申请/专利权人：广州润虹医药科技股份有限公司

申请日：2018-10-26

公开（公告）日：2021-06-01

公开（公告）号：CN109157679B

主分类号：A61L27/46(20060101)

分类号：A61L27/46(20060101);A61L27/50(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.06.01#授权;2019.02.01#实质审查的生效;2019.01.08#公开

摘要：本发明公开了一种纳米羟基磷灰石‑壳聚糖人工骨的制备方法，具体的，本发明采用表面改性纳米羟基磷灰石和壳聚糖作为原料，通过混合、挤出造粒、注塑成型制备人工骨，通过对纳米羟基磷灰石的表面改性，提高了纳米羟基磷灰石的分散性，改善其与壳聚糖的结合能力，使最终得到的人工骨具有更好的力学性能和亲水性。

主权项：1.一种纳米羟基磷灰石壳聚糖人工骨的制备方法，其采用表面改性的纳米羟基磷灰石和丁酰化的壳聚糖作为原料，具体方法为，取表面改性的纳米羟基磷灰石和丁酰化的壳聚糖混合均匀，100～150℃真空干燥2～24小时后，共混挤出后经注塑成型，得人工骨材料；所述表面改性纳米羟基磷灰石与丁酰化壳聚糖的质量比为7：1～7：9；所述表面改性的纳米羟基磷灰石制备方法为，取浓度为2～10％的聚乙二醇水溶液，边搅拌边加入纳米羟基磷灰石，加入完毕后30～80℃保温搅拌2～10h，超声分散1～5h，过滤，滤饼依次用无水乙醇、氯仿洗涤，晾干有机溶剂后，80～140℃下真空干燥8～40h，研磨，即得改性纳米羟基磷灰石；所述丁酰化壳聚糖制备方法为，取壳聚糖粉，冰水浴中加入甲磺酸，搅拌使壳聚糖充分溶胀，持续搅拌状态下缓慢滴加丁酸酐，室温反应8小时后，-20℃过夜，取出，滤过，双蒸水悬浮，用氨水调pH值为7，煮沸2h，趁热滤过，乙醚洗涤，30～80℃下真空干燥48h，即得。

全文数据：一种纳米羟基磷灰石-壳聚糖人工骨的制备方法技术领域本发明属于生物医药材料领域，具体涉及一种纳米羟基磷灰石-壳聚糖人工骨的制备方法。背景技术生物医药材料的研究是近几十年来发展起来的一门新兴交叉学科，随着全球老龄化趋势发展和骨创伤频繁发生，骨修复和骨替代材料逐渐成为该领域中的重点。随着人们对材料性能要求的逐步提高，单一种类的生物材料难以满足临床的要求，因而采用不同性质的材料进行复合，以获取具有优良临床性能的复合生物材料是目前研究的热点。随着研究的不断深入，对于纳米羟基磷灰石壳聚糖复合材料的研究已经取得较大进展。实践证明，纳米羟基磷灰石壳聚糖体系复合材料可获得良好的骨诱导性、匹配的降解速率。中国专利CN102276879A“纤维状纳米羟基磷灰石壳聚糖复合材料及其制备方法”公开了一种使用纤维状纳米羟基磷灰石与壳聚糖制备复合材料的方法，提供了一种抗压强度高、纳米羟基磷灰石的含量适宜的纤维状纳米羟基磷灰石壳聚糖复合材料及其制备方法。但在实际应用过程中，仍然存在纳米羟基磷灰石与壳聚糖界面结合不太理想，粒子分散不均匀等问题，所得材料制成的支架或人工骨脆性大、力学性能差。因此，人们通过各种手段改善纳米羟基磷灰石和壳聚糖的结合行为，中国专利CN101352585A公开了“颗粒定向排列的纳米羟基磷灰石壳聚糖支架的制备方法”，该支架中的羟基磷灰石颗粒在壳聚糖基体中分散良好且与壳聚糖之间形成有效、稳定的键合，并呈现定向排列，从而在结构和功能上实现纳米羟基磷灰石与壳聚糖的有效复合。此外，由于壳聚糖分子内、分子间有强的氢键缔合，使得壳聚糖呈紧密的晶态结构，不熔融，也不溶于普通的有机溶剂，造成加工困难，限制了其推广应用。