申请/专利权人：哈尔滨医科大学

申请日：2019-01-18

公开（公告）日：2021-05-25

公开（公告）号：CN109876143B

主分类号：A61K45/00(20060101)

分类号：A61K45/00(20060101);A61K47/42(20170101);A61K48/00(20060101);A61K31/713(20060101);A61P25/28(20060101);C07K7/06(20060101);C07K1/34(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.05.25#授权;2019.07.09#实质审查的生效;2019.06.14#公开

摘要：本发明公开了野生型p53诱导的蛋白磷酸酶1基因Wip1及其表达蛋白在治疗肌萎缩侧索硬化中的用途。本发明通过体内实验证实在SOD1G93AALS小鼠中Wip1的表达明显下降且与疾病的发生和发展密切相关，在神经元细胞中通过基因调控过表达Wip1基因，能够通过抑制DNA损伤应答机制促进神经元的存活，提示高表达上述原癌基因Wip1可治疗肌萎缩侧索硬化，本发明还公开了一种用于治疗肌萎缩侧索硬化的聚合物纳米颗粒，通过给药靶向受试者的脑和脊髓的运动神经元，用于治疗肌萎缩侧索硬化。本发明的提出为肌萎缩侧索硬化的预防和治疗提供了新的技术手段。

主权项：1.野生型p53诱导的蛋白磷酸酶1wild-typep53-induciblephosphatase1,Wip1基因在制备治疗由SOD1G93A突变导致的肌萎缩侧索硬化药物中的用途。

