-774”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用。[0067]peel2.4载体:L0NZA公司产品[0068]pIRES2-EGFP质粒:美国Clontech公司产品。[0069]CH0-K1SV细胞:美国菌种保藏中心ATCC产品。[0070]RA-FLS细胞类风湿病人关节滑膜细胞）：购买于广州医科大学附属第二医院。记载于“严姗姗•PRP对RA-FLS细胞迁移和侵袭的影响•扬州大学，2015，硕士论文”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用。[0071]THP-1细胞:美国菌种保藏中心ATCC产品。[0072]实施例1、融合多肽Anti-IL-17scFvsTNFRl-Fc的制备[0073]一、融合多肽Anti-IL-17scFvsTNFRl_Fc的结构描述[0074]本发明提供的针对hIL-17和hTNFa的融合多肽命名为IL-17scFvsTNFRI_Fc，由A片段和B片段以及C片段组成。A片段自上游至下游依次由抗人IL-17抗体的重链可变区VH、连接肽GSlinker、抗人IL-17抗体的轻链可变区VL、位于CH1和CH2间的抗体铰链区（hingeregion组成。A片段的氨基酸序列如序列表的序列1所示，其编码基因如序列表的序列2所示。B片段为可溶性肿瘤坏死因子受体KB片段的氨基酸序列如序列表的序列3所示，其编码基因如序列表的序列4所示。C片段为免疫球蛋白IgG4的Fc片段（铰链区、CH2、OBhC片段的氨基酸序列如序列表的序列5所示，其编码基因如序列表的序列6所示。[0075]Anti-IL-17SCFvsTNFRl-Fc融合多肽的结构组成见图1。图1中融合蛋白为二聚体形式经非还原SDS-PAGE检测），两个结构域不影响其各自的功能，结合方式如示意图。[0076]二、Anti-IL-17scFvsTNFRl-Fc融合多肽的制备及纯化[0077]1、将序列表的序列2通过引物K15’-GGATCCACTGGTCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGG-3’）和引物K25’-ACACTATCTCTCTTCTCCCTGGGTTTTGGGGGGAACAGGMGA-3’）进行扩增，序列4通过引物K35’-CTGTTCCCCCCAAAACCCAGGGAGAAGAGAGATAGTGTGTGTC-3’）和引物K45’-GCATGGGGGACCATAITTGGATAGGCACMCTTCGTGCACTCCAGG-3’）进行扩增，然后利用引物K1和K4将序列2和序列4连接；然后用引物K55’-GGAGTGCACGAAGTTGTGCCTATCCAAATATGGTCCCCCATGCCCA-3’）与引物K65，-GCTAGCTTATTTACCCAGAGACAGGGAGAGGCT-3’）扩增序列6，然后利用引物K1与K6将序列2和序列4的连接产物与序列6进行连接，而且在连接产物上游具有BamHI酶切位点，下游具有Nhel酶切位点。然后将连接后产物与pKappa载体同时用BamHI和Nhel进行酶切，酶切后，通过相同酶切位点的粘性末端将连接后产物构建到pKappa载体上，得到重组质粒。然后通过基因工程技术，利用HindIII和Nhel进行双酶切，回收含有该重组质粒中Kappaleader信号肽的Anti-IL-17scFvsTNFRl-Fc片段，利用Nhel和EcoRI双酶切pIRES2-EGFP质粒，得到具有Nhel和EcoRI粘性末端的IRES-EGFP片段，然后用HindIII与EcoRI双酶切Peel2.4载体，最后通过相应的限制性内切酶将并将Kappaleader-Anti-IL_17scFvsTNFRl-Fc片段和IRES-EGFP片段与Peel2.4载体连接，获得重组质粒。将经测序验证正确的重组质粒命名为Pee-anti-IL-17TNF-EGFP。该重组质粒能够同时分别表达新型融合蛋白（Anti-IL-17scFvsTNFRl-Fc和EGFP。[0078]2、然后将步骤1构建好的重组质粒pee-anti-IL-17TNF-EGFP利用脂质体2000InVitr〇gen，USA转染到CH0-K1SV细胞中，在MSX加压培养一段时间后，存活的细胞通过流式细胞仪3轮筛选，可筛选出稳定表达新型融合蛋白（Anti-IL_17scFvsTNFRl-Fc和EGFP的细胞株，然后将细胞株收集，继续进行培养。