申请/专利权人：瑟吉麦博股份公司

申请日：2016-06-02

公开（公告）日：2021-04-09

公开（公告）号：CN107949385B

主分类号：A61K31/473(20060101)

分类号：A61K31/473(20060101);A61P35/00(20060101);A61K49/00(20060101)

优先权：["20150603 EP 15170617.3"]

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.04.09#授权;2018.06.29#实质审查的生效;2018.04.20#公开

摘要：本发明提供了具有偶联到靶向部分T的荧光染料部分F的缀合物。部分F由式I表示，并且所述靶向部分T的特征在于其对例如抗体或抗体片段的肿瘤标志物具有亲和力。所述缀合物在切除手术过程中可以用于包括肿瘤结节的光电检测的肿瘤诊断。

主权项：1.一种荧光缀合物，其包括偶联到靶向部分T的荧光染料部分F，其中部分F具有式I： 其中Y在每次出现时独立地选自SO3H、SO3-和SO3M，其中M是一价阳离子；x、z、和y独立地选自1至8的整数；以及其中部分T对肿瘤标志物具有亲和力。

全文数据：灭光缀合物技术领域[0001]本发明属于生物医学研究的领域，尤其涉及在诊断，例如在肿瘤的体外或体内诊断中有用的化合物和方法。背景技术[0002]癌症目前占全世界所有死亡人数的约13%。尽管经过几十年来的大力研究，癌症仍然是高度发达国家中死亡的第二大原因，占死亡人数的约25%。对于许多类型的癌症，手术通常与化疗、放射治疗或热疗结合是治疗干预的主体。[0003]癌症也被称为恶性赘生物或恶性肿瘤。赘生物是组织的异常增长。赘生物区分为良性赘生物、癌症前期赘生物或原位赘生物、以及恶性赘生物。许多但不是所有的赘生物也形成肿瘤，肿瘤是可从解剖上与未受影响的组织区别开来的实体或流体填充的病变。像赘生物一样，肿瘤可以是良性肿瘤、癌症前期肿瘤、或恶性肿瘤。然而，在通用语言中以及在本发明的说明书中，术语“肿瘤”可以与“恶性肿瘤”同义使用。[0004]癌症患者的生命预后取决于首次诊断时疾病所处的阶段。百分之二十到百分之三十的胃肠道癌症患者将发生以独特复发形式的局部复发。卵巢上皮性肿瘤在到达第三阶段时也发生局部演变。几年前证实了完全手术切除是患者预后改善的非常重要的因素。这种最大程度细胞减灭策略是治疗方案的一部分，该治疗方案包括可能与热疗有关的全身或腹膜内化疗。[0005]根治性手术的构建是关系到患者的将来的主要参数。检测出总体的瘤结节及其播散是影响术后预后的关键点。肿瘤与正常组织往往并不容易区分，尤其是在患者已经接受新辅助治疗的情况下更难以区分。外科医生们则只能通过他们的视觉和触觉，以及通过他们的经验来引导，在进行手术时没有可用的术中技术来帮助他们直观肿瘤的扩展。[0006]有人建议，可以通过使用原位光电探测来改善癌症切除手术。光电检测取决于用对肿瘤具有亲和力并在选定的光波长下能够光学可视的化合物接触潜在受影响的组织。[0007]肿瘤的光电检测最初是在1980年代借助于诸如光敏素之类的血卟啉衍生物而开发的。用这些分子进行光诊断的主要限制是它们对癌组织的低选择性以及它们发生化学反应并诱发高光敏作用或坏死的能力。后面这种限制在光动力疗法中实际上算为优点，为此还推荐这些化合物。[0008]Folli等人使用抗癌胚抗原CEA抗体与荧光素的缀合物使结肠直肠癌患者的肿瘤可见（Proc·Natl.Acad·Sci·USA，vol·89，pp·7973-7977，1992。Gutowsky等人证明了在小鼠模型中使用抗-CEAMAb35A7和靛青Cy5的缀合物对结肠癌LS174T的病变进行免疫光电检测（Clin.CancerRes.，νο1·7，ρρ·1142-1148,2001〇[0009]然而，这些缀合物的临床效用相当有限。抗体与荧光素的缀合物具有相当低的激发和发射波长，导致低的组织穿透和通过用于激发染料组分的激光诱发的相当大程度的非癌组织的非特异性的自发荧光。Cy5缀合物的毒理学是未知的，并且也未在文献中得到证实。[0010]本发明解决了肿瘤光电检测的这些和其它相关的问题和缺点。本发明的目的之一是提供对恶性肿瘤或癌症前期肿瘤的光电检测有用的改善的缀合物，其在临床上是可行的，其克服现有技术中的一个或多个缺点，并且其具有以下性质中的一种或多种:高度的肿瘤特异性、高灵敏度如能够检测非常小的肿瘤病灶）、良好的临床耐受性、高稳定性、对其它染料的干扰小、以及良好的可制造性。[0011]本发明的另一个目的是提供使用这样的缀合物的用于肿瘤的改进的体外和体内诊断方法。用于体内的话，这样的诊断方法可能是新疗法的一部分，该新疗法为如改进的肿瘤切除方法。[0012]本发明的另一个目的是提供用于制备这种缀合物的方法。[0013]本发明的其它目的将在本发明的以下描述和本权利要求书的基础上显而易见。发明内容[0014]简言之，本发明提供荧光缀合物，其包括偶联到靶向部分T的荧光染料部分F，其中部分F具有如下文中所定义的式（I，其中Y在每次出现时独立地选自S03H、S031PS03M;M是一价阳离子;x、z和y独立地选自从1至8的整数;且其中部分T对肿瘤标志物具有亲和力。在一个实施方式中，荧光染料部分F可具有如下所定义的式II。[0015]靶向部分T对其具有亲和力的肿瘤标志物可以是肿瘤抗原，例如由某些肿瘤细胞表达或过度表达的抗原。这样的抗原的实例是癌胚抗原CEA。靶向部分T本身可以是非肽配体、抗体、抗体片段、或包含抗体的至少一个可变区的融合蛋白。在一个实施方式中，靶向部分T是抗体，特别是嵌合抗体、人源化抗体或人单克隆抗体。[0016]在另外的方面，本发明提供一种组合物，其包含这种缀合物，任选与其它活性或非活性成分组合。例如，该组合物可以是无菌的并且包含诸如注射用水、缓冲液组分之类的非活性成分，诸如氨基酸之类的一种或多种稳定剂，诸如单糖、二糖或寡糖的冻干助剂，等渗剂等。该组合物还可包含少量的非缀合形式的靶向部分T。[0017]在又一个方面，本发明提供一种用于制备缀合物的方法。该方法包括以下步骤：a提供具有如下所定义的式（III的荧光染料，其中Y在每次出现时独立地选自S03H、S〇r和SO3M,其中M是一价阳离子，x、dPy独立地选自从1至8的整数，以及Z选自抗衡离子、氢、琥珀酰亚胺基、磺基琥珀酰亚胺基、以及硝基苯基；（b提供对肿瘤标志物具有亲和力的靶向剂；以及c偶联荧光染料与靶向剂。在一个实施方式中，所述荧光染料具有如下所定义的式IV。[0018]此外，本发明提供了所述缀合物以及包含所述缀合物的组合物的临床和非临床用途。体外用途包括用于检测样品中的一个或多种肿瘤细胞，或用于体外诊断和或监测肿瘤。临床上，所述缀合物和或包含所述缀合物的组合物可用于检测表达肿瘤标志物的肿瘤病灶或用于确定患者体内的表达肿瘤标志物的肿瘤的位置。例如，它们可用于检测正在接受切除手术或已经接受切除手术的患者体内切除边缘处的肿瘤细胞或肿瘤组织。在一个实施方式中，将包含所述缀合物的组合物施用到患有表达该靶向部分T对其具有亲和力的肿瘤标志物的肿瘤的患者，该施用为例如通过静脉内、腹膜内、皮下或肌内注射或灌注，或者通过吸入或者通过局部给药，例如以喷雾的方式;此后在不超过约72小时内对患者进行肿瘤切除手术，并用波长为约660至700纳米的光照射正接受切除手术的患者切除位点处的组织。以这种方式，包括原本人的肉眼不可见的非常小的结节或病灶的定位的肿瘤的定位将变得可见，以指导外科医生完全切除肿瘤组织和或验证切除的完全性。附图简要说明[0019]图1示出了在施用20yg的实施例3的荧光缀合物后在700nm处可见的LS-174T腹膜转移癌小鼠模型内的原位肿瘤样微结节的荧光A列）和切除后的肿瘤样微结节的荧光B列）。[0020]图2A示出了过度表达CEA的人类结直肠癌HT-29的皮下肿瘤小鼠模型内肿瘤的图像，该图像是在施用30yg的荧光缀合物48小时之后拍摄的A-实施例3的荧光缀合物;B-对照缀合物）。从左到右的列示出了在白光、荧光在700nm处可视）下拍摄的图像以及在叠加下获取的图像。[0021]图2B示出了过度表达CEA的人类结直肠癌HT-29的原位肿瘤小鼠模型内肿瘤的图像，该图像是在施用30yg的实施例3的荧光缀合物48小时之后拍摄的A-切开前，B-切开后，C-肿瘤暴露后）。从左到右的列示出了在白光、荧光在700nm处可视下拍摄的图像以及在叠加下获取的图像。[0022]图3示出了在患者的原发性胰腺肿瘤的手术过程中拍摄的图像，该拍摄是在施用5mg的实施例3的荧光缀合物48小时后进行的A是在白光下，以及B是与荧光叠加的图像）。