申请/专利权人：中国农业科学院草原研究所

申请日：2017-04-20

公开（公告）日：2021-04-09

公开（公告）号：CN107022518B

主分类号：C12N5/04(20060101)

分类号：C12N5/04(20060101);A01H4/00(20060101);A01H1/02(20060101)

优先权：

专利状态码：失效-未缴年费专利权终止

法律状态：2023.03.28#未缴年费专利权终止;2017.09.01#实质审查的生效;2017.08.08#公开

摘要：本发明提供了一种胚培养基和胚培养方法以及胚培养方法的应用，涉及植物工程的技术领域。本发明提供的胚培养基通过不断的尝试和改良而确定，本发明提供的胚培养基结合本发明提供的胚培养方法，能够有效提高胚的成熟率，尤其是能够提高高加索三叶草与白三叶杂交F1代杂交胚的成熟率，有利于高加索三叶草与白三叶的远缘杂交育种。

主权项：1.一种胚培养基，其特征在于，所述胚培养基由如下组分组成：KCl，终浓度为65mgL；KNO3，终浓度为80mgL；CaNO3·4H2O，终浓度为300mgL；MgSO4·7H2O，终浓度为720mgL；NaH2PO4·H2O，终浓度为16.5mgL；Na2SO4，终浓度为200mgL；ZnSO4·7H2O，终浓度为3mgL；KI，终浓度为0.83mgL；H3BO3，终浓度为1.5mgL；Na2MoO4·2H2O，终浓度为0.25mgL；CoCl2·6H2O，终浓度为0.025mgL；CuSO4·5H2O，终浓度为0.025mgL；肌醇，终浓度为100mgL；VB5，终浓度为5mgL；VB1，终浓度为1mgL；VB6，终浓度为1mgL；CH，终浓度为2.5mgL；泛酸钙，终浓度为0.1mgL；FeSO4·7H2O，终浓度为27.85mgL以及Na2EDTA·2H2O，终浓度为37.25mgL。