发明内容本发明提供了一种纳米羟基磷灰石-壳聚糖人工骨的制备方法，该方法使用表面改性纳米羟基磷灰石和丁酰化壳聚糖，提高了纳米羟基磷灰石的分散性，改善两者的结合能力，使最终得到的人工骨具有更好的力学性能和生物相容性。具体的，本发明采用如下技术方案：一种纳米羟基磷灰石壳聚糖人工骨的制备方法，其采用表面改性的纳米羟基磷灰石和丁酰化的壳聚糖作为原料，具体方法为，取表面改性的纳米羟基磷灰石和丁酰化的壳聚糖混合均匀，100～150℃真空干燥2～24小时后，共混挤出后经注塑成型，得人工骨材料。优选的，所述表面改性纳米羟基磷灰石与丁酰化壳聚糖的质量比为7：1～7：9。优选的，所述混合挤出的主要工艺参数为，加工温度120～220℃，螺杆转速60～100rmin，反应时间3～10min。优选的，所述注塑成型步骤的主要工艺参数为，模具温度40～100℃，注塑压力40～80MPa，保压压力10～50MPa，保压时间8～24s。优选的，所述表面改性的纳米羟基磷灰石为聚乙二醇改性纳米羟基磷灰石。优选的，所述的表面改性的纳米羟基磷灰石的制备方法为，取浓度为2～10％的聚乙二醇水溶液，边搅拌边加入纳米羟基磷灰石，加入完毕后30～80℃保温搅拌2～10h，超声分散1～5h，过滤，滤饼依次用无水乙醇、氯仿洗涤，晾干有机溶剂后，80～140℃下真空干燥8～40h，研磨，即得改性纳米羟基磷灰石。进一步优选的，使用的聚乙二醇为聚乙二醇200、聚乙二醇400、聚乙二醇600、聚乙二醇800、聚乙二醇1000中的一种或几种。优选的，丁酰化壳聚糖的制备方法为，取壳聚糖粉，冰水浴中加入甲磺酸，搅拌使壳聚糖充分溶胀，持续搅拌状态下缓慢滴加丁酸酐，室温反应8小时后，-20℃过夜，取出，滤过，双蒸水悬浮，用氨水调pH值为7，煮沸2h，趁热滤过，乙醚洗涤，30～80℃下真空干燥48h，即得。进一步优选的，真空干燥的条件为60℃下真空干燥48h。本发明还公开了应用本方法获得的人工骨产品。一种纳米羟基磷灰石-壳聚糖人工骨的制备方法，其采用表面改性的纳米羟基磷灰石和壳聚糖作为原料，具体方法为，取表面改性的纳米羟基磷灰石和壳聚糖粒料混合均匀，100～150℃真空干燥2～24小时后，挤出造粒，所得粒料经真空干燥后，注塑成型为所需的形状。优选的，所述表面改性的纳米羟基磷灰石与壳聚糖的质量比为7：1～7：9。优选的，所述挤出造粒步骤的主要工艺参数为，挤出机温度120～220℃，挤出量3.0～6.0kgh。优选的，挤出后颗粒在60～110℃下真空干燥5～15小时。优选的，所述注塑成型步骤的主要工艺参数为，模具温度40～100℃，熔体温度200～280℃，填充时间0.2～1.5s，保压压力填充百分比50～110％，保压时间3～15s，冷却时间3～15s。优选的，所述表面改性的纳米羟基磷灰石为聚乙二醇改性纳米羟基磷灰石。优选的，所述表面改性的纳米羟基磷灰石的制备方法为，取浓度为2～10％的聚乙二醇水溶液，边搅拌边加入纳米羟基磷灰石，加入完毕后30～80℃保温搅拌2～10h，超声分散1～5h，过滤，滤饼依次用无水乙醇、氯仿洗涤，晾干有机溶剂后，80～140℃下真空干燥8～40h，研磨，即得改性纳米羟基磷灰石。进一步优选的，使用的聚乙二醇为聚乙二醇200、聚乙二醇400、聚乙二醇600、聚乙二醇800、聚乙二醇1000中的一种。通过以上的技术方案，本发明与现有技术相比，具有如下的突出特点：1.本发明采用表面改性纳米羟基磷灰石作为原料，通过表面改性，使纳米羟基磷灰石的分散性得到了显著的改善，使纳米羟基磷灰石在壳聚糖基体中具有良好的分散状态，两者能够形成稳定的结合状态，利于人工骨的力学性能和生物相容性。2.