[0079]3、将2中细胞株进行常规培养，当筛选后培养的细胞密度达到80%时，将MSX培养基换成CDOptiCHO™AGT™GIBC0，USA培养基，在此培养基中培养3天，收集无血清的培养基上清液。[0080]4、将3中细胞上清液通过Protein-A层析柱利用AKTA蛋白纯化伩进行纯化。Protein-A层析柱用平衡液进行平衡20mMNa3P〇4，150mMNaCl，pH7.0，将细胞上清上样后，用洗脱液进行洗脱（20mMNa-Citrate，pH3.0，收集洗脱峰得到的蛋白将其置换至PH7.0的磷酸盐缓冲液中。[0081]5、用生理盐水调整Anti-IL-17scFvsTNFRl-Fc融合多肽的浓度融合多肽的浓度以蛋白质的浓度计）。[0082]图2为SDS-PAGE图，其中点样顺序依次为细胞上清泳道1，纯化流穿（泳道2，纯化后融合多肽泳道3，箭头处为目标蛋白。[0083]实施例2、Anti-IL-17scFvsTNFRl-Fc融合多肽的生物学功能鉴定和阻断活性检测[0084]一、Anti-IL-17scFvsTNFRl-Fc融合多肽同时结合抗原的能力[0085]用lnmol过量）的人源IL-17与lnmol过量人源TNFa包被96孔板（用0.謂恥：〇3-NaHC〇3，pH9.6稀#，4°C过夜；随后用PBSTPBS+0.05%Tween-20洗涤，脱脂奶粉PBS封闭；用100UL的不同浓度的新型融合多肽Anti-IL-17scFvsTNFRl-Fc100pmolmL，10pmolmL，1pmolmL，0•lpmolmL以及BSA阴性对照在37°C孵育1小时;PBST洗涤，随后用100uL羊抗人二抗RD公司产品，其产品目录号为G-102-C孵育1个小时（1:7500稀释）；PBST洗涤，加入显色液反应15分钟，随后加入终止反应液H2S04，用酶标仪在450nm波长下进行读数。[0086]同样方法，检测原核表达的融合蛋白Anti-IL_17scFvsTNFRl，进行抗原结合能力的比较。其中，原核表达的融合蛋白Anti-IL-17sCFVsTNFRl是利用大肠杆菌进行表达的，其氨基酸序列与Anti-IL-17scFVSTNFRl-Fc融合多肽相比缺少序列5所示的IgG4的Fc片段。[0087]结果如图3将Anti-IL-l7scFvsTNFRl组与Anti-IL-17scFvsTNFRl-Fc融合多肽相比，差异显者表不为叶〈0.05，*叶0.01。结果表明，该新型融合多妝八111:1-11^-173〇卩¥sTNFRl-Fc添加的免疫球蛋白Fc片段可以有效增加其结合能力。[0088]二、Anti-IL-17scFvsTNFRl-Fc融合多肽能阻断RA-FLS与THP-1细胞中IL-17与TNFa引起的炎症通路[0089]将RA-FLS细胞类风湿病人关节滑膜细胞）、THP-1细胞接种于6孔板中；当RA-FLS密度达到2X104个细胞每孔，THP-1细胞达到1X1〇6个细胞每孔时，用“il-1720ugmL+TNFa20ugmL”或“IL-1720ugmL+TNFa20iigmL+Anti-IL-17scFvsTNFRl_Fc200ligmL融合多肽”进行孵育24小时。孵育之后，提取细胞总RNA，反转录成cDNA并通过realtime-PCR检测相关炎症通路的因子（IL-6、IL-8和IL-1®的mRNA表达水平的变化。[0090]其中，用于检测IL-6的弓丨物为5’-ACTCACCTCTTCAGAACGAATTG-3，和5’_CCATCTTTGGMGGTTCAGGTTG-3’；用于检测IL-S的引物为S’-TTTTGCCMGGAGTGCTAAAGA_3，和5-MCCCTCTGCACCCAGTTTTC-3’；用于检测IL-1P的引物为5’-ATGATGGCTTATTACAGTGGCAA-3’和5’-61'〇66八6八1'1'〇6丁八6：丁06八-3，。内参为31。1：111，检测引物为5，-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’和5，-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3，。