虚线表示仅基于目测和触诊所建议的切除边缘，而实线给出了基于荧光可视所建议的切除边缘。点线表示如由荧光所示的肿瘤的大致轮廓。[0023]图4示出了在施用5mg的实施例3的荧光缀合物48小时之后胰腺癌患者的腹膜转移的图像。在A排的图像是手术中在体内获得的，而在B排的图像是切除后离体的（左列在白光条件下，而右列是与荧光作为叠加图像）。具体实施方式[0024]在第一方面，本发明提供荧光缀合物，其包括偶联到靶向部分T的荧光染料部分F，其中部分F具有式I:其中Y在每次出现时独立地选自SO3H、SO3^SO3M;M是一价阳离子;X、z、和y独立地选自1至8的整数;以及其中部分T对肿瘤标志物具有亲和力。[0025]—价阳离子的实例包括但不限于钠、钾、或铵。在优选的实施方式中的一个中，Y选自S〇3_和S03Na。[0026]本发明的荧光缀合物的荧光染料部分F其也可称为荧光染料或荧光标记物或荧光团部分吸收波长范围优选在紫外、可见光谱或红外处的电磁能以及发射通常较长波长范围的电磁能，优选在可见或近红外范围内。如本文所理解的，术语激发波长（以nm表示是指峰值，即荧光染料的最大或特定吸收波长，或者包括耦联到靶向部分T的荧光染料部分的荧光缀合物的最大或特定吸收波长。术语发射波长（以nm表示是指峰值，即荧光染料的最大或特定发射波长，或者本发明的包括耦联到靶向部分的荧光染料部分的荧光缀合物的最大或特定发射波长。[0027]荧光染料部分F是如上所述的式（I的花菁染料衍生物并且优选发射峰值发射波长范围介于650和750nm之间的远可见或近红外NIR光谱。当偶联到靶向部分T时，所得到的缀合物也优选发射峰值发射范围介于650和750nm之间的光谱。[0028]本发明人已经发现这些荧光染料部分具有特别有利的荧光特性，例如猝灭、量子产率，以及特别是对光致漂白的稳健性robustness，使它们能够可靠地用于与对抗原具有活性的靶向部分缀合。[0029]就Y而言，本领域技术人员将认识到，取决于缀合物的化学环境，S03H、SO3'SO3M和或SO3Na基团也可动态地彼此转化。例如，当溶解在水性介质中时，取决于pH以及其它阳离子的可用性，由Y表示并选自S03_、S03M和或SO3Na的基团也可以质子化成SO3H,或者其可以转化成另一种盐的形式，例如从SO3Na转化成SO3K,或者反之亦然。因此，本发明涵盖式（I化合物的这种替代形式。[0030]特别优选的缀合物是包含式II的荧光染料部分F的那些缀合物：[0031]在该荧光缀合物中，该荧光染料部分F被偶联到靶向部分T;优选地其是共价连接的，即，通过诸如酰胺或酯键之类的共价键缀合到靶向部分T。[0032]如在式⑴的上下文中提到的，式（II也应参照由Y表示的基团被解释，以包括取决于例如缀合物可溶解于其中的水性介质的组成和或PH值，在化学平衡下原位产生的诸如SO3H或SO3K之类的替代的磺酸形式。此外，应该理解的是，式（II中四个磺酸基团中的每一个可以是Na盐或内盐形式，以及所描述的式II表示所代表的化合物的各种可能性中的仅一种。[0033]荧光缀合物的靶向部分T对肿瘤标志物具有亲和力并可以与肿瘤标志物相结合或相缔合。肿瘤标志物应被理解为由肿瘤产生或存在于肿瘤中的产物或分子，或由患者的正常细胞机制响应于肿瘤的存在而产生的产物或分子。如本文所用，除非从特定的上下文中明显得出不同的含义，否则肿瘤是指赘生物，其是由异常的或不受控制的细胞增长引起的成群的或成团的细胞或组织。特别地，肿瘤标志物是由癌性的或恶性的肿瘤产生的。[0034]肿瘤标志物可以是，例如，蛋白质、糖蛋白、受体、激素、酶、抗原、癌基因或其产物的形式。肿瘤标志物可以是由肿瘤细胞相比于正常细胞过度表达的，或者它可以是唯一地由肿瘤细胞产生的肿瘤特异性物质。靶向部分T可以靶向或定向的特别优选的肿瘤标志物是作为存在于肿瘤细胞表面上的细胞表面蛋白或受体的那些肿瘤标志物和或特别在上皮细胞或诸如癌或肉瘤之类的实体肿瘤中表达的那些肿瘤标志物。[0035]在本发明的优选实施方式中，肿瘤标志物是肿瘤抗原。肿瘤抗原是肿瘤细胞特有的或者与肿瘤细胞相关的分子或产物例如在肿瘤细胞中过度表达的），其可以诱导或刺激免疫系统反应，例如抗体的产生以及T细胞和或B细胞应答。肿瘤抗原可以表示或包含蛋白质或脂质。它可以是糖基化的（例如，糖蛋白），并且可以具有一个或多个表位，即，抗体、B细胞或T细胞可优选地结合于或对其具有特别的亲和力的部位或域。[0036]示例性的肿瘤抗原包括衍生自或产生自肿瘤病毒蛋白、仅在胎儿发育过程中通常以较高水平产生的癌胚抗原、由肿瘤细胞相对于正常细胞过度表达或积累的抗原、或突变体或翻译后改变的抗原的肿瘤抗原。优选地，肿瘤标志物是选自癌胚抗原CEA、表皮生长因子受体EGFR和人表皮生长因子受体-2HER2的肿瘤抗原。[0037]在本发明的优选实施方式中，肿瘤抗原是癌胚抗原CEAXEA是在上皮细胞中表达的分子量为180_200kDa的癌胚糖蛋白。CEA在特别是在结肠和直肠的恶性肿瘤在95%的结肠直肠癌中过度表达）、以及胃、小肠、胰腺、肝脏、乳腺、卵巢、子宫颈、膀胱、胆囊和肺的恶性肿瘤中的细胞表面上以高水平表达。CEA通常不限于局部而可以在整个细胞表面以及腺内管腔和细胞内管腔中表达。CEA抗原包括如在Ha_arstr5m等人的CancerRes1989494852-4858中所定义的分类为G0LD-1至G0LD-5的五种主要的表位，抗CEA抗体或抗体片段或融合蛋白对其可具有结合特异性。[0038]在优选的实施方式之一中，本发明的荧光缀合物的靶向部分T靶向并结合到可以位于患者的选自结肠、直肠、胃、小肠、胰腺、肝脏、乳腺、卵巢、子宫颈、膀胱、胆囊、肺和食道中的一个或多个组织或器官中的CEA抗原表达肿瘤。[0039]在另一个优选的实施方式中，荧光缀合物的靶向部分T可以结合到为受体的肿瘤标志物。该受体可以是肿瘤细胞特异性的或者可以是以较高水平过度表达并存在于肿瘤细胞中的。靶向部分T可以充当这种受体的配体，并且可以是小的非肽分子，即不掺入或不包括任何氨基酸序列的化学实体或化合物。[0040]在优选的实施方式中，本发明的荧光缀合物包含式（I或式（II的荧光染料和选自非肽配体、抗体、抗体片段以及包含抗体的至少一个可变区的融合蛋白的靶向部分T。优选地，任何一种这样的靶向部分都能够特异性地结合到诸如CEA、HER2、或EGFR的肿瘤抗原。在一个具体的实施方式中，荧光缀合物包含式⑴或式II的荧光染料和选自非肽配体、抗体、抗体片段以及包含抗体的至少一个可变区的融合蛋白的靶向部分T，其中靶向部分特异性地结合到CEA。[0041]在一个具体的实施方式中，靶向部分T是抗体或抗体片段、或包含抗体的至少一个可变区的融合蛋白。在这种情况下，抗体、抗体片段或包含抗体的至少一个可变区的融合蛋白可以源自、或属于IgG、IgA、IgD或IgM免疫球蛋白同种型或类的任何一种。全长抗体通常是Y形的糖蛋白，其包含Fc可结晶片段结构域和Fab抗原结合片段结构域。这些是由经由二硫键互连以形成Y形结构的一对重链H和轻链L多肽结构构建的。每条链包含可变区（V和恒定区（C。重链包含可变链区（Vh和多种恒定区（缩写Ch1、Ch2等）；而轻链仅包含可变链区Vl和恒定区Cl。可变区参与抗体识别并特异性结合到抗原的特定表位，并形成抗原结合Fab结构域。[0042]抗体片段是指能够与抗原相互作用并特异性地结合到抗原的抗体的任何区、链、或结构域，或者任何构建物、稳定形式或其缀合物。示例性的抗体片段包括片段抗原结合结构域Fab，或FabO，Fab构建物，单链可变片段scFv，诸如VHH、微型抗体，双价抗体等单结构域抗体。融合蛋白是指包含融合到另一个生物活性的蛋白或多肽的抗体片段的构建物。[0043]在优选的实施方式中，本发明的荧光缀合物的靶向部分T是单克隆抗体mAb。这可以通过本领域中已知的方法来制备。嵌合单克隆抗体是特别优选的。这些是包含源自多于一个物种（例如源自人类抗体和鼠类抗体）的重链或轻链的结构域或区的混合单克隆抗体。任选地，荧光缀合物的靶向部分T可以是人源化抗体通常主要包括至少85-95%人衍生的序列或仅由人胚系抗体序列衍生的人抗体。[0044]优选地，任何一种这样的祀向部分T能够特异性地结合到肿瘤抗原CEA。[0045]在一个实施方式中，包含式（I的荧光染料部分F的荧光缀合物的靶向部分T是具有对CEA抗原的一个或多个表位例如，GOLD-1、GOLD-2、GOLD-3、G0LD-4或G0LD-5表位具有结合特异性的嵌合单克隆抗体。在一个具体实施方式中，靶向部分T对G0LD-2表位具有亲和力或特异性。