本发明采用丁酰化壳聚糖，具有一定的液晶性和良好的加工性能，进一步保证了纳米羟基磷灰石与壳聚糖的界面结合力。3.本发明采用混合挤出注塑成型的工艺制备人工骨，制备工艺简单，工艺参数可控，适于工业大生产，同时，本发明采取的方法能够根据需要制备特定形状的人工骨。具体实施方式下面结合具体实施例，对本发明作进一步的说明。应当注意的是，以下实施例中的具体实施方式并不能对本发明构成限制。以下实施例中，如无特殊说明，涉及的试剂均可以从商品渠道得到。实施例1纳米羟基磷灰石-壳聚糖人工骨的制备1.制备表面改性的纳米羟基磷灰石。取聚乙二醇600，配置成5％的水溶液，搅拌下加入纳米羟基磷灰石，加完后，于55℃保温搅拌6小时，然后超声分散3小时，过滤，滤饼依次用无水乙醇、氯仿洗涤后，晾干有机溶剂，在100℃下真空干燥24小时，研磨，即得表面改性纳米羟基磷灰石。2.制备丁酰化壳聚糖。取壳聚糖粉，冰水浴中加入甲磺酸，搅拌使壳聚糖充分溶胀，持续搅拌状态下缓慢滴加丁酸酐，室温反应8小时后，-20℃过夜，取出，滤过，双蒸水悬浮，用氨水调pH值为7，煮沸2h，趁热滤过，乙醚洗涤，60℃下真空干燥48h，即得。3.混合挤出。取表面改性纳米羟基磷灰石和丁酰壳聚糖，按质量比7：3混合均匀，在110℃下真空干燥8小时后，加入到挤出机中，设定加工温度160℃，螺杆转速80rmin，反应时间5min.4.注塑成型。挤出得到的物料加入到自动注塑机中，设置注塑机工作参数为：模具温度80℃，注塑压力60MPa，保压压力30MPa，保压时间15s。物料按照预先设置的形状进行加工，即得产品。实施例2纳米羟基磷灰石-壳聚糖人工骨的制备1.制备表面改性的纳米羟基磷灰石。取聚乙二醇800，配置成5％的水溶液，搅拌下加入纳米羟基磷灰石，加完后，于60℃保温搅拌6小时，然后超声分散3.5小时，过滤，滤饼依次用无水乙醇、氯仿洗涤后，晾干有机溶剂，在90℃下真空干燥24小时，研磨，即得表面改性纳米羟基磷灰石。2.制备丁酰化壳聚糖。取壳聚糖粉，冰水浴中加入甲磺酸，搅拌使壳聚糖充分溶胀，持续搅拌状态下缓慢滴加丁酸酐，室温反应8小时后，-20℃过夜，取出，滤过，双蒸水悬浮，用氨水调pH值为7，煮沸2h，趁热滤过，乙醚洗涤，30℃下真空干燥48h，即得。3.混合挤出。取表面改性纳米羟基磷灰石和丁酰壳聚糖，按质量比2：1混合均匀，在110℃下真空干燥8小时后，加入到挤出机中，设定加工温度180℃，螺杆转速75rmin，反应时间6min.4.注塑成型。挤出得到的物料加入到自动注塑机中，设置注塑机工作参数为：模具温度70℃，注塑压力70MPa，保压压力40MPa，保压时间10s。物料按照预先设置的形状进行加工，即得产品。实施例3纳米羟基磷灰石-壳聚糖人工骨的制备1.制备表面改性的纳米羟基磷灰石。取聚乙二醇1000，配置成10％的水溶液，搅拌下加入纳米羟基磷灰石，加完后，于80℃保温搅拌10小时，然后超声分散3小时，过滤，滤饼依次用无水乙醇、氯仿洗涤后，晾干有机溶剂，在140℃下真空干燥40小时，研磨，即得表面改性纳米羟基磷灰石。2.制备丁酰化壳聚糖。取壳聚糖粉，冰水浴中加入甲磺酸，搅拌使壳聚糖充分溶胀，持续搅拌状态下缓慢滴加丁酸酐，室温反应8小时后，-20℃过夜，取出，滤过，双蒸水悬浮，用氨水调pH值为7，煮沸2h，趁热滤过，乙醚洗涤，80℃下真空干燥48h，即得。3.混合挤出。取表面改性纳米羟基磷灰石和丁酰壳聚糖，按质量比7：9混合均匀，在150℃下真空干燥24小时后，加入到挤出机中，设定加工温度220℃，螺杆转速100rmin，反应时间10min.4.注塑成型。挤出得到的物料加入到自动注塑机中，设置注塑机工作参数为：模具温度100℃，注塑压力80MPa，保压压力50MPa，保压时间24s。