全文数据：胚培养基和胚培养方法以及胚培养方法的应用技术领域[0001]本发明涉及植物工程技术领域，尤其是涉及一种胚培养基和胚培养方法以及胚培养方法的应用。背景技术[0002]胚，是由受精卵发育而成的新一代植物体的雏型，是种子重要的组成部分。由胚发育最终形成幼苗的过程，是得到新一代植株非常重要的一个过程。然而对于某些植物，胚的成熟率极低，很难发育成幼苗。因此，在这种情况下，就需要人为进行胚的离体培养，以提高胚的成熟率。目前常用的胚离体培养基，大多含有激素，对于植株的正常发育会产生一定的影响。因此，找到合适的胚离体培养基以提高胚的成熟率，具有重要的指导意义。[0003]除了胚自然成熟率低现象的存在，在植物远缘杂交育种中，最常面临的问题就是杂种胚败育，其成熟率很低或难以发育成幼苗，导致最终不能获得杂交种。以三叶草属牧草为例，三叶草属牧草具有品质优良、营养丰富、固氮能力强等多种优点，尤以具有强抗逆性的六倍体高加索三叶草品种，和具有强固氮能力的四倍体大兴安岭野生白三叶为例，为了培育出结合双亲优良性状的三叶草新品种，以高加索三叶草为母本、白三叶为父本进行远缘杂交，但人工杂交后，其内代杂交胚的成熟率极低，很难得到成熟幼苗。因此，通过培养基的改良以提高高加索三叶草与白三叶杂交F1代杂交胚的成熟率，获得杂种F1代植株，具有重要的意义。[0004]因此，特提出本发明。发明内容[0005]本发明的第一个目的在于提供一种胚离体培养基，本发明的第二个目的在于提供一种胚培养方法，本发明的第三个目的在于提供所述胚培养方法的应用，以缓解现有技术中存在的胚成熟率低的技术问题。[0006]本发明提供的一种胚培养基，所述胚培养基包括:KCl，终浓度为58.5-71.5mgmL;KNO3，终浓度为72-88mgmL;CaNO3·4H2〇，终浓度为270-330mgmL;MgSO4·7H2〇，终浓度为648-792mgmL;NaH2PO4·H2O，终浓度为14·85-18·15mgmL;Na2SO4，终浓度为180-220mgmL;ZnSO4·7H2〇，终浓度为2·7-3·3mgmL;KI，终浓度为0·747-0·913mgmL;H3BO3，终浓度为1.35-1.65mgmL;Na2MoO4·2H2〇,终浓度为0.225-0.275mgmL;CoCl2·6H2O,终浓度为0·0225-0·0275mgmL;CuSO4·5H2〇，终浓度为0·0225-0·0275mgmL;肌醇，终浓度为90-11OmgmL;VB5，终浓度为4·5-5·5mgmL;VBl，终浓度为0·9-1·lmgmL;VB6，终浓度为0.9_1·lmgmL;CH，终浓度为2·25-2·75mgmL;泛酸钙，终浓度为0·09-0·IlmgmL;FeSO4·7H2〇，终浓度为25·065-30·635mgmL以及Na2EDTA·2H2O,终浓度为33·525-40·975mgmL。[0007]进一步的，所述胚培养基包括：KCl，终浓度为62-68mgmL;KNO3，终浓度为76_84mgmL;CaNO3·4H2〇,终浓度为285-315mgmL;MgSO4·7H2〇,终浓度为684-756mgmL;NaH2PO4·H2O,终浓度为15.675-24.75mgmL;Na2S〇4,终浓度为19〇-210mgmL;ZnS〇4·7H2〇，终浓度为2·85-3·15mgmL;KI，终浓度为O·7885-0·8715mgmL;H3BO3，终浓度为1.425_1.575mgmL;Na2Mo〇4·2H20,终浓度为0.2375-0.2625mgmL;CoCl2·6H20,终浓度为0.0238-0·0263mgmL;CuS〇4·5H20，终浓度为0·0238-0·0263mgmL;肌醇，终浓度为95-105mgmL;VB5，终浓度为4·75-5·25mgmL;VBl，终浓度为0·95-1·05mgmL;VB6，终浓度为0.95_1·05mgmL;CH，终浓度为2·375-2·625mgmL;泛酸钙，终浓度为0·09-0·105mgmL;FeS〇4·7H20，终浓度为26·4575-29·2425mgmL以及Na2EDTA·2H20，终浓度为35·3875-39·1125mgmL〇[0008]进一步的，所述胚培养基包括:KCl，终浓度为65mgmL;KNO3，终浓度为80mgmL;CaNO3·4H20,终浓度为300mgmL;MgS〇4·7H20,终浓度为720mgmL;NaH2P〇4·H2O,终浓度为16.5mgmL;Na2SO4，终浓度为200mgmL;ZnS〇4·7H20，终浓度为3mgmL;KI，终浓度为0.83mgmL;H3B〇3,终浓度为1.5mgmL;Na2Mo〇4·2H20,终浓度为0.25mgmL;CoCl2·6H20,终浓度为〇.