全文数据：Wip1基因及其表达蛋白在治疗肌萎缩侧索硬化中的用途技术领域本发明涉及一种基因治疗肌萎缩侧索硬化的方法，特别涉及野生型p53诱导的蛋白磷酸酶1wild-typep53-induciblephosphatase1,Wip1基因及其表达蛋白在治疗肌萎缩侧索硬化中的用途，本发明属于神经生物技术领域。背景技术肌萎缩侧索硬化AmyotrophicLateralSclerosis,ALS,又称“渐冻人症”，是一种致命性的神经退行性疾病。主要累及上、下运动神经元，表现为进行性的肌无力和萎缩，平均生存期3-5年。最新的流行病学统计显示，ALS的患病率约为每年每十万分之五。大约有20％的家族性ALS与SOD1基因突变密切相关。目前研究认为，ALS的发病机制主要与RNA代谢紊乱、蛋白质稳态异常、线粒体功能障碍、氧化应激、兴奋性氨基酸毒性、DNA损伤、胶质细胞病变及细胞内核质运输障碍等有关。最新研究预计到2040年，全球ALS患者将在2015年222801人的基础上增加69％。尽管ALS已经对人类的健康产生了越来越大的威胁，并给家庭和社会带来了沉重的负担，但到目前为止仍然没有控制疾病的有效手段。FDA批准的第一个口服药物利鲁唑Riluzole，价格昂贵，且仅能延长患者生命约3-4个月；2017年FDA最新批准的自由基清除药物依达拉奉Edaravone，早期临床研究仍存在争议，且目前研究提示依达拉奉似乎不适用于所有类型的ALS患者。由于RNA或蛋白介导的毒性是ALS最常见的致病机制，因此通过基因治疗的手段减少毒性的RNA或蛋白并通过调控基因表达来起到保护运动神经元的作用已经成为了目前研究的前沿。虽然人类的基因治疗仍然处在初始阶段，但一系列早期临床试验已经证实了这种治疗手段的安全性和有效性。目前对于ALS的基因治疗研究主要基于反义寡核苷酸ASOs、腺病毒AAV慢病毒LV载体以及间充质干细胞慢病毒载体系统。ASOs靶向SOD1的最新研究已经进入了I期临床阶段，研究表明SOD1ALS患者在鞘内给予3mgISIS333611没有显示出毒性和严重的不良反应；然而对ISIS33611的I期试验发现突变SOD1蛋白的含量并没有减少，而改良的SOD1ASOBIIB067或IONIS-SOD1Rx的I期临床试验目前正处于研究阶段。在ALSFTD患者iPSC可诱导的多能干细胞诱导的神经元中用ASOs靶向扩增的C9ORF72减少了毒性RNA的聚集和谷氨酸的毒性。最新研究表明，给予C9ORF72ALS小鼠侧脑室注射ASOs靶向C9ORF72重复扩增片段能够减少RNA聚集和二肽重复蛋白并改善了与衰老相关的行为学表现。目前鞘内给予靶向C9ORF72的ASOs的1期临床试验NCT03626012正处于募集受试者阶段。在ALS中以腺病毒慢病毒为载体的基因治疗目前主要以动物研究为主。多个研究小组的研究证实应用AAVLV载体投递shRNA能够通过敲减SOD1延长ALSG93A大鼠模型的生存期。肌内给予以AAVLV为载体的神经营养因子GDNF、IGF-1和VEGF，能够延缓ALSSOD1-G93A大鼠的发病，改善其行为和运动功能并延长生存期，而通过直接靶向中枢神经系统的给药方式，如侧脑室注射、椎管内注射或小脑注射投递这些以病毒为载体的神经营养因子也起到了部分挽救疾病表型和延长ALS大鼠生存期的作用。体外实验以LV为载体在细胞中表达抗氧化基因能够减少氧化应激的水平促进细胞的存活。在ALSTDP43小鼠模型中以AAV为载体给予hUPF1基因治疗能够改善大鼠的前肢功能。此外，间充质干细胞治疗方式也受到研究者的普遍关注，研究表明在SOD1-G93A大鼠中移植用LV载体表达GDNF的人间充质干细胞，能够对ALSSOD1-G93A大鼠的骨骼肌、运动神经元和神经肌肉接头起到神经保护作用，并增加存活。另一项研究应用LV载体系统在人间充质干细胞中过表达VEGF和GDNF，能够延长SOD1-G93AALS大鼠的生存期，维持脊髓前角运动神经元和神经肌肉接头的功能。除此之外，在运动神经元疾病中基因治疗已经取得突破性的进展，一种反义寡核苷酸药物——Spinraza，目前已经获得了FDA的批准用于治疗脊肌萎缩症SMA。综上，尽管目前在基因治疗领域的研究已经受到了越来越多的关注，但基因治疗仍然面临很多挑战：无效的给药方式以及血脑屏障的阻碍严重影响了治疗效果，如反义寡核苷酸不能通过血脑屏障BBB而只能通过鞘内注射的方式给药；仍然缺乏靶向中枢神经系统特定部位或者细胞亚型的给药方式；以及生产用于临床的大量病毒载体需要昂贵的成本，此外病毒载体不仅可以激活宿主的免疫系统，还能诱导免疫记忆的产生影响后期再应用病毒载体的疗效。纳米载体nano-vectors是近年来研究的一类安全、高效、理想的新型基因治疗载体，它是以纳米微粒为载体，将目的基因包含于微粒内部或吸附于表面，利用纳米微粒的小尺寸效应、比表面效应、界面效应等性质将目的基因转移到靶细胞内部，释放目的基因，从而达到基因治疗的最终目的。与病毒载体相比，纳米载体通过将质粒DNA压缩成纳米级微粒，不但可以避免核酸降解，而且可以高效的介导DNA向细胞内转染，同时也避免了应用病毒载体带来的细胞毒性、免疫原性及潜在的致瘤性等缺点，更重要的是，利用不同的表面修饰，纳米载体能够有效决定外源基因在体内的走向、定位传递以及高效表达，从而表现出优越的靶向性。因此纳米载体的出现，将在很大程度上改善中枢神经系统给药生物利用度低以及无法通过血脑屏障BBB等的情况，但是到目前为止，尽管在阿尔茨海默病AD和帕金森病PD领域已经有很多基于纳米载体给药系统的研究，但在ALS治疗领域的研究仍非常有限。早期研究表明，通过共价连接将利鲁唑与碳纳米管CNTs结合没有影响利鲁唑的药物活性，对细胞也无毒性作用。用固体脂质纳米颗粒SLNs包裹利鲁唑制成88nm带负电荷的化合物，通过腹腔注射途径给药，显示出比普通利鲁唑更高的脑组织靶向性和更低的非特异性生物分布。