申请/专利权人：四川大学华西医院

申请日：2020-09-21

公开（公告）日：2021-02-02

公开（公告）号：CN112300984A

主分类号：C12N5/0775(20100101)

分类号：C12N5/0775(20100101)

优先权：

专利状态码：失效-发明专利申请公布后的视为撤回

法律状态：2023.03.24#发明专利申请公布后的视为撤回;2021.02.23#实质审查的生效;2021.02.02#公开

摘要：本发明公开了一种医用hUC‑MSCs‑MVs批量制备流程及质控，包括HUC‑MSCs‑MVs原料及质控、HUC‑MSCs‑MVs制备（流程）及质控、HUC‑MSCs‑MVs存储和运输及质控和一套完整的批量制备及质控流程；本发明能够快速有效的医用批量培养制备hUC‑MSCs‑MVs，且制备效果好，且能够更精准的对hUC‑MSCs‑MVs进行质量把控检测，实用性高，制备流程完善，便于运用批量生产。

主权项：1.一种医用hUC-MSCs-MVs批量制备流程及质控，其特征在于，包括HUC-MSCs-MVs原料及质控、HUC-MSCs-MVs制备（流程）及质控和HUC-MSCs-MVs存储和运输及质控，所述HUC-MSCs-MVs原料及质控步骤为：1.自愿捐赠，以自愿的原则，按照国家伦理委员会相关规定，遵守相关法律的前提下，在捐赠者知情同意的情况下，自愿捐赠脐带；2.产前母体检查，梅毒螺旋体、艾滋病病毒HIV、巨细胞病毒CMV、乙型肝炎病毒HBV、丙型肝炎病毒HCV等病原体检测；3.产前母胎儿检查，排除胎儿及胎盘疾病，如：胎儿无先天畸形，无遗传病等；4.脐带细胞排查，对脐带来源的干细胞进行基因验证测序，排除重大疾病因素；检验干细胞活性；检测细胞有核细胞比例；细菌、霉菌、衣原体等培养阴性等；5.备用，完善上述检测后，入库冻存备用；所述HUC-MSCs-MVs制备（流程）及质控步骤为：S1、医院捐赠脐带来源，脐带来源进行上述质控检测合格后，在液氮中冻存备用；S2、将S1步骤中干细胞复苏增殖至80%以上汇合时，进行细胞传代，步骤如下：提前将所需PBS、培养基、胰蛋白酶复温；在超净台中，弃去培养瓶中的细胞上清液，加入5mlPBS，轻轻摇晃，后倒掉，重复3遍；每孔加入1ml0.25%胰蛋白酶，轻轻摇晃使胰酶充分淹没底部细胞，立即放入37℃恒温箱消化3min；3min后取出培养瓶，于光学显微镜下观察细胞是否变圆浮起，可轻轻震荡培养瓶，使大部分细胞在镜下呈漂浮游动状态；迅速于超净台中加入5ml完全培养基终止消化，并将转移至15ml离心管，用PBS冲洗1次瓶内剩余细胞，一同转入离心管中，800rpm离心5min；弃上清，用6ml培养基重悬，轻轻吹打混匀细胞，向已提前加入8ml培养基的3个新培养瓶中各加入2ml细胞混悬液，轻轻摇晃使细胞分布均匀，于光学显微镜下观察确认后，放入37℃CO2培养箱中培养；S3、提前将所需PBS、培养基拿出复温；待第5代UC-MSCS增殖至80%以上融合时，弃去细胞上清，加入5mlPBS，冲洗3遍；吸尽瓶中残留的PBS，用不加血清血清培养基，于37℃CO2培养箱中饥饿培养48小时，诱导HMSCS释放MVS；使用梯度离心法提取MVs：hMSCs饥饿培养48小时后，置于无菌操作台中，用电动移液枪吹打细胞表面数次后，收集细胞上清液至50ml离心管中，弃去细胞；4℃400g离心10min后，再4℃2000g离心20min；仔细的将上清液转移到一个新的50ml离心管中，弃去沉淀；此为细胞碎片；将收集的上清液，转移到超高速离心机专用离心管中；将离心管置于超高速离心机中，用电子秤严格配