在另一个实施方式中，这样的缀合物的荧光染料部分F具有如上所述的式II。[0046]在特别优选的实施方式中，本发明提供荧光缀合物，其包括偶联到靶向部分T的荧光染料部分F，其中部分F具有式（II，以及其中部分T是针对CEA的G0LD-2表位的嵌合单克隆抗体，其包含Glm3同种异型的重链和km3同种异型的轻链，每条重链和每条轻链都包含至少一个小鼠IgGl可变结构域和至少一个人恒定结构域。这种嵌合单克隆抗体对CEA的GOLD-2表位具有如通过本领域公知的竞争结合抑制试验测定的结合特异性。[0047]特别地，荧光缀合物可以偶联到针对CEA的由以下核苷酸序列表达并制备的嵌合单克隆抗体：㈧重链（SEQIDN0:1:GGTACCGCCGCCACCATGGACTCCAGACTGAACCTGGTGTTCCTGGTGCTGATCCTGAAGGGCGTGCAGTGCGACGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCTCCAGAAAGCTGTCTTGTGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCAACTTCGGCATGCACTGGATCCGGCAGGCCCCTGAGAAGGGCCTGGAATGGGTGGCCTATATCTCCGGCGGCTCCTCCACCATCTACTTCGCCGACACCCTGAAGGGACGGTTCACCATCTCCCGGGACAACCCCAAGAACACCCTGTTTCTGCAGATGACCTCCCTGCGGAGCGAGGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAGAGACTACTACATCAACAACTACTGGTACTTCGACGTGTGGGGCGCTGGCACCACCGTGACAGTGTCATCTGCTAGC⑶轻链（SEQIDNO:2GTCGACGCCGCCACCATGGAATTTCAGACCCAGGTGTTCGTGTTCGTGCTGCTGTGGCTGTCTGGCGTGGACGGCGACATCGTGATGACCCAGTCCCAGAAATTCATGTCCACCTCCGTGGGCGACCGGGTGTCCATCACATGCAAGGCCTCTCAGAACGTGCGGAGCGCCGTGGCCTGGTATCAGCAGACACCTGGCCAGAGCCCCAAGGCCCTGATCTACCTGGCCTCCAACAGATACACCGGCGTGCCCGATCGGTTCACCGGCTCTGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCAACGTGCAGTCCGAGGACCTGGCCGACTACTTCTGTCTGCAACACTGGAACTACCCCCTGACCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGGAACTGAAGCGTACG[0048]上面的可变重链核苷酸序列A在5'端和3'端分别包括用于KpnI和NheI限制位点的序列。可变轻链核苷酸序列B在序列的5'端和3'端分别包括Sail和BSiWI限制位点序列。[0049]这种单克隆抗体的可变区的氨基酸序列对应于以下序列：㈧重链（SEQIDN0:3:AspValGlnLeuValGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGlySerArgLysLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerAsnPheGlyMetHisTrplieArgGlnAlaProGluLysGlyLeuGluTrpValAlaTyrlieSerGlyGlySerSerThrlieTyrPheAlaAspThrLeuLysGlyArgPheThrlieSerArgAspAsnProLysAsnThrLeuPheLeuGlnMetThrSerLeuArgSerGluAspThrAlalieTyrTyrCysAlaArgAspTyrTyrHeAsnAsnTyrTrpTyrPheAspValTrpGlyAlaGlyThrThrValThrValSerSer⑶轻链（SEQIDNO:4AsplieValMetThrGlnSerGlnLysPheMetSerThrSerValGlyAspArgValSerlieThrCysLysAlaSerGlnAsnValArgSerAlaValAlaTrpTyrGlnGlnThrProGlyGlnSerProLysAlaLeulieTyrLeuAlaSerAsnArgTyrThrGlyValProAspArgPheThrGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSerAsnValGlnSerGluAspLeuAlaAspTyrPheCysLeuGlnHisTrpAsnTyrProLeuThrPheGlyGlyGlyThrLysLeuGluLeuLys[0050]在本发明的优选的实施方式中，荧光缀合物可以包括偶联到靶向部分T的具有式Π的部分F，其中T是针对CEA的包含SEQIDN0:4的可变轻链区和SEQIDN0:3的可变重链的嵌合单克隆抗体。[0051]本发明的荧光缀合物可以包括缀合到一个靶向部分T的一个以上的荧光部分F，例如每个靶向部分T缀合1至约10个部分F。优选地，偶联到一个靶向部分T的荧光染料部分F的数目是选自从1到4。换句话说，在一分子这样的优选缀合物中，η个部分F偶联到一个部分T，且η是选自1到4的整数。[0052]尽管单独的缀合物分子的特征在于η是整数，但是包含多个缀合物分子的所述化合物可以具有一定的缀合度，或每部分T缀合平均数目的部分F，该平均数目不必是整数，但它优选为约1至约4的范围内的任何值。[0053]在这样的背景下，靶向部分T优选选自抗体、抗体片段、以及包含抗体的至少一个可变区的融合蛋白，并且有一至四个式I的荧光染料部分F缀合到该靶向部分Τ。在本发明的一个实施方式中，靶向部分T是偶联到η个式II的荧光染料部分F的抗CEA嵌合单克隆抗体，其中η是在1至4范围内。[0054]本发明的另一个方面涉及包含如上所述的荧光缀合物的组合物。[0055]在一个实施方式中，该组合物包含仅或主要在于其缀合度不同的不同的荧光缀合物的混合物。在另一个具体实施方式中，该组合物包含至少3或4个缀合物的混合物，所有该缀合物都包含偶联到对CEA的G0LD-2表位具有亲和力的嵌合单克隆抗体的具有式（II的荧光染料部分F，并且其中所述至少3或4个缀合物彼此之间的不同在于偶联到一个靶向部分T的荧光染料部分F的数目分别为1、2和3;或分别为1、2、3和4。[0056]该组合物可以进一步包含表示处于非缀合形式的靶向部分T的化合物或理论上，具有取代度为零的缀合物）。例如，与前述实施方式组合，这样的组合物包含对CEA的G0LD-2表位具有亲和力的未缀合的嵌合单克隆抗体以及同一个所述单克隆抗体分别与1、2、3、以及可选4个或更多个根据式（II的荧光染料部分F相偶联的至少三或四个缀合物。这种混合物的缀合数目可以通过本领域已知的方法确定，例如经由质谱法例如MALDI-TOF确定。[0057]组合物中的缀合物的平均缀合度优选为约0.5至约3。缀合度为荧光染料与抗体的摩尔比率，该摩尔比率可以通过分光光度法测定。因此，该数字应被理解为反映存在于组合物中的缀合物和任何未缀合的抗体的平均缀合度。在另一个实施方式中，平均取代度为约1至约2。本发明人已经发现，尽管较高的取代度可提供改善的可视化，但是靶向部分对肿瘤标志物的亲和力随着缀合到靶向部分的荧光染料部分的数目增加而降低。已经确定，取代度为约0.5至约3时，特别是对包含对CEA的G0LD-2表位具有亲和力的嵌合单克隆抗体与根据式（II的荧光染料的缀合物的组合物而言效果最好，原因在于它能够在手术过程中实现对表达CEA的肿瘤的甚至小结节的优秀的可视化。[0058]本发明的组合物可以进一步包含赋形剂，例如缓冲剂、稳定剂、冷冻保护剂、等渗剂、以及pH调节剂。特别优选的赋形剂是碱性氨基酸例如L-精氨酸及其盐，盐例如柠檬酸盐、磷酸钠或磷酸钾盐、氯化钠、氯化钾，糖类例如海藻糖、甘露糖醇、麦芽糖、蔗糖或葡聚糖，或非离子表面活性剂例如聚山梨酯或泊洛沙姆。该组合物的PH优选介于5.2和7.2之间。优选地，该组合物在本领域中公知的无菌条件下制备并且是无菌的。