体内实验在ALSSOD1G93A小鼠中通过侧脑室注射的给药方式，将用脂多糖修饰的包裹抗炎药物米诺环素的脂质体直接靶向小胶质细胞的TLR4受体，增加了药物的摄取率并减缓了疾病的进展。最新研究表明，磷酸钙脂质纳米颗粒配方包裹SOD1ASO在显微镜下注射在斑马鱼体内，成功的在其脑组织、脊髓和血液中检测到纳米颗粒，证实磷酸钙脂质纳米颗粒是一种安全有效基因载体，改善了ASO到运动神经元的给药途径。将具有抗氧化特性的氧化铈纳米颗粒通过尾静脉注射途径注入ALSSOD1G93A小鼠中，延长了ALS小鼠的平均生存期。目前对于纳米基因载体靶向治疗ALS的相关研究尚未见报道。最近很多研究以狂犬病毒糖蛋白rabiesvirusglycoprotein，RVG作为靶向脑组织的配体并在传递siRNA载体的表面进行修饰，如三甲烯壳聚糖，甘露糖醇-聚乙烯亚胺，外泌体，以及通过全身注射的方式将siRNA传递到脑组织中。然而，仅仅传递基因穿越血脑屏障是不够的，中枢神经系统中有多种细胞亚型，因此为了确保基因传递的安全性和有效性，我们需要能够靶向神经元的纳米传递基因系统。一个研究小组的最新研究表明，噬菌体展示l肽TGNYKALHPHNGTGN能够使PEG-PLGA聚乙二醇-聚乳酸羟基乙酸共聚物纳米颗粒易于穿过血脑屏障，因此构建了新型脑靶向药物传递系统，该系统包载蛋白多肽药物后可以保护其不受体内环境降解，提高稳定性，是一种有效、低毒性的脑靶向药物传递系统。另一个研究小组在此研究的基础上，合成TGN的反向异构体CGN肽d-CGNHPHLAKYNGT，并证实CGN比TGN显示出更高的脑靶向性。并且该研究小组构建了一种双功能的纳米复合体应用血脑屏障靶向配体-CGN和神经元靶向配体-Tet1双重修饰。Tet1HLNILSTLWKYR，通过体外噬菌体展示鉴定的肽，与在神经元上高表达的GT1B神经节苷脂鞘磷脂结合。聚乙二醇-聚甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯PEG-PDMAEMA具有低毒性，高缓冲能力和高转染效率是一个理想的纳米载体，因此该研究组以此PEG-PDMAEMA为核心包装目的基因，再以穿过血脑屏障和靶向神经元配体双重修饰，将CGN-PEG-PDMAEMA和Tet1-PEG-PDMAEMA按照重量比1：1混合，显示出在血液中很好的稳定性，不导致溶血。纳米基因复合体能够通过网格蛋白介导的内吞作用和微饱饮现象进入神经元，而小凹蛋白介导的内吞作用在其进入脑毛细血管内皮细胞中起到重要的作用。此纳米颗粒复合体能够成功的逃脱溶酶体的溶解，直接进入神经元的细胞质中，实现基因的有效转染。很多流行病学研究报道，在肿瘤患者中神经变性疾病的发病率有所降低，最新研究表明，肿瘤和神经变性疾病中很多基因、蛋白以及信号通路调控障碍呈现出相反的情况，这引起了我们极大的兴趣，本发明发明人通过前期研究发现，与肿瘤生长密切相关的原癌基因Wip1在ALSSOD1G93A小鼠脊髓前角运动神经元中表达明显下降，且与ALS的发生和发展密切相关，原癌基因Wip1与ALS之间的关系尚未见报道。野生型p53诱导的蛋白磷酸酶1wild-typep53-induciblephosphatase1,Wip1，是PP2C家族成员，在细胞中表达后可使靶蛋白去磷酸化，参与调控细胞凋亡，细胞周期，DNA损伤修复等多条细胞信号通路。Wip1在许多肿瘤中表达增多，包括乳腺癌、卵巢癌、胃癌等，因此，被认为是潜在的与肿瘤细胞生长相关的原癌基因。发明内容本发明的目的在于提供野生型p53诱导的蛋白磷酸酶1wild-typep53-induciblephosphatase1,Wip1基因及其表达蛋白在治疗肌萎缩侧索硬化中的新用途。为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：首先，本发明提出了野生型p53诱导的蛋白磷酸酶1wild-typep53-induciblephosphatase1,Wip1及其表达蛋白在制备治疗肌萎缩侧索硬化药物中的用途。其中，所述的野生型p53诱导的蛋白磷酸酶1wild-typep53-induciblephosphatase1,Wip1的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。其中，优选的，所述的药物通过抑制DNA损伤应答途径和增加神经元的存活，用于改善由SOD1G93A突变导致的肌萎缩侧索硬化。其中，优选的，所述的药物为通过纳米载体结合Wip1基因制备得到的纳米颗粒、凝胶或乳剂，所述纳米颗粒包含但不限于聚合物纳米颗粒、脂质纳米颗粒、碳纳米颗粒、金属纳米颗粒。进一步的，本发明还提出了野生型p53诱导的蛋白磷酸酶1wild-typep53-induciblephosphatase1,Wip1及其表达蛋白的增效剂在制备治疗肌萎缩侧索硬化药物中的用途。其中，优选的，所述的药物通过抑制DNA损伤应答途径和增加神经元的存活，用于改善由SOD1G93A突变导致的肌萎缩侧索硬化。其中，优选的，所述的增效剂为激动剂、上调剂或稳定剂。其中，优选的，所述的增效剂是指任何可提高Wip1基因或蛋白的活性、提高Wip1基因或蛋白的稳定性、上调Wip1基因或蛋白的表达、增加Wip1基因或蛋白有效作用时间的物质，所述的增效剂为化合物、化学小分子或生物分子。其中，优选的，所述的生物分子可以是DNA或RNA，或是调控Wip1基因或蛋白表达的病毒产品。更进一步的，本发明还提出了一种用于治疗肌萎缩侧索硬化的聚合物纳米颗粒，通过以下方法制备得到：1合成二嵌段共聚物Mal-PEG-PDMAEMA；2将合成的二嵌段共聚物Mal-PEG-PDMAEMA与巯基CGN或Tet1肽在磷酸盐缓冲液中按摩尔比1：1的比例与室温下作用4小时，反应液用MWCO5ka的透析袋进行透析，透析液为双蒸水，冷冻干燥后获得CGN-PEG-PDMAEMA和Tet1-PEG-PDMAEMA产品；3将CGN-PEG-PDMAEMA以及Tet1-PEG-PDMAEMA分别于DEPC水中溶解，然后与Wip1基因按NP为1-10:1的比例混合，涡旋30秒，再在室温中培养20分钟后得到所述的聚合物纳米颗粒。