申请/专利权人：中国农业科学院特产研究所

申请日：2018-04-17

公开（公告）日：2021-04-13

公开（公告）号：CN108535169B

主分类号：G01N15/10(20060101)

分类号：G01N15/10(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.04.13#授权;2018.10.16#实质审查的生效;2018.09.14#公开

摘要：本发明涉及单细胞检测领域，具体而言，涉及一种细胞内pH值pHi检测方法。所述方法包括：1.将被检细胞与细胞膜通透的、pH敏感性的荧光染料共孵育，将荷载有所述荧光染料的所述待检细胞置于控气、控温设备中的缓冲液中，在灌流给药系统的辅助下，使用能够实时监测细胞荧光变化的装置记录不同处理对应的细胞荧光强度数据；2.使用不同已知pH的校准液处理细胞，建立细胞荧光强度‑细胞pHi相关数据的标准曲线，将所述细胞荧光强度数据代入所述标准曲线中，得到单细胞pHi。该方法在不损伤细胞的情况下可长时间、实时地监控单个或者多个细胞pHi的变化，并且可重复性好，适用于各种大小细胞的pH的检测。

主权项：1.一种细胞内pH值检测方法，其特征在于，包括：1.将被检细胞与细胞膜通透的、pH敏感性的荧光染料共孵育，充分洗脱荧光染料后将荷载有所述荧光染料的待检细胞置于控气设备、控温设备中的缓冲液中，在灌流给药系统的辅助下，使用能够实时监测细胞荧光变化的装置记录不同处理对应的细胞荧光强度数据；所述共孵育的体系中不含有牛血清白蛋白、血清或者聚乙烯醇，且所述孵育在表面光滑、不易沾粘细胞的容器中进行；所述缓冲液不含有牛血清白蛋白、血清或者聚乙烯醇所述控气设备包括CO2检测装置，所述控温设备为加热板；所述灌流给药系统包括细胞灌流浴槽，所述细胞灌流浴槽固定于所述加热板之上，所述细胞灌流浴槽和所述加热板之间还设置有盖玻片，所述盖玻片易吸附细胞使监测细胞荧光变化过程中细胞位置保持不变，所述细胞灌流浴槽具有多个凹孔，所述缓冲液盛装于所述凹孔中，所述凹孔与所述盖玻片组成一个底部连通器，使得所述凹孔内的液体可以在不同凹孔间流动；所述灌流给药系统还包括蠕动泵和或显微注射给药设备，所述蠕动泵用于将所述凹孔内的所述缓冲液或校准液抽取与灌注，以进行换液；2.使用添加了尼日利亚菌素和缬氨霉素的不同已知pH值的校准液处理细胞，建立细胞荧光强度-细胞内pH值相关数据的标准曲线，将所述细胞荧光强度数据代入所述标准曲线中，得到单细胞pH值；所述校准液中尼日利亚菌素的浓度为8～12mgml，缬氨霉素的浓度为4～6mgml；所述被检细胞为游离的卵母细胞，或受精卵，或植入前胚胎细胞。

全文数据：一种细胞内pH值检测方法技术领域[0001]本发明涉及单细胞检测领域，具体而言，涉及一种细胞内pH值检测方法。背景技术[0002]pH值是对质子附着于其他分子的微小带电粒子活性的测定。在活生物系统中实时检测pH值，对于探测和理解pH值对相关生理状况的研究例如细胞表面离子通道的研宄，对某些受体的研宄，或者对细胞发育情况的研宄等至关重要。关于单个细胞内pH值PHi实时监测技术在国内鲜有报道。目前，在世界上其它国家大致有三种检测pHi的方法。[0003]1•弱酸弱碱分布法:首先根据需要选择合适的具有放射性的弱酸或弱碱处理细胞。由于弱酸或弱碱）只有以未解离的状态存在才具有膜通透性，而且它们在细胞内代谢不活跃、不改变胞内pH值，长时间孵育可使放射性物质在细胞内外分布完全平衡，即细胞内外浓度相同。然后用不含弱酸或弱碱的培养基清洗细胞数分钟，采用液体闪烁计数器测定放射性强度，结合测得的细胞体积，计算弱酸或弱碱的共扼酸碱对浓度，然后利用细胞外pH值和此种弱电解质的解离常数，g卩可计算出pHi。该法分辨率可达到〇.1〜〇.2个PH单位。[0004]2•核磁共振法:基于细胞内无机31P频谱在强磁场下发生的化学位移依赖于pH值的变化，通过对照标准曲线计算pHi。而标准曲线的制作需要在模拟细胞内的条件下制作。