〇25mgmL;CuS〇4·5H20，终浓度为0.025mgmL;肌醇，终浓度为lOOmgmL;VB5，终浓度为5mgmL;VBl，终浓度为lmgmL;VB6，终浓度为lmgmL;CH，终浓度为2·5mgmL;泛酸钙，终浓度为〇.lmgmL;FeS〇4·7H20,终浓度为27.85mgmL以及Na2EDTA·2H20,终浓度为37·25mgmL〇[0009]进一步的，所述胚为高加索三叶草与白三叶远缘杂交^代的胚。[0010]另外，本发明还提供了一种胚培养方法，所述胚培养方法应用了所述的胚培养基。[0011]进一步的，所述胚培养方法包括将胚消毒后，接种于离体培养基上，进行离体培养;所述离体培养基通过在所述胚培养基添加蔗糖和琼脂制得。[0012]进一步的，所述离体培养的温度为25〜29°C，所述离体培养的光照时间为11〜12h，所述离体培养的光照强度为18000〜22000ymolm2·s。[0013]进一步的，所述离体培养基中，所述蔗糖的含量为2%，所述琼脂的含量为0.7%。[0014]进一步的，所述胚为高加索三叶草与白三叶远缘杂交^代的胚。[0015]另外，本发明还提供了所述的胚培养方法在高加索三叶草与白三叶杂交育种中的应用。[0016]本发明提供的胚培养基通过不断的尝试和改良而确定，本发明提供的胚培养基结合本发明提供的胚培养方法，能够有效提高胚的成熟率，尤其是能够提高高加索三叶草与白三叶杂交Fl代杂交胚的成熟率，有利于高加索三叶草与白三叶的杂交育种。具体实施方式[0017]下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。[0018]本发明提供了一种胚培养基，包括：KCl，KNO3,CaNO3MH2OJgSO4·7Η20，NaH2PO4·H2O，Na2S〇4，ZnS〇4·7Η20,KIH3BO3，Na2Mo〇4·2Η20,CoCl2·6H20，CuS〇4·5Η20,肌醇，VB5，VBl，VB6，CH，泛酸钙，FeS04·7H20以及Na2EDTA·2H20。[0019]其中，KCl的终浓度为58.5-71.511^11^，例如可以为58.5、59.8、61.75、63.05、65、66.95、68.25、70.2或者71.511^111匕[0020]KNO3，终浓度为72-88mgmL，例如可以为72、73·6、76、77·6、80、82·4、84、86·4或者88mgmL〇[0021]CaNO3·4H20,终浓度为270-330mgmL，例如可以为270、276、285、291、300、309、315、324或者330mgmL。[0022]MgS〇4·7H20,终浓度为648-792mgmL，例如可以为648、662.4、684、698.4、720、741.6、756、777.6或者79211^111匕[0023]NaH2PO4·H2O,终浓度为14.85-18.15mgmL，例如可以为14.85U5.18、15.675、16.005、16.5、16.995、17.325、17.82或者18.15mgmL。[0024]Na2S〇4,终浓度为180-220mgmL，例如可以为180、184、190、194、200、206、210、216或者220mgmL。[0025]ZnS〇4·7H20,终浓度为2.7-3.3mgmL，例如可以为2·7、2·76、2·85、2·91、3、3·09、3.15、3.24或者3.311^11^。[0026]KI，终浓度为0.747-0.913mgmL，例如可以为0·747、0·7636、0·7885、0·8051、0.83、0.8549、0.8715、0.8964或者0.91311^111匕[0027]H3BO3，终浓度为1.35-1.65mgmL，例如可以为1.35、1.38、1.425、1.455、1.5、1·545、1·575、1·62或者1·65mgmL。[0028]Na2Mo〇4·2H20,终浓度为0.225-0.275mgmL，例如可以为0·225、0·23、0.2375、0·2425、0·25、0·2575、0·2625、0·27或者0·275mgmL。