、[0091]实验同时设置未经处理的RA-FLS细胞、THP-1细胞细胞作为对照c〇ntr〇1。[0092]实验同时设置以等量依那西普替代Anti-IL-17scFVsTNFRl-Fc融合多肽的阳性对照。[0093]实验同时设置以等量原核表达的融合蛋白Anti-IL-17scFvsTNFRl替代Anti-IL-17scFVSTNFRl-Fc融合多肽的对照。其中，原核表达的融合蛋白Anti-IL-17scFvsTNFRl是利用大肠杆菌进行表达的，其氨基酸序列与Anti-IL-17scFvsTNFRl-Fc融合多肽相比缺少序列5所示的IgG4的Fc片段。[0094]图4为Anti-IL-nscFvsTNFRl-Fc新型融合多肽阻断THP-1细胞中炎症通路的Real-timePCR结果。图5为Anti-IL-17scFvsTNFRl-Fc新型融合多肽阻断RA-FLS细胞中炎症通路的Real-timePCR结果。图4和图5中，融合蛋白表示Anti-IL-17scFVSTNFRl，新型融合蛋白表不六111：：[-11^-1780?¥31即1?1-?：，£七31161^口1：为依那西普。图中，*代表与“11^-17+TNFa”组相比p〈0.05;林代表与“IL-17+TNFa”组相比p0.01;#代表与“IL_17+TNFa+£七31^1^6口1：”组相比口0.05;##代表与“11-17+1呢1+£七31161^6口1：”组相比口0.01。[0095]由图可见，Anti-IL-17scFvsTNFRl-Fc融合多肽、Anti-IL-17scFvsTNFRl融合多肽以及作为阳性对照的依那西普均能够阻断RA-FLS细胞和THP-1细胞中的炎症通路，其中以Anti-IL-17scFvsTNFRl-Fc融合多肽效果最佳，效果显著好于Anti-IL-17scFvsTNFRl融合多肽和依那西普。[0096]实施例3、Anti-IL-17scFvsTNFRl-Fc融合多肽的应用[0097]CII，即鸡2型胶原：sigma公司，货号为9007-43-5。[0098]本实施例中所采用的小鼠为6-8周龄的SPF级雄性C57BL6鼠：来自长春亿斯公司动物合格证号:SCXK京2012-0001。[0099]将CII溶于0.lmolL醋酸水溶液4°C下搅拌使之充分溶解），得到CII浓度为2gL的CII溶液，4°C放置12小时后与弗氏完全佐剂等体积混合、乳化，得到ClI乳剂ClI乳剂中CII浓度为lgL。[0100]一、建立小鼠类风湿关节炎RA模型并分组给药[0101]由于建立模型与分组给药为连续操作，从建立模型开始计实验天数。[0102]1、建立小鼠RA模型[0103]实验第1天，通过尾根部皮内多点注射的方式用CII乳剂免疫小鼠（每只小鼠免疫O.lmLCII乳剂，目的为致炎）；实验第21天，通过尾根部皮内多点注射的方式用CII乳剂免疫小鼠（每只小鼠免疫O.lmLCII乳剂）；第二次免疫后第〇_56天，观察小鼠并对小鼠的关节肿胀情况评分，对小鼠每个足的评分标准如下:〇分:无红肿；1分:小趾关节红肿;2分:趾关节和足趾肿胀;3分:踝关节以下的足爪肿;4分:包括踝关节在内的全部足爪肿胀。将小鼠四肢的评分相加，即为该小鼠的总分。[0104]2、从实验第21天开始，将模型小鼠分为6组每组8只），分别进行如下处理：[0105]Anti-IL-17scFvsTNFRl-Fc融合多肽组:每2天通过腹腔注射的方式给予一次融合多肽每次每千克小鼠给予3mgAnti-IL_17scFVsTNFRl-Fc融合多肽，每次每只小鼠的给药体积为100微升）；[0106]Anti-IL_l7scFvsTNFRl融合多肽组:每2天通过腹腔注射的方式给予一次融合多肽每次每千克小鼠给予3mgAnti-IL-17scFvsTNFRl融合多肽，每次每只小鼠的给药体积为100微升）；其中，Anti-IL-UscFvsTNFRl融合多肽是利用大肠杆菌进行表达的，其氨基酸序列与Anti-IL-17scFvsTNFRl-Fc融合多肽相比缺少序列5所示的IgG4的Fc片段。[0107]依那西普组Etanercept:每2天通过腹腔注射的方式给予一次依那西普每次每千克小鼠给予3mg依那西普，每次每只小鼠的给药体积为1〇〇微升）；[0108]CIA模型组PBS:每2天给予一次PBS侮次每只小鼠的给药佯枳方僦巧；[0109]同时设置正常组空白），由10只6-8周龄的SPF级雄性昆明鼠组成，不进行任何处理。