首先离心收集待测细胞，加入高氯酸以提取无机磷，取上清液，滴加入碳酸氢钾调节上清液pH值至中性，然后加入盐酸，获得不同pH值的上清液，分别放入核磁共振NMR管中，用31PNMR测不同pH值条件下无机磷峰的化学位移。为了得到清晰的31P核磁共振谱，通常应降低细胞培养液中锰离子浓度。该法分辨率可达到〇.06个pH单位。[0005]3•微电极法:微电极主要由H+交换载体组成，主要有金属、玻璃和液膜微电极三种，其中选择性液膜微电极的性能比较优越。一般来讲，微电极包括2根微电极或丨根双腔微电极，其中一个为pH值敏感电极，另一个为参比电极，两电极间的电位差为所测pH值的线性函数。在测定pHi时，首先将两个微电极插入细胞内，然后读取两电极间的电位差数值，再参考标准曲线绘制所测pHi。该法分辨率可达到〇.〇2〜〇.〇5个pH单位。[0006]然而上述方法均存在若干缺陷：_7]1•弱酸弱碱分布法：需要较长的平衡时间，不能测出pHi值的实时变化；另外有些弱酸弱碱对细胞损伤大，使测定结果存在偏差。-[0008]_2•核磁共振法:需要长时间维持细胞稳定生理状态，时间分辨率较低;需要大量细胞进行测量，不适用与单个细胞pHi值的测定；不适合测定偏酸pH5•5或者偏碱pH;7.5的细胞pHi值。[0009]3.微电极法:技术操作难度大，需精确把握电极插入的位置;且容易对细胞插入的部分造成损失，使离子外泄;不适用于小直径的细胞pHi值的测定。[0010]有鉴于此，特提出本发明。发明内容[0011]本发明的目的在于提供一种细胞内pH值检测方法，该方法在不损伤细胞的情况下可长时间、实时地监控单个或者多个细胞pHi值的变化，并且可重复性好，测量直径大、小细胞的pHi值均适用。[0012]为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：[0013]本发明涉及一种细胞内pH值检测方法，包括：[0014]1•将被检细胞与细胞膜通透的、pH敏感性的荧光染料共孵育，将荷载有所述荧光染料的所述待检细胞置于控气、控温的设备中的缓冲液中，在灌流给药系统的辅助下，使用能够实时监测细胞荧光变化的装置记录不同处理对应的细胞荧光强度数据；[0015]2•使用不同已知pH的校准液处理细胞，建立细胞荧光强度-细胞pHi相关数据的标准曲线，将所述细胞荧光强度数据代入所述标准曲线中，得到单细胞pHi。[0016]与现有技术中的其他方法相比，本发明所提供的荧光探针法具有操作简便、响应时间短、灵敏度高、稳定性好等优点，是目前常用的测量pHi的方法。这项技术的基本方案是:细胞通过与pH值敏感随着pH的变化其荧光强度也发生变化且细胞膜通透的荧光染料共孵育一段时间从而使细胞能够荷载上荧光染料，然后将细胞外的荧光染料洗掉并将细胞转移到控气、控温并且能够实时监测细胞荧光变化的设备上，如离子成像仪和激光共聚焦倒置显微镜等，在不损伤细胞的情况下实时记录不同处理对细胞荧光强度的影响。最后利用添加尼日利亚菌素nigericin和结|氨霉素valinomicin的已知pH值的校准液共同处理检测的细胞使细胞内外pH值相同，从而通过制作活的检测的细胞在不同pH值的环境下与其荧光强度变化间的标准曲线，反过来计算出不同荧光强度对应的pHi。这种方法能够给出细胞内pH值的二维甚至于三维图谱，其精度值达到〇.〇1个pH单位、200nm的空间精确度和毫秒级的时间精确度。附图说明[0017]为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。[0018]图1和图2为本发明一个实施例中RC-26浴槽与温控装置和灌流系统连接示意图；[0019]图3为本发明一个实施例中盖玻片上的卵母细胞排列示意图；[0020]图4为本发明一个实施例中所得到的荧光强度-细胞pHi的标准曲线；[0021]图5为本发明一个实施例中各细胞的pHi-时间的曲线；[0022]图6为本发明一个实施例中丨次实验每个时间点不同卵母细胞pHi的均值-时间的曲线;我们将对实验处理的前5分钟pHi的变化纵轴与时间的变化横轴做线性分析，定义此线性关系的斜率为这一次实验该处理调控卵母细胞pHi速率变化的大小；[0023]图7为本发明一个实施例中3次或以上实验处理的每次每个时间点卵母细胞pHi的均值土标准误-时间的曲线。