申请/专利权人：陕西慧康生物科技有限责任公司

申请日：2017-11-29

公开（公告）日：2021-05-04

公开（公告）号：CN107778349B

主分类号：C07K5/083(20060101)

分类号：C07K5/083(20060101);C07K1/107(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.05.04#授权;2018.04.03#实质审查的生效;2018.03.09#公开

摘要：本发明公开了一种合成GHK醋酸盐的方法，该方法先将Trt‑Gly‑OH与N‑羟基琥珀酰亚胺反应生成Trt‑Gly‑OSu，再与H‑HisTrt‑OH反应生成Trt‑Gly‑HisTrt‑OH，然后与N‑羟基琥珀酰亚胺反应生成Trt‑Gly‑HisTrt‑OSu，最后与LysTrt‑OH反应生成Trt‑Gly‑HisTrt‑LysTrt‑OH，将Trt‑Gly‑HisTrt‑LysTrt‑OH在醋酸中脱掉保护基团即可生成GHK醋酸盐。本发明合成方法的保护基团都为三苯甲基，很好的保证了光学纯度，且在醋酸中可以直接脱除保护，避免了三氟乙酸脱保护所产生的副产物，最终制得的GHK醋酸盐无需反向色谱纯化、离子交换色谱除三氟乙酸，极大的降低生产成本，可用于大规模生产。

主权项：1.一种合成GHK醋酸盐的方法，其特征在于由以下步骤组成：1合成Trt-Gly-OSu以四氢呋喃为溶剂，将Trt-Gly-OH与N-羟基琥珀酰亚胺、N,N'-二环己基碳酰亚胺在室温条件下反应，生成Trt-Gly-OSu；2合成Trt-Gly-HisTrt-OH以N,N-二甲基甲酰胺为溶剂，将Trt-Gly-OSu与HisTrt-OH、N,N-二异丙基乙胺在室温条件下反应，生成Trt-Gly-HisTrt-OH；3合成Trt-Gly-HisTrt-OSu以四氢呋喃为溶剂，将Trt-Gly-HisTrt-OH与N-羟基琥珀酰亚胺、N,N'-二环己基碳酰亚胺在室温条件下反应，得到Trt-Gly-HisTrt-OSu；4合成Trt-Gly-HisTrt-LysTrt-OH将Trt-Gly-HisTrt-OSu与LysTrt-OH、碳酸氢钠在四氢呋喃和水中室温反应5～12小时，生成Trt-Gly-HisTrt-LysTrt-OH；5合成GHK醋酸盐将Trt-Gly-HisTrt-LysTrt-OH在醋酸和三异丙基硅烷中脱保护，生成GHK醋酸盐。