[0059]在具体的实施方式中，包含任何的上述定义的荧光缀合物的组合物是无菌的，并且其还包括缓冲水溶液和L-精氨酸，和或包括包含没有偶联到部分F的部分T的化合物。在另一个实施方式中，包含任何的上述定义的荧光缀合物的组合物是无菌的并且其包括PH值调节到约为6.0的缓冲水溶液、L-精氨酸盐酸盐、以及聚山梨酯，优选聚山梨酯20。糖例如海藻糖、甘露糖醇、麦芽糖或蔗糖也可以任选地被包含在这些组合物中。[0060]在另一个具体的实施方式中，在组合物中的荧光缀合物的浓度，基于靶向部分例如抗CEA单克隆抗体的含量如通过本领域已知的分光光度法或HPLC所测定的计算，为介于lmgmL和IOmgmL之间。[0061]本发明的又一方面提供了一种用于制备荧光缀合物的方法，其包括以下步骤a提供具有式III的荧光染料：其中Y在每次出现时独立地选自S03H、S03_和SO3M，其中M是一价阳离子，X、z和y独立地选自从1至8的整数，以及Z选自抗衡离子、氢、琥珀酰亚胺基、磺基琥珀酰亚胺基、以及硝基苯基；（b提供对肿瘤标志物具有亲和力的靶向剂；以及c偶联荧光染料与靶向剂。[0062]—价阳离子的实例包括，但不限于，钠、钾、或铵。在优选的实施方式之一中，Y选自SO3-和SO3Na。[0063]可以通过这样的制备方法获得包括偶联到靶向部分T的荧光染料部分F的本发明的荧光缀合物，其中部分F具有式I并且其中靶向部分T对肿瘤标志物具有亲和力。[0064]如在任何前述段落中所述缀合物本身的背景中所描述的关于靶向部分T和荧光染料部分F的相同选项和优选项也适用于在本方法中待使用的靶向剂和荧光染料。因此，靶向剂优选是包含缀合物的靶向部分T的化合物，且在本方法中使用的荧光染料优选为包含或产生缀合物的荧光染料部分F的化合物。靶向剂优选对肿瘤抗原具有亲和力，肿瘤抗原为例如癌胚抗原CEA。对CEA的亲和力可以是对CEA的已知表位中的任何一种的亲和力，例如G0LD-2表位。在特别优选的实施方式中，靶向剂是对CEA具有亲和力的嵌合单克隆抗体。[0065]对CEA具有亲和力的嵌合单克隆抗体mAb可以通过由已经用编码嵌合单克隆抗体的表达载体转染的CHO细胞表达来生产。优选地，表达载体包括编码抗体人恒定结构域和抗CEA抗体鼠可变结构域的核苷酸序列，优选具有如上所述的序列的可变结构域。[0066]可以类似于描述在US8,034,626中的方法和图Ia的反应方案来制备对制备缀合物有用的荧光染料。例如，荧光染料可以由包含必要的磺酸盐和烧基氧基取代基的两个假吲哚衍生物的缩合而合成，其中两个假吲哚衍生物中的一个是乙酰苯胺acetanilodo衍生物的形式。在一个实施方式中，假吲哚中间体可以由氨基芳香族前体经由以下步骤制备:重氮化还原步骤，接着是磺化、羟基化、与酮发生费歇尔环化得到假吲哚，羟基取代基的羧基烷基化以及与磺内酯发生季铵化步骤。[0067]在另一个实施方式中，荧光染料是式IV化合物：[0068]本发明的荧光染料可被激活，优选作为活性酯如，琥珀酰亚胺酯），用于与靶向部分T缀合。在一个实施方式中，使用本领域已知的共价偶联方法通过酰胺、酯、硫酯、二硫化物或氨基甲酸酯键将式I或式II的荧光染料偶联到靶向部分T。在本发明的另一个实施方式中，在靶向部分T是抗体、抗体片段或肽序列的情况下，优选经由靶向部分T的游离氨基经由酰胺键缀合荧光染料。[0069]本发明的另一个方面提供了荧光缀合物的体外用途，该荧光缀合物包含偶联到对肿瘤标志物具有亲和力的靶向部分T的荧光染料部分F，其中部分F具有式（I或式（II，或者提供了包含所述荧光缀合物的组合物的体外用途，其用于检测样本中的肿瘤细胞，或者用于诊断和或检测肿瘤。[0070]特别地，荧光缀合物可以用于检测肿瘤细胞和表达诸如CEA之类的肿瘤抗原的肿瘤。在这样的情况下，靶向部分T优选选自非肽配体、抗体、抗体片段、以及包含抗体的至少一个可变区的融合蛋白，例如如在任何前述的优选项和选项中所定义的。荧光缀合物可以用于检测肿瘤细胞或者可以通过对由患者的体液例如血清）或组织活检获得的样本进行体外测试用于诊断或协助诊断癌症疾病。优选地，肿瘤是实体组织肿瘤，例如由结肠、直肠、胃、肠、胆管、胰腺、食道、卵巢、乳腺、前列腺，肝脏或肺得到或衍生而来的。此外，荧光缀合物可以有助于监测肿瘤的存在或进展，例如，用于在切除手术和或化疗治疗后评估任何残余的肿瘤细胞或肿瘤组织。[0071]在另一方面，本发明提供如本文所述的缀合物和或包含该缀合物的组合物作为药物的用途。如本文所使用的，药物是指为任何医疗目的所施用的材料或产品，例如为诊断或治疗的目的，包括人类受试者或动物的疾病或病症的预防性治疗。特别地，本发明提供如本文所述的缀合物和或包含该缀合物的组合物作为诊断药或诊断试剂的用途。该用途包括对有需要的受试者单次或重复施用该缀合物或该组合物。在一个实施方式中，需要该缀合物或组合物的受试者是已经患有癌症或处于患癌症风险的受试者。[0072]本发明还提供了该荧光缀合物和或其组合物在检测表达肿瘤标志物的肿瘤的病灶中的用途或者用于确定患者体内的表达肿瘤标志物的肿瘤的位置的用途。该用途可对患有特征在于例如复发、转移或种植seeding的疾病进展的癌症的患者是特别有用的。这样的癌症进展可以导致肿瘤细胞或组织块分布较广。特别地，荧光缀合物或该组合物可以用于检测表达肿瘤标志物或肿瘤抗原的肿瘤的病灶或者用于确定该肿瘤的位置，该肿瘤标志物或肿瘤抗原即部分T对其具有亲和力的肿瘤标志物，优选位于细胞表面。如本文所理解的，术语病灶指限定肿瘤或可发展为肿瘤的病变并使其与周围正常组织区别开来的细胞群或细胞簇或组织。[0073]在优选的实施方式中，肿瘤表达CEA。在另一个优选的实施方式中，患者患有结肠直肠癌或胃肠癌。在这样的癌症的晚期表现中，患者可能患有腹膜转移癌，其中癌性肿瘤的广泛转移发生在腹膜腔内衬（lining上。在本发明的具体的实施方式中，包含式（I或式II的荧光染料部分和为嵌合单克隆抗体的靶向部分T的荧光缀合物被用于检测表达CEA的肿瘤的病灶或用于确定患者体内的表达CEA的肿瘤的位置。[0074]在肿瘤组织的手术切除过程中，外科医生依赖于视觉外观和触诊来区别肿瘤组织和正常组织。手术切除是完全或部分手术除去存在于患者的组织、结构或器官内的肿瘤组织。癌性或恶性肿瘤组织可能通常存在于裸眼不可见的小（例如，亚毫米大小的）结节或病变中。完全肿瘤切除往往对患者的预后非常关键，并且因此同样重要的是，在手术除去患者的肿瘤和或患者的肿瘤细胞减灭术治疗的过程中，外科医生能够正确地识别、区分恶性肿瘤组织与健康组织的边界和边缘并切除所述肿瘤组织，以及避免不必要地除去或破坏健康组织或结构。[0075]已经发现如上所述的荧光缀合物和或包含这样的缀合物的组合物在正在接受或已经接受手术切除表达肿瘤标志物的肿瘤的患者体内的切除边缘处的肿瘤细胞或肿瘤组织的检测中特别有用。如本文所理解的，术语切除边缘是指围绕肿瘤组织的组织的边缘或边沿。围绕所切除的肿瘤的组织的边缘正常应为非癌性组织，其和肿瘤一起被切除以确保充分除去所有的恶性肿瘤组织，然而如上所述，可能难以确定边缘的范围和或肿瘤组织与正常组织的范围。可选地，切除边缘也可理解为预期的切除边缘，其可根据本发明的方法的用途确定或修改。[0076]使用本发明的荧光缀合物或其组合物检测正在接受或已经接受手术切除表达肿瘤标志物的肿瘤的患者体内的切除边缘处或切除边缘附近的肿瘤细胞或肿瘤组织的方法，优选地其中肿瘤标志物为肿瘤抗原，该方法在术中和术后例如，肿瘤细胞减灭术有助于协助外科医生以便确保所有的肿瘤组织都被除去并确保可以得到干净的或阴性的边缘，即其中检测不到肿瘤细胞的边缘。在优选的实施方式中，切除手术针对表达或过度表达CEA的肿瘤。[0077]本发明以及如任何前述段落中所描述的荧光缀合物或组合物可以用于检测肿瘤细胞或肿瘤组织，例如检测肿瘤的病灶和或确定它们的位置，以及在患者的手术切除过程中或术后检测患者的肿瘤的切除边缘，其中患者患有结肠直肠癌、胃癌、胆道癌、胰腺癌、食道癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌或肺癌。待被检测或定位的肿瘤细胞或组织可以是表达CEA的癌或肉瘤的形式。优选地，荧光缀合物用于检测例如患有腹膜转移癌的患者体内的亚毫米大小范围内的肿瘤结节或病变。[0078]在用于检测或用于定位肿瘤细胞或肿瘤组织或用于在切除手术中或术后检测肿瘤的切除边缘的本发明的荧光缀合物或组合物的用途的具体实施方式中，该肿瘤是恶性胃肠肿瘤并且该荧光缀合物包含偶联到为针对CEA的G0LD-2表位的嵌合单克隆抗体的靶向部分T的式（I或优选式（II的荧光染料部分F，该靶向部分T包含Glm3同种异型的重链和km3同种异型的轻链，每条重链和每条轻链都包含至少一个小鼠IgGl可变结构域和至少一个人恒定结构域。