[0110]二、Anti-IL-17scFvsTNFRl-Fc融合多肽对小鼠RA发病的影响[0111]从实验第21天开始，每4天对小鼠的关节肿胀情况评分一次。结果见图6*代表与CIA模型组相比p0•05;**代表与CIA模型组相比p〇•01;#代表与新型融合蛋白组相比P0.05;##代表与新型融合蛋白组相比P〇•〇1。结果表明，Anti-IL-17scFVSTNFIU-Fc融合多肽对小鼠的多发性关节炎表征具有明显地抑制作用，效果优于同剂量依那西普。[0112]三、Anti-IL-17scFvsTNFRl-Fc融合多肽对RA小鼠血清中炎症因子表达量的影响[0113]实验第77天，通过眼球取血，取血清，根据比-17、了肥1、比-6、0^的£1134试剂盒RD，USA操作步骤检测不同组别小鼠血清中IL-17、TNFa、IL-6、CCP的表达变化量。具体操作按照试剂盒说明书进行。[0114]图7为Anti-IL-17scFvsTNFRl-Fc新型融合多肽对CIA模型小鼠血清中炎症因子蛋白表达量的影响ELISA。图中，融合蛋白表示Anti-IL-17scFvsTNFRl，新型融合蛋白表示Anti-IL-l7scFvsTNFRl-Fc，Etanercept为依那西普。图中，*代表与CIA模型组相比p0.05;林代表与：1六模型组相比？0_01;#代表与£1116代叩1组相比？0.05;##代表与Etanercept组相比p0•01〇[0115]由图可见，Anti-IL-l7scFvsTNFRl-Fc融合多肽、Anti-IL_17scFvsTNFRl融合多肽以及作为阳性对照的依那西普均能够显著降低CIA小鼠血清中炎症因子的水平，一定程度上阻断炎症反应。其中以Anti-IL-l7scFvsTNFRl-Fc融合多肽效果最佳，特别是对儿-17、TNFa、IL-6这三者的效果显著好于依那西普。[0116]四、Anti-IL-17scFvsTNFRl_Fc融合多肽对RA小鼠体内细胞因子表达水平的影响[0117]二次免疫后56天，取小鼠脾脏，提取总RNA并反转录为cdNA，将cDNA作为模板，通过RealtimePCR采用P-actin基因作为内参检测各个细胞因子的相对表达量。[0118]用于鉴定IL-1郎勺相对表达量的引物如下：[0119]上游引物:57-CCATGGCACATTCTGTTCAAA-37;[0120]下游引物:5-GCCCATCAGAGGCAAGGA-37。[0121]用于鉴定IL-6的相对表达量的引物如下：[0122]上游引物:57-ACAACCACGGCCTTCCCTACTT-3';[0123]下游引物：5-CACGATTTCCCAGAGMCATGTG-3'。[0124]用于鉴定IL-17的相对表达量的引物如下：[0125]上游引物:5-GGACTCTCCACCGCMTGA-3';[0126]下游引物:5-GACCAGGATCTCTTGCTGGA-3'。[0127]用于鉴定TNF-a的相对表达量的引物如下：[0128]上游引物:5-GGAMCCCAGAGGCATTGAC-3';[0129]下游引物:5-TCAGGATCTGGCCCTTGAAC-3，。[0130]用于鉴定0-actin内参基因的相对表达量的引物如下.[0131]上游引物:5-GAGACCTTCAACCCC-37;•[0132]下游引物:5-GTGGTGGTGAAGCTGTAGCC-3'。[0133]结果见图8,可见，与CIA模型PBS治疗组相比，Anti-IL-17scFvsTNFR1-Fc新型融合多肽组、Anti-IL-17scFvsTNFRl融合多肽组与依那西普组小鼠脾脏中的IL-llIL-6、IL-17和TNFa的mRNA表达水平均显著降低，Anti-IL-17scFvsTNFRl_Fc新型融合多肽组的降低最大，即Anti-IL-17SCFVsTNFRl-Fc新型融合多肽的治疗效果优于融合多肽Anti-IL-17scFvsTNFRl以及依那西普，达到差异显著。结果为各组小鼠的平均值;料代表与CIA模型组相比p0.01;#代表与依那西普组相比P〇.〇5。[0134]五、小鼠组织切片观测[0135]正常组小鼠在试验期间四肢的各关节无红肿现象，行动灵活自如。模型组小鼠在二次免疫后，出现足跖部皮肤充血，足垫升高；随后后足踝、趾关节肿胀明显，足趾呈鼓棰状。将小鼠处死后，取小鼠趾关节进行组织切片和HE染色，发现融合多肽Anti-IL-17scFvsTNFRl，新型融合多肽Anti-IL-17scFvsTNFRl-Fc及依那西普（Etanercept治疗组，典型关节炎症状减轻;而且发现Anti-IL-WscFvsTNFRl-Fc新型融合多肽治疗效果较相同剂量的融合多肽Anti-IL-17scFvSTNFRl和依那西普治疗效果明显。结果见图9,该融合多肽Anti-IL-17scFvsTNFRl-Fc对小鼠类风湿关节炎有显著的治疗作用。