全文数据：一种低成本合成GHK醋酸盐的方法技术领域[0001]本发明属于多肽合成技术领域，具体涉及一种GHK醋酸盐的合成方法。背景技术[0002]GHK三肽为一种含有三个氨基酸的活性多肽，氨基酸序列为H-Gly-His-Lys-OH，经过多年的皮肤抗皱研究，GHK三肽具有组织修复、抗老、除皱等作用，其与铜形成的络合物GHK-Cu在医学上最早用于伤口愈合及增加肌肤弹性。因此被皮肤科及整形外科医师推荐为21世纪最无刺激的抗老除皱产品。[0003]申请号为201310751827.1的中国发明专利申请公开了一种制备GHk的方法，该方法具体是用Boc保护的甘氨酸、咪唑基团由Boc保护的组氨酸以及乙酰基保护侧链氨基的赖氨酸为原料，合成Boc-Gly-HisBoc-LysAc-0H，然后用三氟乙酸脱掉保护，得到GHK的三氟乙酸盐，最后经反相色谱、离子交换色谱最终生成GHK的醋酸盐。该方法有如下几个缺陷：1组氨酸是最容易消旋的氨基酸，在保持光学纯度方面，用Boc保护咪唑基团，不如用三苯甲基保护；（2用乙酰基保护赖氨酸的侧链氨基，生成的产物Boc-Gly-HisBoc-LysAc-OH在用三氟乙酸脱保护时，Boc很容易脱掉，而乙酰基不容易在三氟乙酸中脱掉，需要适当升温以及延长反应时间，导致副产物增多；（3由于Boc和乙酰基团没有紫外吸收，每步中间体都无法薄层色谱检测，需要液相跟踪检测，导致操作繁琐；⑷最后脱保护后是GHK的三氟乙酸盐，需要经反向色谱纯化，在进一步除三氟乙酸，经过离子交换色谱才能变为醋酸盐，成本太高，无法大量生产。发明内容[0004]本发明的目的在于针对现有技术的缺陷，提供一种无需反向色谱以及离子交换色谱就可以低成本、大量合成GHK醋酸盐的方法。[0005]为达到上述目的，本发明所采用的技术方案由下述步骤组成：[0006]1、合成Trt-Gly-〇Su[0007]以四氢呋喃为溶剂，将Trt-Gly-〇H与N-羟基琥珀酰亚胺、N，N’_二环己基碳酰亚胺在室温条件下反应，生成Trt-Gly-OSu。[0008]2、合成Trt-Gly-HisTrt-〇H[0009]以N，N-二甲基甲酰胺为溶剂，将Trt-Gly-OSu与HisTrt-〇H、N，N-二异丙基乙胺在室温条件下反应，生成Trt~Gly_HisTrt-OH。[0010]3、合成Trt-Gly-HisTrt-OSu[0011]以四氢呋喃为溶剂，将Trt-Gly_HisTrt-〇H与N-羟基琥珀酰亚胺、N，N’_二环己基碳酰亚胺在室温条件下反应，得到Trt~Gly-HisTrt-OSu。[0012]4、合成Trt-Gly-HisTrt-LysTrt-OH[0013]将Trt-Gly-HisTrt-OSu与LysTrt-0H、碳酸氢钠在四氢呋喃和水中室温反应5〜12小时，生成Trt-Gly-HisTrt-LysTrt-0H。[0014]5、合成GHK醋酸盐[0015]将Trt-Gly-HisTrt-LysTrt-0H在醋酸和三异丙基硅烷中脱保护，生成GHK醋酸盐。[0016]上述步骤1中，优选Trt-Gly-〇H与N-羟基琥珀酰亚胺、N，N’-二环己基碳酰亚胺的摩尔比为1:1.1〜1.3:1.3〜1.5,室温反应时间优选3〜5小时。[0017]上述步骤2中，优选Trt-Gly-OSu与HisTrt-〇H、N，N_二异丙基乙胺的摩尔比为1:1〜1.3:1〜1.3,室温反应时间优选1〜1.5小时。[0018]上述步骤3中，优选Trt-Gly-HisTrt-0H与N-轻基琥珀酰亚胺、N，N’_二环己基碳酰亚胺的摩尔比为1:1•1〜1.3:1.3〜1.5，室温反应时间优选3〜5小时。[0019]上述步骤4中，优选Trt-Gly-HisTrt-OSu与LysTrt-0H、碳酸氢钠的摩尔比为1:1.1〜1.3:2〜2.5,室温反应时间优选10〜12小时。[0020]上述步骤5中，优选Trt-Gly-HisTrt-LysTrt-0H、三异丙基硅烷的摩尔比为1:2.5〜4，吖1-〇17_1^8〇^〇-1^3〇'^-〇11与醋酸的质量体积比为18:5〜1〇1111，所述脱保护的条件为:室温反应1〇〜15小时。[0021]相对于现有技术，本发明合成方法具有如下优点：[0022]⑴氨基保护基团和咪唑保护基团都用三苯甲基保护，很好的保证了光学纯度，且都是同一基团，因此脱保护时，所用的条件一致。[0023]2由于三苯甲基基团的存在，所以有很强的紫外吸收，每步反应都可以薄层色谱监控，避免了HPLC监控反应的繁琐性。[0024]3由于所有基团都用三苯甲基保护，最后在醋酸中可以直接脱除保护，避免了三氟乙酸脱保护所产生的副产物。[0025]4用醋酸脱三苯甲基保护，最终制得的GHK醋酸盐无需反向色谱纯化、离子交换色谱除三氟乙酸等，极大的降低生产成本，可用于大规模生产。附图说明[0026]图1是实施例1合成的GHK醋酸盐的质谱图。[0027]图2是实施例1合成的GHK醋酸盐的高效液相色谱图。具体实施方式[0028]下面结合附图和实例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实例。[0029]实施例1[0030]1、合成Trt-Gly-OSu[0031]将31•7g0•lmo1Trt-Gly-〇H与300mL四氢呋喃加入到反应瓶中，室温搅拌溶解清澈，加入13•8g0•12molN-羟基琥珀酰亚胺，搅拌溶解清澈，再加入30•9g0•15mo1N，N’-二环己基碳酰亚胺，室温搅拌30分钟后，有大量白色固体析出，继续搅拌3小时，TLC显示原料反应完全，过滤，将滤液在35°C下减压浓缩，得到41.4gTrt-Gly-OSu，产率100%。