该胃肠肿瘤可意指位于胃肠道的任何部分的肿瘤，例如在食道、胃、小肠、大肠、直肠、以及与消化相关的器官（如胰腺、肝和胆）的肿瘤，并且可以在亚毫米大小的范围内。针对这样的用途，特别优选是其中所述嵌合单克隆抗体包含SEQIDN0:4的可变轻链区和SEQIDNO:3的可变重链的缀合物。[0079]在用于检测或用于定位肿瘤细胞或肿瘤组织或用于在切除手术中或术后检测肿瘤的切除边缘的本发明的荧光缀合物的用途的另一个具体实施方式中，该肿瘤是恶性乳腺肿瘤并且所使用的该荧光缀合物包含偶联到为针对CEA的G0LD-2表位的嵌合单克隆抗体的靶向部分T的式I或优选式II的荧光染料部分F，该靶向部分T包含Glm3同种异型的重链和km3同种异型的轻链，每条重链和每条轻链都包含至少一个小鼠IgGl可变结构域和至少一个人恒定结构域。针对这样的用途，特别优选是其中所述嵌合单克隆抗体包含SEQIDNO:4的可变轻链区和SEQIDNO:3的可变重链的缀合物。如本文所使用的乳腺肿瘤可以意指位于与乳房或乳腺组织相关的任何组织中的肿瘤，任何组织包括腺或导管组织并且也可以包括例如在腋窝中发现的区域性的淋巴结。这样的肿瘤可以在亚毫米大小的范围内。[0080]在另外的方面，例如用于检测肿瘤的病灶以及确定它们的位置或者用于检测正在接受或已经接受手术切除肿瘤的患者体内的切除边缘处的肿瘤细胞或肿瘤组织的本发明的荧光缀合物或组合物的应用包括以下步骤：a向患有肿瘤的患者施用该缀合物或组合物；b开始对所述患者进行肿瘤切除手术；c用波长为约660至700nm的光照射正接受切除手术的患者的切除位点处的组织，其中在步骤a后，在不超过约96小时或72小时的时间段内执行步骤b。[0081]替代地，本文所述的缀合物或组合物的所有用途也可以被表示为方法，特别是用于诊断或治疗患者的方法。例如，在检测表达肿瘤标志物的肿瘤的病灶或用于确定患者体内的表达肿瘤标志物的肿瘤的位置中的用途也可以理解为检测表达肿瘤标志物的肿瘤的病灶或确定患者体内的表达肿瘤标志物的肿瘤的位置的方法。[0082]作为另一种替代方案，本文所述的缀合物或组合物的所有诊断用途和或治疗用途也可以表示为缀合物或组合物在制备用于有助于指定的诊断用途和或治疗用途的药物或诊断剂中的用途。[0083]在治疗患有肿瘤的患者的方法的步骤a中，可以通过本领域已知的注射或灌注方法来施用该荧光缀合物或其组合物。特别地，可以通过静脉内，腹膜内，皮下或肌内注射或灌注给药方式来施用该缀合物或组合物。替代地，可以通过吸入或局部给药方式来施用该荧光缀合物或其组合物。在这种情况下，局部施用包括直接施用到皮肤或施用到外部或内部粘膜。吸入可以有助于治疗在其呼吸系统（例如在肺中）患有肿瘤的患者。当局部施用时，荧光缀合物或其组合物优选以喷雾的形式施用。[0084]优选以0.1至5Omg、或5mg至10Omg的剂量向患者施用该缀合物。在这种情况下，剂量是指在例如手术或诊断程序之前施用的缀合物和非缀合的抗体若存在的话的量。该剂量可以任选被划分并间隔服用。在通过注射施用至患有结肠直肠癌、胃癌、胆道癌、胰腺癌、食道癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌或肺癌并正在接受切除手术的患者的情况下，剂量优选为约0.2至15mg，例如0.5至IOmg、或5至15mg。优选地，所施用的剂量至少为5mg。这些剂量范围特别适用于具有如上所述的优选的取代度的缀合物和组合物。[0085]优选地，在步骤a后，在不超过约96小时的时间段内执行步骤b。在其它实施方式中，在完成步骤a后，在不超过72小时、或不超过48小时、或不超过36小时、或不超过24小时、或不超过12小时的时间段内执行步骤b。[0086]在该方法的步骤c中，以波长在近红外区域内的光照射正接受切除手术的患者的切除位点处的组织。在步骤c中使用的用于照射的光学设备优选靶向荧光缀合物的激发波长，该激发波长为优选介于660至700nm之间的波长。在该方法的实施方式中，通过以680nm的激发波长照射正接受切除手术的患者的切除位点处的组织来执行步骤c。[0087]在治疗患有肿瘤的患者的方法的特别优选的实施方式中，该肿瘤是恶性胃肠道肿瘤，并且该荧光缀合物包含偶联到为针对CEA的G0LD-2表位的嵌合单克隆抗体的靶向部分T的式I或优选式Π的荧光染料部分F，该靶向部分T包含Glm3同种异型的重链和km3同种异型的轻链，每条重链和每条轻链都包含至少一个小鼠IgGl可变结构域和至少一个人恒定结构域。[0088]在本发明的又一方面，在上述实施方式的任何一个中所描绘的荧光缀合物也可以包含或掺入放射性同位素、放射性示踪标记或放射性示踪剂。可以例如通过直接对缀合物进行放射性标记或通过在缀合之前向靶向部分T应用放射性标记来得到经放射性标记的荧光缀合物。该经放射性标记的荧光缀合物及其组合物可以在治疗应用和或诊断应用中用作药物。在一个实施方式中，向其施用该经放射性标记的缀合物或其组合物的受试者是已经患有癌症或处于患癌症风险的受试者。实施例实施例1_抗CEA嵌合单克隆抗体的制备基因设计与合成[0089]分别编码伪鼠（nativemurineVh和Vl可变结构域的以下核苷酸序列A和B是从鼠抗CEA抗体杂交瘤得到的，并且从头合成并克隆到宿主pVVS串联表达载体中。这些序列并入一些核苷酸修饰（不改变天然蛋白序列）以确保在CHO细胞中优化的克隆和优化的表达。KpnI和NheI限制位点被分别插入编码Vh结构域的序列的5’端和3’端处。类似地，两个限制位点序列Sail和BSiWI被分别插入编码Vl结构域的序列的5’端和3’端处。㈧重链（SEQIDN0:1:GGTACCGCCGCCACCATGGACTCCAGACTGAACCTGGTGTTCCTGGTGCTGATCCTGAAGGGCGTGCAGTGCGACGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCTCCAGAAAGCTGTCTTGTGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCAACTTCGGCATGCACTGGATCCGGCAGGCCCCTGAGAAGGGCCTGGAATGGGTGGCCTATATCTCCGGCGGCTCCTCCACCATCTACTTCGCCGACACCCTGAAGGGACGGTTCACCATCTCCCGGGACAACCCCAAGAACACCCTGTTTCTGCAGATGACCTCCCTGCGGAGCGAGGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAGAGACTACTACATCAACAACTACTGGTACTTCGACGTGTGGGGCGCTGGCACCACCGTGACAGTGTCATCTGCTAGC⑶轻链（SEQIDN0:2:GTCGACGCCGCCACCATGGAATTTCAGACCCAGGTGTTCGTGTTCGTGCTGCTGTGGCTGTCTGGCGTGGACGGCGACATCGTGATGACCCAGTCCCAGAAATTCATGTCCACCTCCGTGGGCGACCGGGTGTCCATCACATGCAAGGCCTCTCAGAACGTGCGGAGCGCCGTGGCCTGGTATCAGCAGACACCTGGCCAGAGCCCCAAGGCCCTGATCTACCTGGCCTCCAACAGATACACCGGCGTGCCCGATCGGTTCACCGGCTCTGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCAACGTGCAGTCCGAGGACCTGGCCGACTACTTCTGTCTGCAACACTGGAACTACCCCCTGACCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGGAACTGAAGCGTACG载体合成[0090]使用SallBsiWI和KpnINhel通过连续的双酶切来制备被选择用作Vh和Vl基因的宿主载体的PVVS串联载体。这种表达载体编码重链的人IgGl同种异型Glm3和人IgGl同种异型Km3的恒定结构域的序列。该载体还包括以下的功能元件:pCMV启动子用于重链和轻链两者）、启动子和用于翻译的起始密码子之间的嵌合内含子、PUC复制起点、BGH聚腺苷酸化位点、HS4TKpolyA绝缘子、SV40启动子以及在载体扩增过程中和转染后用于细胞选择的卡那霉素新霉素耐药基因。