平，4℃50000g离心2小时，弃去上清，将多瓶离心管中的沉淀用PBS洗涤并转移到一个离心管中，用PBS将离心管中的液体补至标准线处，电子秤严格配平，4℃50000g离心2小时，弃去上清，用1mlPBS重悬沉淀，即得提取的MVs，将MVs转移至无菌EP管中，BCA蛋白定量后于-80度保存备用；S4、质控：所述HUC-MSCS培养扩增至第5代后，按照MSC国际标准，检测hUC-MSCs的干性，检测如下：一、贴壁细胞；二、具有关键表面标志分子；三、多系分化能力，可在体外分化成成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、肌细胞和其它结缔组织；BCA蛋白定量鉴定步骤为：1、稀释样品：取30μl待测微粒样本，用超纯水稀释，取原液10μl、12原液10μl、14原液10μl；2、制备蛋白标准品：分别配制6个浓度的蛋白标准品（0、0.05、0.1、0.25、0.4、1μgμl）；3、制备BCA工作液：BCA反应液与4%硫酸铜按50:1比例配制成工作液；4、上样：先在96孔板中加入100μlBCA工作液，然后在各孔中加入10μl不同浓度的蛋白标准品和待测样本;5、孵育：37℃孵箱孵育45分钟；6、计算蛋白浓度：酶标仪检测各孔在562nm处的OD值，根据标曲线浓度来计算样本浓度；流式细胞术鉴定hMSC-MVs步骤为：（1）从-80度冰箱中取出装有微粒的EP管，置于室温待其完全融化，分别取300ul纳米粒子计数为2×1011个的微粒分装到EP管中；（2）标记6管流式管，每管加入50μl细胞悬液；每管中加入Annexin-Ⅴ-BV4212ul避光孵育10min；再按以下方案在各流式管中加入流式抗体：第1管：CD90-FITC5μl；第2管：CD105-PerCP-Cy5.55μl；第3管：CD73-APC5μl；第4管：空白对照管5μl；第5管：hMSCPositiveIsotypeControlCocktail120μl及PEhMSCNegativeIsotypeControlCocktail20μl；第6管：hMSCPositiveCocktail20μl及PEhMSCNegativeCocktail20μl；（3）轻柔拍打流式管混匀抗体，室温下避光孵育30min；（4）没管中加入PBS150μl使总体积达200μl；（5）加入10.0μl1.33μm的标准定量微球，上机检测；微生物检测：在自动化过程中，选择样本进行微生物检测筛查，确保产品不含细菌、病毒等有害成分；S5、遵循以下流程：完善母体和胎儿检测—签订自愿捐赠协议—12小时内收集脐带干细胞—对脐带干细胞进行干性、活性、菌体检测—确定安全后采用饥饿方法获得含有MVs的上清—使用梯度离心法获取高含量的MVs—对获得的MVs进行流式、蛋白、粒径、电镜、菌体检测—安全后选用硅化容器保存在-80°以下环境3-6月—使用时迅速融化后用PBS重悬—注射前对其进行形态观测—注射后密切观测患者；所述HUC-MSCS-MVS存储和运输及质控步骤为：在上述步骤生产后，选择合适的容器，可以保证其有效性；国际血栓和止血会（internationalSocietyonThrombosisandHemostasis,ISTH）推荐使用柠檬酸钠盐为载体，使用硅化容器储存和运输，选用PBS重悬和稀释，尽量保存在-80°以下的温度，避免反复冻融；融化后应在24小时内使用，24小时的温度不高于4°；储存时间在3-6个月，使用时应该进行电镜观察。

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