所述的聚合物纳米颗粒在制备治疗肌萎缩侧索硬化药物中的用途，其中，优选的，所述的聚合物纳米颗粒通过抑制DNA损伤应答途径和增加神经元的存活，用于改善由SOD1G93A突变导致的肌萎缩侧索硬化。给药方式包括侧脑室、鞘内注射、静脉注射和鼻腔给药。受试者包括哺乳动物和人。本发明的提出为肌萎缩侧索硬化的预防和治疗提供了新的技术手段。附图说明图1为hSOD1G93A阳性小鼠及野生型小鼠脊髓前角运动神经元Wip1免疫荧光双染结果；其中：在小鼠脊髓前角运动神经元，Wip1阳性染色主要位于细胞质，hSOD1G93A阳性小鼠Wip1的荧光强度绿色较对照组野生型小鼠明显减弱；DAPI-蓝色细胞核；Wip1-绿色；MAP-2-红色神经元特异性标记，标尺＝20μm。图2为hSOD1G93A转基因小鼠及野生型小鼠脊髓前角运动神经元Wip1免疫组化染色A及定量分析结果B；其中：AWip1主要表达于细胞质，ALS小鼠Wip1染色较对照组小鼠明显减弱；标尺＝50；B计算结果示ALS小鼠脊髓前角运动神经元中Wip1平均光密度明显较野生型小鼠减少，差异具有统计学意义**P哈尔滨医科大学Wip1基因及其表达蛋白在治疗肌萎缩侧索硬化中的用途KLPI1810661PatentInversion3.311818DNAhuman1atggcggggctgtactcgctgggagtgagcgtcttctccgaccagggcgggaggaagtac60atggaggacgttactcaaatcgttgtggagcccgaaccgacggctgaagaaaagccctcg120ccgcggcggtcgctgtctcagccgttgcctccgcggccgtcgccggccgcccttcccggc180ggcgaagtctcggggaaaggcccagcggtggcagcccgagaggctcgcgaccctctcccg240gacgccggggcctcgccggcacctagccgctgctgccgccgccgttcctccgtggccttt300ttcgccgtgtgcgacgggcacggcgggcgggaggcggcacagtttgcccgggagcacttg360tggggtttcatcaagaagcagaagggtttcacctcgtccgagccggctaaggtttgcgct420gccatccgcaaaggctttctcgcttgtcaccttgccatgtggaagaaactggcggaatgg480ccaaagactatgacgggtcttcctagcacatcagggacaactgccagtgtggtcatcatt540cggggcatgaagatgtatgtagctcacgtaggtgactcaggggtggttcttggaattcag600gatgacccgaaggatgactttgtcagagctgtggaggtgacacaggaccataagccagaa660cttcccaaggaaagagaacgaatcgaaggacttggtgggagtgtaatgaacaagtctggg720gtgaatcgtgtagtttggaaacgacctcgactcactcacaatggacctgttagaaggagc780acagttattgaccagattccttttctggcagtagcaagagcacttggtgatttgtggagc840tatgatttcttcagtggtgaatttgtggtgtcacctgaaccagacacaagtgtccacact900cttgaccctcagaagcacaagtatattatattggggagtgatggactttggaatatgatt960ccaccacaagatgccatctcaatgtgccaggaccaagaggagaaaaaatacctgatgggt1020gagcatggacaatcttgtgccaaaatgcttgtgaatcgagcattgggccgctggaggcag1080cgtatgctccgagcagataacactagtgccatagtaatctgcatctctccagaagtggac1140aatcagggaaactttaccaatgaagatgagttatacctgaacctgactgacagcccttcc1200tataatagtcaagaaacctgtgtgatgactccttccccatgttctacaccaccagtcaag1260tcactggaggaggatccatggccaagggtgaattctaaggaccatatacctgccctggtt1320cgtagcaatgccttctcagagaattttttagaggtttcagctgagatagctcgagagaat1380gtccaaggtgtagtcataccctcaaaagatccagaaccacttgaagaaaattgcgctaaa1440gccctgactttaaggatacatgattctttgaataatagccttccaattggccttgtgcct1500actaattcaacaaacactgtcatggaccaaaaaaatttgaagatgtcaactcctggccaa1560atgaaagcccaagaaattgaaagaacccctccaacaaactttaaaaggacattagaagag1620tccaattctggccccctgatgaagaagcatagacgaaatggcttaagtcgaagtagtggt1680gctcagcctgcaagtctccccacaacctcacagcgaaagaactctgttaaactcaccatg1740cgacgcagacttaggggccagaagaaaattggaaatcctttacttcatcaacacaggaaa1800actgtttgtgtttgctga1818