酶切后，使用凝胶纯化回收所得的载体骨架片段。[0091]包含编码如上所述的伪鼠Vh和I结构域的合成的Vh和I基因插入物的插入片段是分别使用KpnINhel和SallBsiWI从它们各自的PVVS串联表达载体提取的并通过凝胶纯化回收的。[0092]将所有回收的片段汇集在一起并连接以产生用于转染的最终载体。转染选择[0093]由上述载体转染的CHO细胞来自从欧洲细胞培养物保藏中心ECACC得到的CHO无蛋白质）细胞系（编号#00102307，批次02K008。这种细胞系，最初是由ECACC于1985年获得，是从仓鼠卵巢组织得到的并且最初由Puck等人（1958建立的亲本CHO细胞系的亚克隆。[0094]从ECACC小瓶得到的库被命名为Bkl998。使细胞适应在没有胎牛血清的情况下生长，然后通过有限稀释法克隆。根据生长性质和转染能力选择亚克隆PF3B9并将其储备入库（细胞库Bk4164。用于产生用于抗体的抗体生产的细胞基质的细胞库Bk4164是由Bk21146的小瓶制备的。[0095]最初使从亚克隆3B9得到的CHO细胞在添加有4mML-谷氨酰胺的EX-CELL®ACFCHO培养基中解冻并在37°C在5%CO2的湿润气氛中在回转式震荡的条件下生长。在第五次传代后2天进行转染。通过用SWaI限制酶酶切使如上制备的表达载体线性化。用IOygDNA通过Nucleofection™Amaxa—式三份地进行转染并在不震荡的情况下在37°C、5%⑶2下培育3天。在3天的回收期后，通过加入遗传霉素（0.5gL启动选择。不使用DNA经受Nucleofection™条件的细胞被用作抗生素选择的对照。[0096]在细胞活力达到至少80%后在遗传霉素选择压力下进行有限稀释克隆。针对3个转染池中的每一个，以0.5个细胞孔的目标细胞密度接种四十个96孔板。从这些池产生了来源于单细胞的475个克隆。在培养约18天后，通过ELISA评价抗体浓度以选择150个最佳生产的克隆以便在24孔板中扩增。在细胞达到足够的密度后，将这些转移到6孔板中。根据10天分批动力学和如通过用于摇瓶扩增的快速酶联免疫吸附试验评估的mAb生产来进行进一步的选择。基于补料分批动力学和如通过蛋白AHPLC评估的mAb生产（扩增到2L生物反应器的进一步选择导致选择出用于抗体生产的lead克隆。抗体生产[0097]使lead克隆的细胞解冻并将其转移到新生培养基EX-CELL®ACFCHO培养基，4mML-谷氨酰胺）。在接种在75cm2烧瓶中后，测定活细胞密度并在离心后使细胞团块以2xl06细胞毫升的密度再悬浮在培养基中。细胞在37°C±TC、8%±2%⑶2中在回转式震荡下生长。从第2天，培养物在增大容量的摇瓶中在EX-CELL®ACFCHO培养基、4mML-谷氨酰胺中在37°C±1°C、8%±2%CO2中在回转式震荡下扩增。在每次传代评估细胞活力、密度和生长并经由显微观察法检测出没有污染物。在第17天，7次传代后，使摇瓶的内容物汇集。对细胞进行计数并将其用于以〇.5xl06活细胞毫升的密度以7L的体积接种两个15-L的生物反应器。细胞在补料分批培养物中在EX-CELL®ACFCHO培养基、5mML-谷氨酰胺、0.2%普朗尼克中在37°C下，在pH和氧调节下培养20天。根据需要加入BalanCD™CHOFeed3、葡萄糖和L-谷氨酰胺。每日评估细胞密度、活力、pH;也从第6天起每日取样以确定葡萄糖浓度并从第I〇天起每日取样以评估抗体浓度蛋白AHPLC。[0098]在第20天通过使来自每个生物反应器的细胞悬浮液通过三个并联深度过滤器并接着直接通过〇.2μπι过滤器进行澄清。将经澄清的批量收获物收集起来并通过蛋白AHPLC测试抗体含量，通过蛋白印迹分析鉴定重组蛋白，测试生物负荷、支原体和螺原体污染。将该批量收获物分装在2LPET瓶中并于-70°C至-90°C下储存。[0099]以如下方式对批量收获物进行进一步处理:使经澄清的批量收获物在15-25Γ下解冻24小时，并将各个瓶子的内容物收集起来并通过磁力搅拌使其分布均匀。将收集的批量收获物首先在用50mM磷酸钠、300mMNaCl、pH7.0的缓冲液平衡过的蛋白A亲和层析柱上纯化。在用平衡缓冲液并接着用25mM磷酸钠、pH7.0的缓冲液洗涤之后，使用25mM乙酸钠pH3.5的缓冲液洗脱抗体。收集抗体峰基于在280nm处的洗脱液吸光度并在pH调节步骤之前将抗体洗脱液保持在15-25°C。[0100]使用〇.2M柠檬酸将抗体洗脱液的pH调节到3.8并在15-25°C同时搅拌下培养60-65分钟。在用0.5MNa2HPO4中和到pH6.5之后，在0.2μπι过滤器上过滤该溶液，收集并于2-8°C下存储。[0101]使用磺酸酯配体树脂通过阳离子交换层析进一步纯化PH灭活抗体溶液。使用0.2M柠檬酸将溶液的pH调整到5.0并将其加载到预先用25mM乙酸钠、pH5.0的缓冲液平衡的柱上。在用平衡缓冲液洗涤之后，使用25mM乙酸钠、195.2mMNaCl、pH5.0的缓冲液洗脱抗体。基于在280nm处的吸光度收集。[0102]使用在24mM磷酸钠、53.4mMNaCl，pH7.0的缓冲液中平衡的季铵离子交换膜通过阴离子交换层析进一步纯化所得的抗体溶液。使用0.5MNa2HPO4将阳离子交换层析洗脱液的pH调整到pH7.0并用25mM磷酸钠、pH7.0的缓冲液稀释以达到IlmScm的最终电导率。将溶液加载到所述膜上并基于在280nm处的吸光度在流过物中收集抗体。使收集的溶液通过〇.2μπι过滤器过滤并进入无菌、一次性使用的PET容器中并于2-8°C下储存。[0103]然后使用30kDA截止膜用IOmMTriS-HCUpH7.2的缓冲液通过超滤和渗滤来浓缩抗体溶液。收集过滤的渗余物并于15-25°C下储存。[0104]然后用IOmMTriS-HClpH7.2的缓冲液将渗余物稀释至111^1^并使其通过0.24111过滤器，接着通过预先用同样的缓冲液平衡的纳滤Planova15N膜）。将滤液保存在15-25°C。在最后的步骤中，使所得的纯化的批量抗体溶液过滤通过0.2μπι过滤器，使其分装在无菌PET瓶中并于-70°C至90°C下存储。[0105]在每个纯化步骤中取样以便通过蛋白AHPLC进行抗体浓度测定。[0106]通过诸如UPLC-UV-MS之类的本领域已知的方法表征所得的抗体产物。如通过MALDI-T0F质谱所测定的，抗体的分子量是148.6kDA。实施例2-式IV的荧光染料的制备乙酰苯胺中间体⑶：[0107]使磺化假吲哚A与1，4-丁烷磺内酯反应。使所得的中间体与β-丙烯醛缩苯胺反应以得到乙酰苯胺中间体Β。中间体化合物⑶：[0108]中间体D经由威廉逊缩合制备以形成假吲哚前体C的羧基烷基氧基衍生物，接着用1，4_丁烷磺内酯季铵化。假吲哚C由胺化芳族前体的重氮化还原，接着磺酸盐形成、羟基化以及与酮发生费歇尔环化得到。式IV的荧光染料[0109]化合物B与吲哚化合物D缩合。将所得的二碳花菁化合物用N-羟基琥珀酰亚胺NHS活化以提供式IV的荧光染料。实施例3-荧光染料缀合到抗CEA嵌合mAb[0110]使实施例1的经纯化的抗体在15-25°C下解冻约24小时。用30kDa截止膜超滤渗滤来执行缓冲液交换〇.IM磷酸钠碳酸钠，pH9.3。通过在15-25°C下过夜搅拌将荧光染料实施例2的式（IV以2.25mgmL的浓度溶解在DMF中。将DMF加入到抗体的溶液使用0.IM磷酸钠碳酸钠缓冲液稀释到lmgmL的最终浓度，pH9.3中以得到10%vv的最终浓度。然后将荧光染料的溶液以20mLmin的流速以4.5摩尔过量加入到抗体溶液中。在环境温度下在回转式震荡下培养所得的反应混合物约45分钟。[0111]首先使用补充有10%vvDMF的PBS-135mML-精氨酸执行30kDa截止膜第二超滤渗滤步骤，接着配制缓冲液PBS-135mM-L-精氨酸以除去DMF。然后使用配制缓冲液将渗余物稀释至1.0-1.lmgmL的最终浓度如通过分光光度分析所测定的并过滤0.2μηι。[0112]将所得的荧光缀合物填充到盖有高密度聚乙烯帽的0.5LPET瓶子中，将其插入到琥珀色塑料袋并于-20°C±5°C下储存。[0113]荧光染料抗体的摩尔比是通过分光光度法测定的。观察到1.5-1.6的平均缀合比率。[0114]替代地，可以用DMSO作为缀合溶剂进行荧光染料到抗体的缀合。