物料按照预先设置的形状进行加工，即得产品。实施例4纳米羟基磷灰石-壳聚糖人工骨的制备1.制备表面改性的纳米羟基磷灰石。取聚乙二醇200，配置成3％的水溶液，搅拌下加入纳米羟基磷灰石，加完后，于30℃保温搅拌10小时，然后超声分散5小时，过滤，滤饼依次用无水乙醇、氯仿洗涤后，晾干有机溶剂，在80℃下真空干燥8小时，研磨，即得表面改性纳米羟基磷灰石。2.制备丁酰化壳聚糖。取壳聚糖粉，冰水浴中加入甲磺酸，搅拌使壳聚糖充分溶胀，持续搅拌状态下缓慢滴加丁酸酐，室温反应8小时后，-20℃过夜，取出，滤过，双蒸水悬浮，用氨水调pH值为7，煮沸2h，趁热滤过，乙醚洗涤，30℃下真空干燥48h，即得。3.混合挤出。取表面改性纳米羟基磷灰石和丁酰壳聚糖，按质量比7：1混合均匀，在100℃下真空干燥2小时后，加入到挤出机中，设定加工温度120℃，螺杆转速60rmin，反应时间3min.4.注塑成型。挤出得到的物料加入到自动注塑机中，设置注塑机工作参数为：模具温度40℃，注塑压力40MPa，保压压力10MPa，保压时间8s。物料按照预先设置的形状进行加工，即得产品。实施例5纳米羟基磷灰石-壳聚糖人工骨的制备1.制备表面改性的纳米羟基磷灰石。取聚乙二醇600，配置成8％的水溶液，搅拌下加入纳米羟基磷灰石，加完后，于65℃保温搅拌6小时，然后超声分散2小时，过滤，滤饼依次用无水乙醇、氯仿洗涤后，晾干有机溶剂，在110℃下真空干燥18小时，研磨，即得表面改性纳米羟基磷灰石。2.制备丁酰化壳聚糖。取壳聚糖粉，冰水浴中加入甲磺酸，搅拌使壳聚糖充分溶胀，持续搅拌状态下缓慢滴加丁酸酐，室温反应8小时后，-20℃过夜，取出，滤过，双蒸水悬浮，用氨水调pH值为7，煮沸2h，趁热滤过，乙醚洗涤，55℃下真空干燥48h，即得。3.混合挤出。取表面改性纳米羟基磷灰石和丁酰壳聚糖，按质量比7：4混合均匀，在100℃下真空干燥8小时后，加入到挤出机中，设定加工温度160℃，螺杆转速90rmin，反应时间10min.4.注塑成型。挤出得到的物料加入到自动注塑机中，设置注塑机工作参数为：模具温度80℃，注塑压力60MPa，保压压力40MPa，保压时间10s。物料按照预先设置的形状进行加工，即得产品。实施例6纳米羟基磷灰石-壳聚糖人工骨的制备1.制备表面改性的纳米羟基磷灰石。取聚乙二醇400，配置成6％的水溶液，搅拌下加入纳米羟基磷灰石，加完后，于55℃保温搅拌6小时，然后超声分散3小时，过滤，滤饼依次用无水乙醇、氯仿洗涤后，晾干有机溶剂，在95℃下真空干燥36小时，研磨，即得表面改性纳米羟基磷灰石。2.制备丁酰化壳聚糖。取壳聚糖粉，冰水浴中加入甲磺酸，搅拌使壳聚糖充分溶胀，持续搅拌状态下缓慢滴加丁酸酐，室温反应8小时后，-20℃过夜，取出，滤过，双蒸水悬浮，用氨水调pH值为7，煮沸2h，趁热滤过，乙醚洗涤，55℃下真空干燥48h，即得。3.混合挤出。取表面改性纳米羟基磷灰石和丁酰壳聚糖，按质量比1：1混合均匀，在110℃下真空干燥8小时后，加入到挤出机中，设定加工温度180℃，螺杆转速90rmin，反应时间6min.4.注塑成型。挤出得到的物料加入到自动注塑机中，设置注塑机工作参数为：模具温度50℃，注塑压力60MPa，保压压力30MPa，保压时间20s。物料按照预先设置的形状进行加工，即得产品。实施例7纳米羟基磷灰石-壳聚糖人工骨的制备1.制备表面改性的纳米羟基磷灰石。取聚乙二醇800，配置成8％的水溶液，搅拌下加入纳米羟基磷灰石，加完后，于75℃保温搅拌7小时，然后超声分散4小时，过滤，滤饼依次用无水乙醇、氯仿洗涤后，晾干有机溶剂，在100℃下真空干燥16小时，研磨，即得表面改性纳米羟基磷灰石。