权利要求：1.野生型p53诱导的蛋白磷酸酶1wild-typep53-induciblephosphatase1,Wip1及其表达蛋白在制备治疗肌萎缩侧索硬化药物中的用途。2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物通过抑制DNA损伤应答途径和增加神经元的存活，用于改善由SOD1G93A突变导致的肌萎缩侧索硬化。3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物为通过纳米载体结合Wip1基因制备得到的纳米颗粒、凝胶或乳剂，所述纳米颗粒包含但不限于聚合物纳米颗粒、脂质纳米颗粒、碳纳米颗粒、金属纳米颗粒。4.野生型p53诱导的蛋白磷酸酶1wild-typep53-induciblephosphatase1,Wip1及其表达蛋白的增效剂在制备治疗肌萎缩侧索硬化药物中的用途。5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的药物通过抑制DNA损伤应答途径和增加神经元的存活，用于改善由SOD1G93A突变导致的肌萎缩侧索硬化。6.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的增效剂为激动剂、上调剂或稳定剂。7.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的增效剂是指任何可提高Wip1基因或蛋白的活性、提高Wip1基因或蛋白的稳定性、上调Wip1基因或蛋白的表达、增加Wip1基因或蛋白有效作用时间的物质，所述的增效剂为化合物、化学小分子或生物分子。8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的生物分子可以是DNA或RNA，或是调控Wip1基因或蛋白表达的病毒产品。9.一种用于治疗肌萎缩侧索硬化的聚合物纳米颗粒，其特征在于，通过以下方法制备得到：1合成二嵌段共聚物Mal-PEG-PDMAEMA；2将合成的二嵌段共聚物Mal-PEG-PDMAEMA与巯基CGN或Tet1肽在磷酸盐缓冲液中按摩尔比1：1的比例与室温下作用4小时，反应液用MWCO5ka的透析袋进行透析，透析液为双蒸水，冷冻干燥后获得CGN-PEG-PDMAEMA和Tet1-PEG-PDMAEMA产品；3将CGN-PEG-PDMAEMA以及Tet1-PEG-PDMAEMA分别于DEPC水中溶解，然后与Wip1基因按NP为1-10:1的比例混合，涡旋30秒，再在室温中培养20分钟后得到所述的聚合物纳米颗粒。10.权利要求9所述的聚合物纳米颗粒在制备治疗肌萎缩侧索硬化药物中的用途，其中，优选的，所述的聚合物纳米颗粒通过抑制DNA损伤应答途径和增加神经元的存活，用于改善由SOD1G93A突变导致的肌萎缩侧索硬化。

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