[0032]2、合成Trt-Gly-HisTrt-0H[0033]将41•4g0.lmolTrt-Gly-OSu溶解于300mLN，N-二甲基甲酰胺中，加入39.7gO.lmolHisTrt-011、12.9§0.1111〇1^二异丙基乙胺，室温搅拌1小时后，11^显示原料完全反应，将反应液倒入1_5L水中，用柠檬酸调节pH=3〜4,有大量白色固体析出，搅样半小时后，过滤，滤饼用1L水反复冲洗后，30〜35°C晾干，得到7〇gTrt-Gly-HisTrt-0H，产率100%。’[0034]3、合成Trt-Gly-HisTrt-OSu[0035]将7〇g0•lmolTrt-Gly-HisTrt-0H加入7〇〇mL四氢呋喃中，室温搅拌溶解，加入l3.8g0_12molN-羟基琥珀酰亚胺，搅拌溶解清澈，再加入3〇.98〇_15111〇103，—二环己基碳酰亚胺，室温搅拌30分钟后，有大量白色固体析出，继续搅拌5小时，TLC显示原料完全反应，过滤掉不溶物，得到7〇OmL含0.lmolTrt-Gly-HisTrt-OSu的四氢呋喃溶液。[0036]4、合成Trt-Gly-HisTrt-LysTrt-〇H[0037]向700mL含0.lmolTrt-Gly-HisTrt-OSu的四氢咲喃溶液加入38.8g〇.lmolLysTrt-OH、18•5g0•22mol碳酸氢钠、230mL水，室温搅拌12小时后，TLC显示原料完全反应，35°C减压浓缩除去四氛呋喃后，将浓缩液倒入1L水中，用梓檬酸调节pH=3〜4,出现大里白色固体，揽摔30分钟后，过滤，滤饼用1L水反复冲洗后，30〜35°C瞭干，然后用乙醋重结晶，得到68gTrt-Gly-HisTrt-LysTrt-0H纯品，产率64%。[0038]5、合成GHK醋酸盐[0039]将68g0_064molTrt-Gly-HisTrt-LysTrt-0H加入400mL醋酸中，室温搅拌溶解，加入35g0•2mol三异丙基硅烷，室温搅拌10小时，TLC显示原料完全反应，过滤，将滤液40°C减压浓缩后，加入300mL水溶解，水层用100mL甲基叔丁基醚洗3遍后，40°C减压浓缩至250mL，冷冻干燥，得到26gGHK醋酸盐，产率80%。[KM0]发明人采用质谱仪对得到的产物进行结构表征，结果见图1。由图1可见，所得产物的分子量及分子离子峰与GHK三肽分子量以及分子离子峰一致，说明制备产物为GHK醋酸盐GHK醋酸盐在质谱上显不为GHK的分子量，醋酸分子量在质谱上不显）。米用液相色谱仪对得到的产物的纯度进行测定，分析条件为:色谱柱C185um250X4.6mm，流速lmLmin，检测波长215nm，流动相A:体积浓度0•1%的三氟乙酸水溶液，流动相B:体积浓度0.1%的三氟乙酸乙腈溶液，洗脱条件:流动相B1%恒流15min，分析结果见图2。由图2可见，所制备的GHK醋酸盐的出峰时间为2.9分钟，纯度大于95%。[0041]实施例2[0042]1、合成Trt-Gly-〇Su[0043]将lg0•3molTrt-Gly-〇H与900mL四氢呋喃加入到反应瓶中，室温搅拌溶解清澈，加入38g0•33mo1N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌溶解清澈，再加入80•3g0•39mo1N，N’-二环己基碳酰亚胺，室温搅拌30分钟后，有大量白色固体析出，继续搅拌3小时，TLC显示原料反应完全，过滤，将滤液在35°C下减压浓缩，得到120.4gTrt-Gly-〇Su，产率97%。[0044]2、合成Trt-Gly-HisTrt-0H[0045]将120.40.29molTrt-Gly-0Su溶解于900mLN，N-二甲基甲酰胺中，加入127g0.32111〇11^01:-011、440.32111〇1叱1二异丙基乙胺，室温搅拌1小时后，几：显示原料完全反应，将反应液倒入1.5L水中，用柠檬酸调节pH=3〜4,有大量白色固体析出，搅拌半小时后，过滤，滤饼用1L水反复冲洗后，30〜35°C晾干，得到200gTrt-Gly-HisTrt-0H，产率98.8%。[0046]3、合成Trt-Gly-HisTrt-OSu[0047]将200g0_28molTrt-Gly-HisTrt-OH加入2100mL四氢呋喃中，室温搅拌溶解，加入36g0•31molN-羟基琥珀酰亚胺，搅拌溶解清澈，再加入76g0•37molN，N’-二环己基碳酰亚胺，室温搅拌30分钟后，有大量白色固体析出，继续搅拌5小时，TLC显示原料完全反应，过滤掉不溶物，得到2100mL含0_285molTrt-Gly-HisTrt-OSu的四氢呋喃溶液。[0048]4、合成Trt-Gly-HisTrt-LysTrt-0H[0049]向2100mL含0.28molTrt-Gly-HisTrt-OSu的四氢呋喃溶液加入122g〇.3imclLysTrt-0H、52•8g0•63m〇l碳酸氢钠、690mL水，室温搅拌l2小时后，TLC显示原料完全反应，35C减压浓缩除去四氢呋喃后，将浓缩液倒入1L水中，用梓檬酸调节pH=3〜4，出现大量白色固体，搅拌30分钟后，过滤，滤饼用1L水反复冲洗后，30〜35。：晾干，然后用乙酷重结晶，得到202gTrt-Gly-HisTrt-LysTrt-0H纯品，产率66%。[0050]5、合成GHK醋酸盐[0051]将202g〇•19molTrt-Gly-HisTrt-LysTrt-OH加入2000mL醋酸中，室温揽摔溶解，加入l〇5g0.6mol三异丙基硅烷，室温搅拌10小时，TLC显示原料完全反应，过滤，将滤液40°C减压浓缩后，加入900mL水溶解，水层用3〇〇mL甲基叔丁基醚洗3遍后，4TC减g浓缩至750mL，冷冻干燥，得到76.9gGHK醋酸盐，纯度97%，产率78%。