具体实施方式[0024]本发明涉及一种细胞内pH值检测方法，包括：[0025]1•将被检细胞与细胞膜通透的、pH敏感性的荧光染料共孵育，将荷载有所述荧光染料的所述待检细胞置于控气、控温的设备中的缓冲液中，在灌流给药系统的辅助下，使用能够实时监测细胞荧光变化的装置记录不同处理对应的细胞荧光强度数据；[0026]2•使用不同已知pH的校准液处理细胞，建立细胞荧光强度-细胞pHi相关数据的标准曲线，将所述细胞荧光强度数据代入所述标准曲线中，得到单细胞PHi。[0027]优选的，所述被检细胞为卵细胞，或受精卵，或胚胎细胞。所述胚胎细胞优选为植入前胚胎。[0028]优选的，如上所述的方法，所述荧光染料包括：SNARF、BCECF、SNAFL、pHrododextran、CMFDA，及上述各成分的衍生物。[0029]优选的，如上所述的方法，所述共孵育体系中不含有牛血清白蛋白、血清或者聚乙烯醇，且所述孵育在表面光滑、不易沾粘细胞的容器中进行。[0030]优选的，如上所述的方法，所述监测细胞荧光变化的装置包括:离子成像仪和激光共聚焦倒置显微镜。[0031]优选的，如上所述的方法，所述控气设备包括C02检测装置；[0032]优选的，所述灌流给药系统包括细胞灌流浴槽；[0033]优选的，所述温控装置为加热板，所述细胞灌流浴槽固定于所述加热板之上。[0034]优选的，如上所述的方法，所述细胞灌流浴槽和所述加热板之间还设置有盖玻片，所述细胞灌流浴槽具有多个凹孔，所述缓冲液或所述校准液盛装于所述凹孔中，所述凹孔与所述盖玻片组成一个底部连通器，使得所述凹孔内的液体可以在不同凹孔间流动；[0035]优选的，所述灌流给药系统还包括蠕动栗和或显微注射给药设备，所述蠕动泵用于将所述凹孔内的所述缓冲液或校准液抽取与灌注，以进行换液。[0036]优选的，如上所述的方法，所述缓冲液不含有牛血清白蛋白、血清或者聚乙烯醇；以便悬浮的细胞贴附在浴槽的盖玻片上，使整个测量过程中细胞的位置保持不变。[0037]优选的，如上所述的方法，在步骤2中，所述校准液中含有尼日利亚菌素以及缬氨霉素；[0038]优选的，所述尼日利亚菌素的浓度为8〜12mgml，所述缬氨霉素的浓度为4〜6mgml；[0039]更优选的，所述校准液的成分包括:KC17.16〜7.76gl，NaCl1.16〜1_7%1，]^卩634.66〜5.2681，鹿糖2.27〜2.8781，尼日利亚菌素8〜121^1111以及缴氦霉素4〜6mgml；[0040]更优选的，所述校准液的成分包括KC17.46gl，NaCl1.46gl，H印es4.96gl，蔗糖2.57gl，尼日利亚菌素10mgml以及缬氨霉素5mgml。[0041]优选的，如上所述的方法，所述校准液的pH覆盖整个检测过程中对所述被检细胞进行处理时所对应的pH值。[0042]此外，由于不同pH值敏感的荧光染料适用的pH值范围不同，因此根据需要选择合适的荧光染料。10043J优选的，如上所述的方法，在步骤2中，在步骤2中，建立所述标准曲线时，依次使用不同pH的校准液处理细胞，每种PH校准液检测完成后均换液，每个pH的校准液处理细胞的时间多7min后再检测相应的细胞荧光强度；[0044]优选的，以一套校准液中最大或最小pH值的标准液，且与最后一次处理所述被检细胞时的pH差值最小的校准液作为第一个使用的校准液，不同校准液由高到低或者由低到高依次处理细胞;更优选的，一套校准液至少包括4种不同PH值的等差校准液。[0045]同类细胞同类处理，1〜2周内只需要做一次标准曲线即可。[0046]下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。