将荧光染料以4摩尔过量加入到具有10%vv的DMSO的最终反应浓度的所述抗体具有lmgmL的溶液浓度），在5至120分钟之间的反应时间下得到如通过分光光度法所测定的平均缀合比率介于1.5-1.6之间的缀合物。相比于在DMF中在类似浓度和条件下制备的缀合物，在DMSO中制备的这些荧光缀合物就所得到的荧光发射强度、光致漂白和量子产率测量而言，没有观察到显著差异。实施例4-调配物[0115]用于如根据实施例3制备的荧光缀合物的调配物的缓冲液也可以根据需要适合于本发明范围内的用途和方法。例如，可以优选地在包含IOmMKH2P〇4VWRProlaboIOmM梓檬酸三钠柠檬酸Fluka、300mM精氨酸HClSigma、0.02%wv吐温20Merck的缓冲液中配制荧光缀合物，其中PH被调节到6.0。实施例5-缀合物表征荧光研究[0116]在680nm的激发波长（用光学设备Fluobeam700所提供处测定式（IV的荧光染料和如根据实施例3制备的荧光缀合物的猝灭、光致漂白和荧光量子产率，该波长与临床应用相关。[0117]制备在0.05_500μΜ的范围内的各种浓度的于DMF中的式（IV的荧光染料的样品和于PBS135mM-精氨酸中的实施例3的荧光缀合物的样品。[0118]使用荧光计在猝灭（S卩，荧光染料本身在一定浓度下自抑制所发射的荧光检测之前测定荧光染料的最大荧光强度和最大浓度。[0119]在减去缓冲液的背景荧光值之后得到荧光值。荧光缀合物在观察到猝灭之前，最大荧光强度被测定为70AU任意单位），最大浓度为5μΜ。荧光染料的最大荧光强度被测定为120AU，且最大浓度为ΙΟμΜ。[0120]计算浓度为5μΜ的样品在680nm的临床波长处的作为衡量吸收光转化为发射光的效率的量子产率。对于式IV的非缀合的荧光染料，量子产率被测得为0.26，而对于缀合荧光染料，观察到0.15的量子产率，相当于只有43%的降低。[0121]就临床应用而言，特别是在肿瘤切除手术过程中，荧光缀合物的荧光染料应保持稳定和充足水平的荧光强度持续尽可能长的时间段。[0122]也评估了荧光染料和缀合物，以及市售的碳花菁荧光染料AlexaFlu〇r®680在680nm的临床激发波长处的光致漂白或荧光活性的损失，该市售的碳花菁荧光染料是具有与式（IV的荧光染料的最大吸光度和发射波长相似的最大吸光度和发射波长679nm的最大吸光度和702nm处的最大发射）的远红外发光染料。也评估了以类似于实施例3中描述的缀合方法制备的实施例1的抗CEA嵌合单克隆抗体和AlexaFluor®680的缀合物（得到约1.46的平均荧光染料与抗体比率的光致漂白。于PBSIx中制备这些缀合物的样品。[0123]制备浓度为5μΜ的这些样品并将其暴露于680nm处的光。以0h、30min和lh、1.5h和2h的光暴露时间间隔测量发射的荧光强度。表1:随着时间的推移的荧光发射λΘΧ=680ηπι[0124]在连续暴露于680nm的临床波长下30分钟后，荧光缀合物的荧光为大约70%，而缀合到相同抗体的市售染料发射的荧光仅为约9%。1小时后，市售染料以及其缀合物的荧光强度几乎为零，而荧光缀合物和未缀合的荧光染料的荧光仍然被保持。组织交叉反应性[0125]使用标准免疫组织化学技术在来源于三个不相关个体的42个人冷冻组织和血涂片的面板上进行使用生物素标记的缀合物的根据实施例3中制备的荧光缀合物的组织交叉反应性研究。发现抗体缀合物的特异性染色局限于消化道和几种其它组织，上皮成分，主要在顶端细胞边界或腔侧，已在文献中描述来表达证实仅靶向结合抗体的CEA。抗原亲和力[0126]在BIAC0RE3000设备上使用表面等离子体共振SPR也测定了如在实施例3中制备的焚光缀合物对祀癌胚抗原的亲和力。癌胚抗原经由硫醇基偶联到CM5芯片（SurfaceThiolCouplingGEhealthcare;Instruction22-0618-10AB。使用流中的6种不同浓度从50nM到1.5nM的实施例1的嵌合单克隆抗体、单克隆抗体m511实施例1的嵌合单克隆抗体的可变区所依据的原始鼠抗体）和荧光缀合物测量了结合和离解速率。使用Bia软件和Bia评估程序进行数据采集和参数计算。实施例1的嵌合单克隆抗体对CEA的亲和力3.27Χ1ΓηηΜ保持非常接近于亲本鼠511抗体对CEA的亲和力3.82Χ1ΓηηΜ，并且在其用近红外荧光染料标记之后没有改变实施例3的荧光缀合物的KD被测量为3.21Χ1ΓηηΜ。实施例6-体内研究[0127]在表达人CEA的四种不同鼠模型体内评估了实施例3的荧光缀合物的功效。[0128]在根据既定协议建立的LS-174T腹膜转移癌小鼠模型中使用单光子发射计算机断层摄影（SPECT通过放射性测量评估荧光缀合物的组织分布。使免疫抑制NMRI裸鼠经由腹腔注射过度表达CEA的LS-174T细胞而经受LS-174T细胞移植。10天后给小鼠静脉注射30和50yg的125I放射标记的荧光缀合物其是通过使荧光缀合物与放射性标记碘化试剂一起培养来制备的）。在用50yg的缀合物处理48小时后小鼠的可视化（使用Nano-SPECT-CTBioscan®相机进行）显示放射性基本上局限于存在于小鼠的腹腔内的肿瘤结节。这一结果与在动物处死后得到的不同器官中放射性的生物分布测量相对应。[0129]也通过腹腔注射过度表达CEA的LS-174T人肿瘤细胞之后向患有晚期腹膜转移癌的免疫抑制NMRI裸鼠注射非放射标记的荧光缀合物进行体内荧光可视化研究。在癌病发展12天以后，使动物静脉接受20或30yg的荧光缀合物。在48小时后，处死动物并使用最优探针分别在680nm的激发波长和700nm的发射波长处显现荧光。在两种剂量下，荧光分布明显地局限于腹膜肿瘤，使得能够得到腹膜腔包括胰腺的区域图1，A列，在700nm处显现的原位肿瘤）中微结节的明显可视化。小于Imm且重量小于lmg0.2-1.7mg的结节是可识别并发荧光的（图1，展示与在A列描述的相同动物的个别切除肿瘤的B列，在700nm处显现）。向健康动物注射所述荧光缀合物和作为对照的非相关的荧光缀合物缀合有PX抗体，即，从鼠骨髓瘤M0PC21纯化的IgGl单克隆抗体渗考K^hler等人，EurJImmunol19766292，并没有引起任何特异性染色。[0130]值得注意的是，荧光缀合物不管肿瘤结节的位置如何都能够使过度表达CEA的肿瘤结节可视化，从而模拟临床状况。[0131]使用基于表达人CEA的人结直肠癌的原位小鼠模型的模型（Tseng等人，Vis.Exp.200710484。在六周龄CDl-FOxnlnu免疫抑制雌性小鼠的背部4个位点皮下注射过度表达CEA的HT29细胞以诱导皮下人结肠肿瘤发展。然后移除小肿瘤片段直径约3mm并移植到动物的盲肠壁以诱导原位肿瘤的发展。稍微破坏盲肠壁以诱导免疫反应并有利于肿瘤细胞浸润。在这些肿瘤发展后，向动物静脉注射30yg的根据本发明的荧光缀合物或具有非相关的PX抗体的荧光缀合物，作为对照）。在注射〇、4、24和48小时后使用PEARL成像系统Li-CorBiosciences测量皮下肿瘤或使用FLARE术中成像系统Curadel测量原位肿瘤在近红外700nm的荧光信号。[0132]结果，在皮下和原位两个位置处的肿瘤在700nm处的术中免疫光检测都被清楚观察到分别为图2A和图2B。皮下肿瘤的荧光是如此高水平以致于在注射抗体48小时后通过动物的皮肤可见荧光（图2A，A排）。[0133]使用本发明的荧光缀合物也观察到过度表达CEA的肝转移人肿瘤。将LS-174T细胞或LoVo人结肠腺癌细胞注射到如在公开协议参见Tibbetts等人，Cancer1993,（71，315_21中所述的免疫抑制Balbc裸鼠的脾脏中。这两种细胞类型均过度表达CEA并诱导肝转移癌的发展，但是遵循不同的模式。LoVo细胞诱导许多小转移灶穿过肝脏的表面播散，而LS-174T细胞诱导仅少量较大转移灶的形成。在700nm处荧光可视化48小时之前使小鼠受试者接受30yg的荧光缀合物。作为对照，对小鼠注射基于PX抗体的非相关的缀合物。发现裸眼不可觉察（即裸眼不可见的）的非常小尺寸的肿瘤结节，例如，肝脏的表面上的微转移灶，可在注射有所述荧光缀合物的小鼠中的限定这些肿瘤的轮廓的荧光下检测到。此外，证实了不论何种肿瘤结节的细胞系，均能使肝转移灶可视化。对照组没有观察到肿瘤的检测。[0134]用胰腺肿瘤的模型进行了类似的研究。在该研究中使用六周龄的无胸腺CDl-Foxnlnu免疫抑制雌性小鼠，并且在肿瘤接种和成像程序过程中用异氟烷麻醉。如在Kim等人，Nat.Pr〇t〇c.，2009,4，1670-80中所描述的获得原位胰腺肿瘤。动物的脾脏和胰腺均通过横向切除而横向外部化以暴露胰腺的整个长度。