[0029]CoCl2·6H2O,终浓度为0.0225-0.0275mgmL，例如可以为0·0225、0·023、0·02375、0·02425、0·025、0·02575、0·02625、0·027或者0·0275mgmL。[0030]C11SO4·5H2O,终浓度为0.0225-0.0275mgmL，例如可以为0·0225、0·023、0·02375、0·02425、0·025、0·02575、0·02625、0·027或者0·0275mgmL。[0031]肌醇，终浓度为90-110mgmL，例如可以为90、92、95、97、100、103、105、108或者110mgmL〇[0032]¥85，终浓度为4.5-5.511^11^，例如可以为4.5、4.6、4.75、4.85、5、5.15、5.25、5.4或者5.5mgmL〇[0033]¥81，终浓度为0.9-1.111^11^，例如可以为0.9、0.92、0.95、0.97、1、1.03、1.05、1.08或者l.lmgmL。[0034]¥86，终浓度为0.9-1.111^11^，例如可以为0.9、0.92、0.95、0.97、1、1.03、1.05、1.08或者l.lmgmL。[0035]CH，终浓度为2.25-2.7511^11^，例如可以为2.25、2.3、2.375、2.425、2.5、2.575、2.625、2.7或者2.7511^11^。[0036]泛酸钙，终浓度为0.09-0.IlmgmL，例如可以为0.09、0·092、0.095、0·097、0.1、0.103、0.105、0.108或者0.1111^11^。[0037]FeS〇4·7H20,终浓度为25.065-30.635mgmL，例如可以为25.065、25.622、26.4575、27.0145、27.85、28.6855、29.2425、30.078或者30.63511^111匕[0038]Na2EDTA·2H20,终浓度为33.525-40.975mgmL，例如可以为33.525、34.27、35.3875、36.1325、37.25、38.3675、39.1125、40.23或者40.97511^111匕[0039]另外，本发明还提供了一种胚培养方法，所述胚培养方法应用了所述的胚培养基，所述胚培养方法包括将胚消毒后，接种于离体培养基上，进行离体培养;所述离体培养基通过在所述的胚培养基添加蔗糖和琼脂制得。[0040]其中，所述消毒具体为用70%的酒精以及10%的NaClO溶液进行消毒，所述离体培养的温度为25〜29°C，所述离体培养的光照时间为11〜12h，所述离体培养的光照强度为18000〜22000ymolm2·s。[0041]另外，离体培养基为在所述胚培养基中添加蔗糖和琼脂制得，其中蔗糖的质量百分比为1%〜3%，例如可以为1%、1.5%、2%、2.5%或者3%，琼脂的质量百分比为0.7%〜1.0%，例如可以为0.7%、0.8%、0.9%或者1.0%其中质量百分比以蔗糖含量2%为例，表示每IOOg总离体培养基中，含有2g蔗糖）。[0042]为了有助于更清楚的理解本发明，现通过具体的实施例对本发明的内容进行详细的介绍。[0043]实施例1胚培养基[0044]本实施例提供了一种胚培养基，包括：KCl，终浓度为65mgmL;KNO3，终浓度为80mgmL;CaNO3·4H20,终浓度为300mgmL;MgS〇4·7H20,终浓度为720mgmL;NaH2PO4·H2O，终浓度为16·5mgmL;Na2S〇4，终浓度为200mgmL;ZnS〇4·7H20，终浓度为3mgmL;KI，终浓度为〇.83mgmL;H3B〇3,终浓度为1.5mgmL;Na2Mo〇4·2H20,终浓度为0.25mgmL;CoCl2·6H20，终浓度为0·025mgmL;CuS〇4·5H20，终浓度为0·025mgmL;肌醇，终浓度为100mgmL;VB5，终浓度为5mgmL;VB1，终浓度为lmgmL;VB6，终浓度为lmgmL;CH，终浓度为2.5mgmL;泛酸钙，终浓度为〇.lmgmL;FeS〇4·7H20,终浓度为27.85mgmL以及Na2EDTA·2H20,终浓度为37·25mgmL。