权利要求：1.一种融合多肽，是通过抗体的铰链区将抗人IL-17的单链抗体与可溶性肿瘤坏死因子受体1相连接，并且在所述可溶性肿瘤坏死因子受体1的C端连接免疫球蛋白的Fc片段后得到的。2.根据权利要求1所述的融合多肽，其特征在于:所述融合多肽由A片段，B片段和C片段组成；所述A片段的氨基酸序列为a或⑹：a序列表中序列1;b将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和或缺失和或添加且具有相同功能的由序列1衍生的序列；所述B片段的氨基酸序列为c或d:c序列表中序列3;d将序列3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和或缺失和或添加且具有相同功能的由序列3衍生的序列。所述C片段的氨基酸序列为e或fe序列表中序列5;f将序列5的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和或缺失和或添加且具有相同功能的由序列5衍生的序列。3.编码权利要求1或2所述融合多肽的核酸分子。4.根据权利要求3所述的核酸分子，其特征在于:所述核酸分子为DNA组合物;所述DNA组合物由编码权利要求2中的所述A片段的DNA分子甲、编码权利要求2中的所述B片段的DNA分子乙，以及编码权利要求2中所述C片段的DNA分子丙组成。5.根据权利要求4所述的核酸分子，其特征在于：所述DNA分子甲为如下⑴或⑵或⑶的DNA分子：1序列表中序列2所示的DNA分子；⑵在严格条件下与⑴限定的DNA序列杂交且编码所述A片段的DNA分子；⑶与⑴或⑵限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码所述A片段的DNA分子；所述DNA分子乙为如下⑷或5或⑹的DNA分子：⑷序列表中序列4所示的DNA分子；⑸在严格条件下与⑷限定的DNA序列杂交且编码所述B片段的DNA分子；⑹与⑷或⑸限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码所述B片段的DNA分子；所述DNA分子丙为如下⑺或⑻或⑼的DNA分子：⑺序列表中序列6所示的DNA分子；⑻在严格条件下与⑺限定的DNA序列杂交且编码所述C片段的DNA分子；⑼与⑺或⑻限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码所述C片段的DNA分子。6.含有权利要求3-5中任一所述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。7.权利要求1或2所述的融合多肽或权利要求3-5中任一所述的核酸分子或权利要求6所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在如下任一中的应用：1制备用于治疗和或预防自身免疫疾病的药物；⑵制备用于阻断IL-17和或TNFa引起的炎症通路的制剂。8.具有如下（1和2所示功能的产品，其活性成分为权利要求1或2所述的融合多肽或权利要求3-5中任一所述的核酸分子或权利要求6所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；1治疗和或预防自身免疫疾病；⑵阻断IL-17和或TNFa引起的炎症通路。9.根据权利要求7所述的应用或权利要求8所述的产品，其特征在于:所述自身免疫疾病为类风湿关节炎。10.制备权利要求1或2所述融合多肽的方法，包括如下步骤:将权利要求3_5中任_所述的核酸分子导入CHO-K1SV细胞进行真核表达，获得所述融合多肽。’

百度查询： 东北农业大学 靶向IL-17和TNFα的新型融合多肽及其应用

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