权利要求：1.一种低成本合成GHK醋酸盐的方法，其特征在于由以下步骤组成：1合成Trt-Gly-OSu以四氢呋喃为溶剂，将Trt-Gly-OH与N-羟基琥珀酰亚胺、N，N’_二环己基碳酰亚胺在室温条件下反应，生成Trt-Gly-〇Su;⑵合成Trt-Gly-HisTrt-OH以N，N-二甲基甲酰胺为溶剂，将Trt-Gly-OSu与HisTrt-〇H、N，N-二异丙基乙胺在室温条件下反应，生成Trt-Gly-HisTrt-0H;⑶合成Trt-Gly-HisTrt-OSu以四氢呋喃为溶剂，将Trt-Gly-HisTrt-OH与N-轻基琥珀酰亚胺、N，N’_二环己基碳酰亚胺在室温条件下反应，得到Trt-Gly-HisTrt-OSu;⑷合成Trt-Gly-HisTrt-LysTrt-OH将Trt-Gly-HisTrt-OSu与LysTrt-OH、碳酸氢钠在四氢呋喃和水中室温反应5〜12小时，生成Trt-Gly-HisTrt-LysTrt-0H;⑸合成GHK醋酸盐将Trt-Gly-HisTrt-LysTrt-OH在醋酸和三异丙基硅烷中脱保护，生成GHK醋酸盐。2.根据权利要求1所述的低成本合成GHK醋酸盐的方法，其特征在于，在步骤（1中，所述Trt-Gly-OH与N-羟基琥珀酰亚胺、N，N’-二环己基碳酰亚胺的摩尔比为1:1.1〜1.3:1•3〜1_5〇3.根据权利要求2所述的低成本合成GHK醋酸盐的方法，其特征在于，在步骤（1中，室温反应时间为3〜5小时。4.根据权利要求1所述的低成本合成GHK醋酸盐的方法，其特征在于，在步骤2中，所述Trt-Gly-OSu与HisTrt-〇H、N，N-二异丙基乙胺的摩尔比为1:1〜1•3:1〜1•3。5.根据权利要求4所述的低成本合成GHK醋酸盐的方法，其特征在于，在步骤2中，室温反应时间为1〜1.5小时。6.根据权利要求1所述的低成本合成GHK醋酸盐的方法，其特征在于，在步骤3中，所述Trt-Gly-HisTrt-0H与N-羟基琥珀酰亚胺、N，N’_二环己基碳酰亚胺的摩尔比为1:1•1〜1-3:1.3〜1.5〇7.根据权利要求6所述的低成本合成GHK醋酸盐的方法，其特征在于，在步骤3中，室温反应时间为3〜5小时。8.根据权利要求1所述的低成本合成GHK醋酸盐的方法，其特征在于，在步骤4中，所述Trt-Gly-HisTrt-OSu与LysTrt-0H、碳酸氢钠的摩尔比为1:1.1〜1.3:2〜2.5。9.根据权利要求8所述的低成本合成GHK醋酸盐的方法，其特征在于，在步骤4中，室温反应时间为10〜12小时。10.根据权利要求1所述的低成本合成GHK醋酸盐的方法，其特征在于，在步骤5中，所述Trt-Gly-HisTrt-LysTrt-0H、三异丙基硅烷的摩尔比为1:2.5〜4，Trt-Gly-HisTrt-LysTrt-OH与醋酸的质量体积比为lg:5〜10mL，所述脱保护的条件为:室温反应10〜15小时。

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