[0045]实施例2胚培养基[0046]本实施例提供了一种胚培养基，包括：KCl，终浓度为62mgmL;KNO3，终浓度为76mgmL;CaNO3·4H20,终浓度为285mgmL;MgS〇4·7H20,终浓度为684mgmL;NaH2PO4·H2O，终浓度为15·675mgmL;Na2S〇4，终浓度为190mgmL;ZnS〇4·7H20，终浓度为2·85mgmL;KI，终浓度为0·7885mgmL;H3BO3，终浓度为I·425mgmL;Na2Mo〇4·2H20，终浓度为0·2375mg111^：〇：12,6!120，终浓度为0.023811^1^;：11304.5!120，终浓度为0.023811^1^;肌醇，终浓度为95mgmL;VB5，终浓度为4·75mgmL;VBl，终浓度为0·95mgmL;VB6，终浓度为0·95mgmL;CH，终浓度为2·375mgmL;泛酸钙，终浓度为0·09mgmL;FeS〇4·7H20，终浓度为26·4575mgmL以及Na2EDTA·2H20,终浓度为35.3875mgmL。[0047]实施例3胚培养基[0048]本实施例提供了一种胚培养基，包括：KCl，终浓度为68mgmL;KNO3，终浓度为84mgmL;CaN〇3·4H20,终浓度为315mgmL;MgS〇4·7H20,终浓度为756mgmL;NaH2P〇4·H2O，终浓度为24·75mgmL;Na2S〇4，终浓度为2lOmgmL;ZnS〇4·7H20，终浓度为3·15mgmL;KI，终浓度为0·8715mgmL;H3BO3，终浓度为I·575mgmL;Na2Mo〇4·2H20，终浓度为0·2625mg111^：〇：12*6!120，终浓度为0.026311^1^;：11304.5!120，终浓度为0.026311^1^;肌醇，终浓度为105mgmL;VB5，终浓度为5·25mgmL;VBl，终浓度为1·05mgmL;VB6，终浓度为1·05mgmL;CH，终浓度为2·625mgmL;泛酸钙，终浓度为0·105mgmL;FeS〇4·7H20,终浓度为29·2425mgmL以及Na2EDTA·2H20,终浓度为39.1125mgmL。[0049]实施例4胚培养基[0050]本实施例提供了一种胚培养基，包括:KCl，终浓度为58.5mgmL;KNO3，终浓度为72mgmL;CaNO3·4H20,终浓度为270mgmL;MgS〇4·7H20,终浓度为648mgmL;NaH2PO4·H2O，终浓度为14·85mgmL;Na2S〇4，终浓度为180mgmL;ZnS〇4·7H20，终浓度为2·7mgmL;KI，终浓度为〇·747mgmL;H3BO3，终浓度为I·35mgmL;Na2Mo〇4·2H20，终浓度为0·225mgmL;：〇：12,6!120，终浓度为0.022511^111^：11304.5!120，终浓度为0.022511^111^肌醇，终浓度为90mgmL;VB5，终浓度为4·5mgmL;VBl，终浓度为0·9mgmL;VB6，终浓度为0·9mgmL;CH，终浓度为2·25mgmL;泛酸钙，终浓度为0·09mgmL;FeS〇4·7H20，终浓度为25·065mgmL以及Na2EDTA·2H20,终浓度为33.525mgmL。[0051]实施例5胚培养基[0052]本实施例提供了一种胚培养基，包括:KCl，终浓度为71.5mgmL;KNO3，终浓度为88mgmL;CaNO3·4H20,终浓度为330mgmL;MgS〇4·7H20,终浓度为792mgmL;NaH2PO4·H2O，终浓度为18·15mgmL;Na2S〇4，终浓度为220mgmL;ZnS〇4·7H20，终浓度为3·3mgmL;KI，终浓度为〇·913mgmL;H3BO3，终浓度为I·65mgmL;Na2Mo〇4·2H20，终浓度为0·275mgmL;：〇：12,6!120，终浓度为0.027511^111^：11304.5!120，终浓度为0.027511^111^肌醇，终浓度为110mgmL;VB5，终浓度为5·5mgmL;VB1，终浓度为1·lmgmL;VB6，终浓度为1·lmgmL;CH，终浓度为2·75mgmL;泛酸钙，终浓度为0·IlmgmL;FeS〇4·7H20，终浓度为30·635mgmL以及Na2EDTA·2H20,终浓度为40.975mgmL。