[0047]实施例[0048]1•卵丘-卵母细胞复合体COCs的采集:收集动物卵巢后，用PBS液将卵巢清洗干净，并迅速放入盛有采卵液的培养皿中，确保采卵液淹没卵巢。对于小动物卵巢来说，需要操作人员两手分别持有一个连有2eG针头的lml注射器，其中一手利用注射器和针头将卵巢按住不动，另一手利用注射器和针头刺破突出于卵巢表面的卵泡，从而释放出COCs，在体视镜下收集COCs。而对于大动物卵巢来说，可以一手握住卵巢，另一手用连接有18G针头的10ml注射器盛有少量采卵液，防止COCs粘到注射器腔壁上抽吸3〜8mm的卵泡，将收集的液体置于体视镜下采集COCs。[0049]2.不同阶段的裸卵采集:将培养到不同阶段的COCs放到含有300ugml透明质酸酶的采卵液中在涡旋器上涡旋直至包裹在卵母细胞周围的颗粒细胞完全脱掉。在体视镜下将采卵液做成数个100U1的微滴清洗掉所有的颗粒细胞，将收集到的裸卵进行后续的PHi测定。[0050]3•荧光染料的预处理:将裸卵放到含有5福SNARF-AM可通过细胞膜的pH敏感荧光染料且不含BSA、血清或者PVA的培养液中，在37°C或者38.5°C由物种特异的卵母细胞体外成熟体系的培养温度决定），5%C02的条件下孵育30min。然后将裸卵移到不含荧光染料的培养液中充分清洗达到除去细胞外荧光染料的目的。接着将预处理的卵母细胞转移到与温度控制仪和蠕动栗联合使用的RC-26浴槽WarnerInstruments，oocyteRecordingChamber，RCseries上进行pHi测定。[0051]4.RC-26浴槽与温控装置和灌流系统连接:如图1和图2所示，将清洗干净的长方形盖玻片放到八角形的加热板上，然后将RC-26浴槽放到盖玻片的正上方，接着用螺丝刀将八角形加热板上的螺丝松开，将两侧可滑动的金属片盖在RC-26浴槽上，并用螺丝刀固定该套装置，确保注入浴槽内的液体不漏液。将这套培育装置倒置，在RC-26浴槽四边形的细胞检测孔中央的盖玻片上画一个圆圈用来指示细胞将放置此处方便找到细胞用于检测）。然后将加热板上突出的两个插头与温度控制仪连接。其中，温度控制仪上有两个温度探头，一个插入到加热板上的凹孔内（检测加热板的温度），一个放到RC-26浴槽的椭圆形的凹孔内（检测培养液的温度）。实际操作时，根据细胞培养所需的温度调整加热板的温度一般来说，力口热板的温度设定要比培养液温度的温度设定高一些才能满足培养的实际温度需求）。向RC-26浴槽内加入不含BSA、血清或者PVA的培养液，确保卵母细胞紧紧粘贴到盖玻片上，不被流动的液体冲走或者移位。由于RC-26浴槽与盖玻片组成一个底部连通器，S卩RC-26浴槽的四边形孔、椭圆形的凹孔和圆形的孔底部相连，各孔液体可以相互间流动，最后将RC-26浴槽两端分别用于灌注、排出培养液的金属管和PE管插孔与蠕动栗相连，形成卵母细胞pHi测定的灌流系统，用于检测不同处理对细胞PHi的影响。[0052]5.预处理的裸卵转移到盖玻片上进行pHi测定：荧光探针法检测卵母细胞pHi需要在物镜为40倍的放大参数下进行。由于显微镜放大倍数和CCD检测器的视野有限，为了每一次检测尽可能多的卵母细胞，需要将卵母细胞按照图3紧密地放置到RC-26浴槽下方的盖玻片的圈内（见步骤4。值得注意的是由于培养液中不含BSA、血清或者PVA，细胞极易粘贴在盖玻片上。为了不损伤卵母细胞，细胞一旦落到盖玻片上，并经轻轻晃动浴槽后细胞保持原位不动，即使细胞沾粘到不理想的位置也不能再移动细胞了。一般情况下，每次可检测9〜12枚卵母细胞图3。[0053]6•利用MetaFluor软件实时检测卵母细胞pHi:在检测前确保承载待检测的卵母细胞的RC-26浴槽与加热板温度控制仪和蠕动栗连接好，并放到倒置显微镜载物台上。一旦检测开始，卵母细胞的位置就需要保持原位不动。依次打开奥林帕斯1X73倒置显微镜、光源LambdaXL长寿命光源300W氙灯）、滤色片转盘控制器Lambda10-Bcontroller、CCD检测器Zyla-5.5sCM0S相机的电源，调节温度控制仪使RC-26浴槽内的培养液达到合适的温度。