细针平行于脉管系统插入胰腺，通过该细针注射500000BXPC-3-luc2细胞萤光素酶转染的细胞系）。通过生物发光成像BLI每周监测原位肿瘤的生长，其是通过在使用IVIS光谱成像系统（PerkinElmerLifeSciences成像之前IOmin腹膜内注射150mgkg的总体积为50yL的于PBS中的D-焚光素溶液SynChem，Inc来执行。一旦经由BLI检测到原位肿瘤，则通过动物的尾静脉静脉注射30yg的荧光缀合物。在注射48小时后将动物处死，并在700nm处的近红外下检查。观察到原位胰腺肿瘤的清楚可视化。在注射非特异性缀合物或单独的荧光染料的对照小鼠中没有观察到可视化。[0135]信号与背景比是使用采用PearlImpulse小动物荧光成像系统（LI-COR测量的NIR荧光信号计算的。将图像进行归一化并选择感兴趣区域以便分析。将平均肿瘤特异性信号除以来自周围组织的平均信号以提供平均信噪比。使用采用邦费罗尼校正的两因素重复测量方差分析评估不同组在所有时间点的显著信号与背景比。与信号与背景比值接近1的游离荧光染料或非相关的对照缀合物相反，荧光缀合物的信号与背景比大于3。[0136]用苏木精-伊红染色的BXPC-3皮下肿瘤的切除的免疫组织化学分析证实荧光缀合物被结合到肿瘤，与仅表现为围绕肿瘤细胞的非特异性染色的对照组相反。[0137]总之，发现例如根据实施例3制备的荧光缀合物不论肿瘤的位置以及肿瘤的起源即，结肠直肠对比胰腺如何都能实现过度表达CEA的肿瘤结节的体内识别，证实了荧光缀合物的靶向能力。观察到高水平的信噪比，能够实现裸眼不可见的非常小的结节的检测。[0138]评估静脉施用荧光缀合物的安全性和毒性的药理学研究也证明对Wistar大鼠的中枢和外周神经系统没有显著不利影响，对Beagle犬的心血管和呼吸功能也没有显著不利影响，并证明大鼠很好地耐受高达40mgkg每天85倍的预期临床剂量）的经测试的最大剂量水平的缀合物以及犬很好地耐受5mgkg10倍的预期临床剂量）的经测试的最大剂量水平的缀合物。实施例7-临床研究a腹膜转移癌-评估实施例3的缀合物在患有消化道起源的腹膜转移癌转移性肿瘤）的15个人患者中的安全与性能的临床研究。[0139]通过静脉注射施用5到15mg范围内剂量的实施例3的荧光缀合物。初步结果表明在任何这些剂量中均没有观察到不良反应。b结肠直肠癌和胰腺癌-评估实施例3的荧光抗体缀合物在患有直肠癌或胰腺癌的30个人患者中的安全与性能的临床研究。[0140]进行手术48小时之前使用静脉注射5mg剂量的荧光缀合物的研究。在迄今研究的患者中，没有报道在给药过程中或给药后不久的不良反应。总之，没有观察到生命体征与基线值相比在临床上的显著变化。[0141]初步结果显示在疑似肿瘤位点处有非常明显的荧光定位。使用配置以适用于荧光缀合物的设置的Artemis开放成像系统QuestMedicalImaging进行术中可视化。[0142]在一个胰腺癌患者中，使用荧光缀合物导致位于通常基于单独的视觉检查和触诊会被认为是围绕局限于胰腺体中的原发肿瘤的无肿瘤切除边缘（即导致保留肿瘤组织）的区域中的肿瘤细胞的识别（图3-如通过单独的视觉检查和触诊确定而建议的切除边缘由虚线表示，该边缘会太靠近肿瘤组织，肿瘤组织的主要部分由点线表示。如通过荧光确定而建议的切除边缘由实线表示）。由于许多腹膜转移瘤的存在，仅进行探查和分期，即仅切除转移瘤以在手术室的后台上进行活检和进一步分析。荧光缀合物提供病灶的明确的分界以及无论在体内还是在切除后体外的切除肿瘤中的转移灶的清晰边缘图3，A排:在白光下和在荧光叠加图像下体内转移灶的图像；图3，B排:在白光下和在荧光叠加图像下体外切除的转移灶的图像）。[0M3]在以下施用荧光缀合物的另一个胰腺癌患者中观察到类似的结果。观察到明确界定疑似肿瘤的荧光，该肿瘤位于胰头附近。[0144]在确诊为大肠癌的患者中，在切除前48小时施用5mg剂量的荧光缀合物。该剂量耐受性良好，没有观察到不良反应。在怀疑转移灶的髂旁左侧淋巴结处检测到界定转移灶的明确的荧光信号。成功进行切除。[0145]也对患有局部晚期直肠癌的患者施用5mg剂量的荧光缀合物。该剂量耐受性良好，没有观察到不良反应。进行腹腔镜低位前切除术。切除的直肠组织在手术室后台进行可视化。观察到切除的组织中清晰界定的肿瘤组织。

权利要求：1.一种荧光缀合物，其包括偶联到靶向部分T的荧光染料部分F，其中部分F具有式I:其中Y在每次出现时独立地选自s〇3h、s〇3，s〇3m，其中M是一价阳离子；x、z、和y独立地选自1至8的整数；以及其中部分T对肿瘤标志物具有亲和力。2.根据权利要求1所述的缀合物，其中Y选自SO3IPSO3Na。3.根据权利要求1或2所述的缀合物，其中部分F具有式II:4.根据权利要求1至3中任一项所述的缀合物，其中所述肿瘤标志物是肿瘤抗原。5.根据权利要求4所述的缀合物，其中所述肿瘤抗原是癌胚抗原CEA。6.根据任意前述权利要求所述的缀合物，其中部分T选自抗体、抗体片段和包含至少一个抗体的可变区的融合蛋白；并且其中所述抗体任选是嵌合单克隆抗体mAb。7.根据任意前述权利要求所述的缀合物，其中所述部分T是结合到CEA抗原的一个或多个表位的嵌合单克隆抗体。8.根据权利要求7所述的缀合物，其中部分F具有式（II，并且其中所述嵌合单克隆抗体针对CEA的G0LD-2表位，其包含Glm3同种异型的重链和km3同种异型的轻链，每条重链和每条轻链都包含至少一个小鼠IgGl可变结构域和至少一个人恒定结构域。9.根据权利要求8所述的缀合物，其中所述嵌合单克隆抗体包含SEQIDN0:4的可变轻链区和SEQIDNO:3的可变重链。10.根据权利要求1至5中任一项所述的缀合物，其中所述部分T是非肽配体。11.根据任意前述权利要求所述的缀合物，其中η个部分F被偶联到一个部分T，并且其中η是选自1至4的整数。12.—种包含任意前述权利要求所述的缀合物的组合物，其中所述组合物任选地a是无菌的并包含缓冲水溶液和L-精氨酸，和或b包含包括没有偶联到部分F的部分T的化合物。13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述组合物中的所述缀合物的平均缀合度为约0.5至3。14.一种用于制备荧光缀合物的方法，其包括以下步骤a提供具有式III的荧光染料：其中Y在每次出现时独立地选自S03H、S〇3_和SO3M,其中M是一价阳离子；x、z、和y独立地选自1至8的整数；以及Z选自抗衡离子、氢、琥珀酰亚胺基、磺基琥珀酰亚胺基、以及硝基苯基；b提供对肿瘤标志物具有亲和力的靶向剂；以及c偶联所述荧光染料与所述靶向剂。15.根据权利要求14所述的方法，其中Y选自S03_和S03Na。16.根据权利要求14或15所述方法，其中所述靶向剂是对CEA具有亲和力的嵌合单克隆抗体，和或其中所述荧光染料是式IV的化合物：17.根据权利要求1至11所述的缀合物或者根据权利要求12至13所述的组合物的体外用途，其用于检测样本中的肿瘤细胞或用于诊断和或检测肿瘤。18.根据权利要求1至11所述的缀合物或者根据权利要求12至13所述的组合物，其用作药物或诊断剂。19.根据权利要求1至11所述的缀合物或者根据权利要求12至13所述的组合物，其用于a检测表达所述肿瘤标志物的肿瘤的病灶或用于确定患者体内的表达所述肿瘤标志物的肿瘤的位置，和或b检测正接受或已经接受表达所述肿瘤标志物的肿瘤的切除手术的患者体内切除边缘处的肿瘤细胞或肿瘤组织。20.用于权利要求18或19的用途的缀合物或组合物，其中所述用途包括以下步骤a向患有肿瘤的患者施用所述缀合物或组合物；b开始对所述患者进行肿瘤切除手术；c用波长为约660至700nm的光照射正接受所述切除手术的所述患者的切除位点处的组织，其中在步骤a后，在不超过约96小时的时间段内执行步骤b。21.用于权利要求18至20中任一项的用途的缀合物或组合物，其中所述肿瘤是结肠直肠癌、胃癌、胆道癌、胰腺癌、食道癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌或肺癌。22.用于权利要求21的用途的缀合物或组合物，其中所述肿瘤是恶性胃肠道肿瘤，并且其中所述缀合物是根据权利要求8或9所述的缀合物。23.用于权利要求18至22中任一项的用途的缀合物或组合物，其中所述缀合物或组合物是通过局部，吸入，或静脉内，腹膜内，皮下，或肌内注射或灌注施用的。

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