[0053]对比例1胚培养基[0054]本实施例提供了一种胚培养基，包括:KCl，终浓度为45.5mgmL;KNO3，终浓度为56mgmL;CaN〇3·4H20,终浓度为210mgmL;MgS〇4·7H20,终浓度为504mgmL;NaH2P〇4·H2O，终浓度为11·55mgmL;Na2S〇4，终浓度为140mgmL;ZnS〇4·7H20，终浓度为2·lmgmL;KI，终浓度为〇·58lmgmL;H3BO3，终浓度为I·05mgmL;Na2Mo〇4·2H20，终浓度为0·175mgmL;CoCl2·6H20,终浓度为0.0175mgmL;CuS〇4·5H20,终浓度为0.0175mgmL;肌醇，终浓度为70mgmL;VB5，终浓度为3·5mgmL;VBl，终浓度为0·7mgmL;VB6，终浓度为0·7mgmL;CH，终浓度为1·75mgmL;泛酸钙，终浓度为0·07mgmL;FeSk·7H20，终浓度为19·495mgmL;Na2EDTA·2H20,终浓度为26.075mgmL。[0055]对比例2胚培养基[0056]本实施例提供了一种胚培养基，包括：KCl，终浓度为9lmgmL;KNO3，终浓度为112mgmL;CaN〇3·4H20,终浓度为420mgmL;MgS〇4·7H20,终浓度为1008mgmL;NaH2P〇4·H2O，终浓度为23·lmgmL;Na2S〇4，终浓度为280mgmL;ZnS〇4·7H20，终浓度为4·2mgmL;KI，终浓度为I·162mgmL;H3BO3，终浓度为2·lmgmL;Na2Mo〇4·2H20,终浓度为0·35mgmL;CoCl2·6H20,终浓度为0.035mgmL;CuS〇4·5H20,终浓度为0.035mgmL;肌醇，终浓度为140mgmL;VB5，终浓度为7mgmL;VBl，终浓度为1·4mgmL;VB6，终浓度为1·4mgmL;CH，终浓度为3.511^1^;泛酸钙，终浓度为0.1411^1^小63〇4.7!120，终浓度为38.9911^1^;恥疋0丁八·2H20，终浓度为52·15mgmL。[0057]另外，本发明还提供了一种胚培养方法。[0058]实施例6胚培养方法[0059]高加索三叶草与白三叶杂交：[0060]单株种植高加索三叶草和白三叶，进入现蕾期后，将高加索三叶草的花蕾用脱脂棉包裹，并套以羊皮纸袋，避免昆虫传粉，表明套袋日期并挂牌。在整个授粉过程中，由于高加索三叶草自花授粉结实率很低，未进行去雄实验。约4〜5d后打开羊皮纸袋进行观察，当大部分小花旗瓣伸出、翼瓣张开时，对其进行人工授粉。具体方法为，用小勺或者小镊子拨取白三叶的花粉，分别涂抹于高加索三叶草花序中层各小花的柱头上，并将其他未进行授粉的小花拨掉。之后再次使用脱脂棉进行包裹、套袋，并于标牌上注明已授粉的小花数以及授粉日期。[0061]杂交胚离体培养：[0062]授粉后约12〜15d，采摘花序带回实验室，在超净工作台内，将高加索三叶草与白三叶杂交?:代的胚简称“杂交胚”）从小花中剥离出来，置于已高温灭菌的微型烧杯中，用70%的酒精分3次漂洗，每次3min，再用10%的NaClO溶液浸泡6.5min，之后用无菌水冲洗3〜5遍，接种于离体培养基上，培养基的pH值调整至6。接种后将其放入恒温培养箱内，每日光照11〜12h，光照强度18000〜22000ymolm2·s，培养箱温度保持在27°C左右，50d后观察杂交胚的发育情况，并统计成熟率。[0063]在本实施例中，离体培养基可以为实施例1-5提供的胚培养基，并添加2%的蔗糖和0.7%的琼脂。[0064]为了更清楚的理解本发明的效果，现通过具体的实验对本发明进行详细的说明。[0065]不同培养基对胚离体培养成熟率的影响[0066]按照实施例6中提供的胚培养方法，分别应用实施例1-5以及对比例1和2中提供的胚培养基，对高加索三叶草与白三叶杂交F1代的胚进行离体培养，观察杂交胚的发育情况，统计用不同培养基对杂交胚进行离体培养时，杂交胚的成熟率，并将数据列于表1中。[0067]表1不同胚培养基对杂交胚成熟率的影响[0068][0069]注:*代表与对比例1相比，有显著性差异P〈0.05[0070]由表1可以发现，应用实施例1-5提供的胚培养基进行杂交胚离体培养时，杂交胚的成熟率均能够达到10%以上，远远高于对比例1和对比例2的杂交胚的成熟率，证明本发明提供的胚培养基能够有效提高杂交胚的成熟率，促进杂交胚的发育。[0071]最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