接着打开电脑安装的MetaFluo软件进行pHi检测。依次为按下Commandbar上的”New”开始新实验）；将显微镜上的滤光片调节为600nm和640nm，激发光设定为535nmpH敏感的SNARF-AM荧光染料在激发光为535nm的情况下产生两个发射光，g卩600nm和640mn，且6406〇〇的发射光强度的比值由pHi决定），打开显微镜上的光栅，移动显微镜载物台并调节焦距，首先将显微镜的物镜调节到最小放大倍数，通过RC-26浴槽底部盖玻片上画出的圆圈见步骤4快速找到卵母细胞的位置，然后逐步调节显微镜的物镜放大的倍数，由小到大，最终调到40倍的物镜，并且通过调焦使卵母细胞可以清晰地从目镜中观察到；然后点击MetaFluor软件CfgAcq图像获取设定）按钮。然后点击Experimentcontrol上的“Focus”图像对焦），微调显微镜的焦距，直至电脑显示清晰的卵母细胞的照片为止；接着按下Commandbar上的“Region”（选择检测的区域），在左上角的第一个卵母细胞中心区域用“〇”工具画一个圈，软件默认为1号检测区域，然后复制这个圈软件默认为2号检测区域并以不同的颜色与1号检测区域区分并移动到下一个卵母细胞中心区域（目的是检测每个卵母细胞相同面积的区域），依次给所有检测的卵母细胞选定检测的区域。再接着按下Experimentcontrol上的“SetTimelaps”设定对所选区域什么时间、什么频率检测。然后选择Experimentcontrol上的“SaveImages”和“SaveRatios”前的复选框，最后按下Experimentcontrol上的“F4:Acquire”开始检测。根据实验需要，通过灌流给药系统更换细胞培养液进而检测不同处理对卵母细胞pH值的影响。[0054]7.标准曲线的制作：校准液的基础液为：KC17.46gl，NaCl1.46gl，Hepes4.96gl，蔗糖2.57gl，然后用NaOH调节溶液的pH值分别为7.1、7.4、7.7、8.0后无菌过滤，放入4°C冰箱内保存有效期为1个月）。在制作标准曲线前，将上述不同pH值的校准液预热到卵母细胞pHi检测的温度，加入10mgml尼日利亚菌素（nigericin和5mgml缬氨霉素valinomicin。当卵母细胞pHi检测结束后，利用灌流系统懦动栗从ph8.0的校准液开始，置换掉原有的pHi检测液，并停留7min使细胞内外PH值相同，然后用MetaFluor软件检测激发光为535皿1下发射光640nm600nm的发射光强度的比值，读5次，每次间隔7s取5次读值的平均值作为检测的发射光强度的比值）；然后依次检测pH7.7、pH7.4和pH7.1校准液640mn6〇Onm的发射光强度的比值，检测方法同上，即每次更换新的校准液要停留7min，然后读取发射光640nm600nm的发射光强度的比值，读5次，每次间隔7s。在每次更换液体的间隔中，用带有温度测量的pH计测量跟卵母细胞pHi检测相同的温度下，各个校准液的实际PH溶液pH值随温度改变而改变）。以pH值为纵坐标，以各个校准液下细胞640nni600nm的发射光强度的比值为横坐标做标准曲线，得出pHi与细胞640nm600nm的发射光强度的比值的线性关系，如图4。[0055]根据所得标准曲线，对步骤6中所得数据进行处理，可得到各细胞在不同处理时间的细胞内pH数据（图5。由于每次可检测9〜12个卵母细胞，取每次所有检测的卵母细胞每个时间点pHi的均值作为这次卵母细胞这个时间点的pHi。以此类推，计算出实验处理各个时间点pHi的均值。为了进一步计算不同处理对卵母细胞pHi的影响，我们将对实验处理的前5分钟pHi的变化纵轴与时间的变化横轴做线性分析，定义此线性关系的斜率为这一次实验该处理调控卵母细胞pHi速率变化的大小（图6。对于每个实验处理，上述实验至少重复3次，以上述每次实验均值为基数，计算实验处理每个时间点pHi的值均值土标准误），从而绘制出该处理诱导的细胞pHi的变化纵轴与时间的变化横轴的曲线（图7;每次实验处理的细胞pHi的变化纵轴）与时间的变化横轴）的线性分析的斜率的均值均值土标准误即为该处理调控卵母细胞pHi速率变化的大小。t〇〇56]最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