权利要求：1.一种胚培养基，其特征在于，所述胚培养基包括：KCl，终浓度为58.5-71.5mgmL;KNO3，终浓度为72-88mgmL;CaNO3·4H20，终浓度为270-330mgmL;MgS〇4·7H20，终浓度为648-792mgmL;NaH2PO4·H2O，终浓度为14·85-18·15mgmL;Na2S〇4，终浓度为180-220mgmL;ZnS〇4·7H20，终浓度为2·7-3·3mgmL;KI，终浓度为0·747-0·913mgmL;H3BO3，终浓度为1.35-1·65mgmL;Na2MoO4·2H20,终浓度为0.225-0.275mgmL;CoCl2·6H20,终浓度为0·0225-0·0275mgmL;CuS〇4·5H20，终浓度为0·0225-0·0275mgmL;肌醇，终浓度为90-11OmgmL;VB5，终浓度为4·5-5·5mgmL;VBl，终浓度为0·9-1·lmgmL;VB6，终浓度为0.9_1·lmgmL;CH，终浓度为2·25-2·75mgmL;泛酸钙，终浓度为0·09-0·IlmgmL;FeS〇4·7H20，终浓度为25·065-30·635mgmL以及Na2EDTA·2H20,终浓度为33·525-40·975mgmL。2.根据权利要求1所述的胚培养基，其特征在于，所述胚培养基包括:KCl，终浓度为62-68mgmL;KNO3，终浓度为76-84mgmL;CaNO3·4H20，终浓度为285-315mgmL;MgS〇4·7H20，终浓度为684-756mgmL;NaH2PO4·H2O，终浓度为15·675-24·75mgmL;Na2S〇4，终浓度为190_210mgmL;ZnS〇4·7H20，终浓度为2·85-3·15mgmL;KI，终浓度为0·7885-0·8715mgmL;H3BO3，终浓度为1.425-1.575mgmL;Na2Mo〇4·2H20,终浓度为0.2375-0.2625mgmL;CoCl2·6H2O，终浓度为0·0238-0·0263mgmL;CuS〇4·5H20，终浓度为0·0238-0·0263mgmL;肌醇，终浓度为95-105mgmL;VB5，终浓度为4·75-5·25mgmL;VBl，终浓度为0·95-1·05mgmL;VB6，终浓度为〇.95-1.05mgmL;CH，终浓度为2.375-2.625mgmL;泛酸钙，终浓度为0.09_0.105mgmL;FeS〇4·7H20,终浓度为26.4575-29.2425mgmL以及Na2EDTA·2H20,终浓度为35.3875-39.1125mgmL〇3.根据权利要求2所述的胚培养基，其特征在于，所述胚培养基包括：KCl，终浓度为65mgmL;KN〇3,终浓度为80mgmL;CaN〇3·4H20,终浓度为300mgmL;MgS〇4·7H20,终浓度为720mgmL;NaH2P〇4·H20,终浓度为16.5mgmL;Na2S〇4,终浓度为200mgmL;ZnS〇4·7H20，终浓度为3mgmL;KI，终浓度为0·83mgmL;H3BO3，终浓度为I·5mgmL;Na2MoO4·2H20，终浓度为0.25mgmL;CoCl2·6H20,终浓度为0.025mgmL;CuS〇4·5H20,终浓度为0.025mgmL;肌醇，终浓度为100mgmL;VB5，终浓度为5mgmL;VBl，终浓度为lmgmL;VB6，终浓度为lmgmL;CH，终浓度为2.5mgmL;泛酸钙，终浓度为0.lmgmL;FeS〇4·7H20,终浓度为27.85mgmL以及Na2EDTA·2H20,终浓度为37.25mgmL。4.根据权利要求1-3任一项所述的胚培养基，其特征在于，所述胚为高加索三叶草与白三叶远缘杂交朽代的胚。5.—种胚培养方法，其特征在于，所述胚培养方法应用了权利要求1-3任一项所述的胚培养基。6.根据权利要求5所述的胚培养方法，其特征在于，所述胚培养方法包括将胚消毒后，接种于离体培养基上，进行离体培养;所述离体培养基通过在权利要求1-3任一项所述的胚培养基添加蔗糖和琼脂制得。7.根据权利要求6所述的胚培养方法，其特征在于，所述离体培养的温度为25〜29°C，所述离体培养的光照时间为11〜12h，所述离体培养的光照强度为18000〜22000ym〇lm2·So8.根据权利要求7所述的胚培养方法，其特征在于，所述离体培养基中，所述蔗糖的含量为2%，所述琼脂的含量为0.7%。9.根据权利要求7或者8所述的胚培养方法，其特征在于，所述胚为高加索三叶草与白三叶远缘杂交朽代的胚。10.权利要求9所述的胚培养方法在高加索三叶草与白三叶杂交育种中的应用。

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