权利要求：1.一种细胞内pH值检测方法，其特征在于，包括：1.将被检细胞与细胞膜通透的、pH敏感性的荧光染料共孵育，将荷载有所述荧光染料的所述待检细胞置于控气、控温设备中的缓冲液中，在灌流给药系统的辅助下，使用能够实时监测细胞荧光变化的装置记录不同处理对应的细胞荧光强度数据；2.使用不同已知pH的校准液处理细胞，建立细胞荧光强度-细胞pHi相关数据的标准曲线，将所述细胞荧光强度数据代入所述标准曲线中，得到单细胞pHi。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述荧光染料包括:SNARF、BCECF、SNAFL、pHrododextran、CMFDA，及上述各成分的衍生物。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述共孵育体系中不含有牛血清白蛋白、血清或者聚乙烯醇，且所述孵育在表面光滑、不易沾粘细胞的容器中进行。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述监测细胞荧光变化的装置包括:离子成像仪和激光共聚焦倒置显微镜。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述控气设备包括C02检测装置；优选的，所述灌流给药系统包括细胞灌流浴槽；优选的，所述温控装置为加热板，所述细胞灌流浴槽固定于所述加热板之上。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述细胞灌流浴槽和所述加热板之间还设置有盖玻片，所述细胞灌流浴槽具有多个凹孔，所述缓冲液或所述校准液盛装于所述凹孔中，所述凹孔与所述盖玻片组成一个底部连通器，使得所述凹孔内的液体可以在不同凹孔间流动；优选的，所述灌流给药系统还包括蠕动泵和或显微注射给药设备，所述蠕动泵用于将所述凹孔内的所述缓冲液或校准液抽取与灌注，以进行换液。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述缓冲液不含有牛血清白蛋白、血清或者聚乙烯醇。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤2中，所述校准液中含有尼日利亚菌素以及缬氨霉素；优选的，所述尼日利亚菌素的浓度为8〜12mgml，所述缴氨霉素的浓度为4〜6mgml;更优选的，所述校准液的成分包括:1：17.16〜7.76§1，似：11.16〜1.7681，1^卩634•66〜5•26gl，鹿糖2•27〜2•87gl，尼日利亚菌素8〜12mgml以及缴氨霉素4〜6mgtnl。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述校准液的pH覆盖整个检测过程中对所述被检细胞进行处理时所对应的pH值。10.根据权利要求1〜9任一项所述的方法，其特征在于，在步骤2中，建立所述标准曲线时，依次使用不同pH的校准液处理细胞，每种PH校准液检测完成后均换液，每个pH的校准液处理细胞的时间7min后再检测相应的细胞荧光强度；优选的，以一套校准液中最大或最小pH值的标准液，且与最后一次处理所述被检细胞时的pH差值最小的校准液作为第一个使用的校准液，不同校准液由高到低或者由低到高依次处理细胞;更优选的，一套校准液至少包括4种不同PH值的等差校准液。

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