2.制备丁酰化壳聚糖。取壳聚糖粉，冰水浴中加入甲磺酸，搅拌使壳聚糖充分溶胀，持续搅拌状态下缓慢滴加丁酸酐，室温反应8小时后，-20℃过夜，取出，滤过，双蒸水悬浮，用氨水调pH值为7，煮沸2h，趁热滤过，乙醚洗涤，40℃下真空干燥48h，即得。3.混合挤出。取表面改性纳米羟基磷灰石和丁酰壳聚糖，按质量比7：8混合均匀，在100℃下真空干燥8小时后，加入到挤出机中，设定加工温度150℃，螺杆转速60rmin，反应时间8min.4.注塑成型。挤出得到的物料加入到自动注塑机中，设置注塑机工作参数为：模具温度60℃，注塑压力75MPa，保压压力45MPa，保压时间18s。物料按照预先设置的形状进行加工，即得产品。实施例8纳米羟基磷灰石-壳聚糖人工骨的制备1.制备表面改性的纳米羟基磷灰石。取聚乙二醇600，配置成5％的水溶液，搅拌下加入纳米羟基磷灰石，加完后，于45℃保温搅拌8小时，然后超声分散4小时，过滤，滤饼依次用无水乙醇、氯仿洗涤后，晾干有机溶剂，在100℃下真空干燥24小时，研磨，即得表面改性纳米羟基磷灰石。2.制备丁酰化壳聚糖。取壳聚糖粉，冰水浴中加入甲磺酸，搅拌使壳聚糖充分溶胀，持续搅拌状态下缓慢滴加丁酸酐，室温反应8小时后，-20℃过夜，取出，滤过，双蒸水悬浮，用氨水调pH值为7，煮沸2h，趁热滤过，乙醚洗涤，55℃下真空干燥48h，即得。3.混合挤出。取表面改性纳米羟基磷灰石和丁酰壳聚糖，按质量比7：2混合均匀，在110℃下真空干燥7小时后，加入到挤出机中，设定加工温度1500℃，螺杆转速75rmin，反应时间4min.4.注塑成型。挤出得到的物料加入到自动注塑机中，设置注塑机工作参数为：模具温度60℃，注塑压力50MPa，保压压力30MPa，保压时间15s。物料按照预先设置的形状进行加工，即得产品。实施例9纳米羟基磷灰石-壳聚糖人工骨的制备1.制备表面改性的纳米羟基磷灰石。取聚乙二醇800，配置成4％的水溶液，搅拌下加入纳米羟基磷灰石，加完后，于65℃保温搅拌8小时，然后超声分散3小时，过滤，滤饼依次用无水乙醇、氯仿洗涤后，晾干有机溶剂，在100℃下真空干燥18小时，研磨，即得表面改性纳米羟基磷灰石。2.制备丁酰化壳聚糖。取壳聚糖粉，冰水浴中加入甲磺酸，搅拌使壳聚糖充分溶胀，持续搅拌状态下缓慢滴加丁酸酐，室温反应8小时后，-20℃过夜，取出，滤过，双蒸水悬浮，用氨水调pH值为7，煮沸2h，趁热滤过，乙醚洗涤，80℃下真空干燥48h，即得。3.混合挤出。取表面改性纳米羟基磷灰石和丁酰壳聚糖，按质量比7：3混合均匀，在120℃下真空干燥10小时后，加入到挤出机中，设定加工温度150℃，螺杆转速85rmin，反应时间8min.4.注塑成型。挤出得到的物料加入到自动注塑机中，设置注塑机工作参数为：模具温度65℃，注塑压力45MPa，保压压力45MPa，保压时间18s。物料按照预先设置的形状进行加工，即得产品。对比例纳米羟基磷灰石壳聚糖支架的制备本对比例参考中国专利CN101352585A“颗粒定向排列的纳米羟基磷灰石壳聚糖支架的制备方法”说明书中实施例1，具体为：步骤一：纳米羟基磷灰石溶胶的制备1以聚乙烯吡咯烷酮PVPK15同时为模板剂、分散剂、改性剂；2使用去离子水配制含硝酸钙0.01molL，磷酸氢二铵0.006molL的溶液，然后将0.1gPVPK15加入到上述硝酸钙溶液中充分溶解；3采用100转分的高速分散机，在氨水控制体系pH值为10.6条件下，将上述1、2的物料充分进行混合，形成纳米羟基磷灰石HA溶胶，使该纳米羟基磷灰石溶胶体系中钙磷摩尔比达1.6∶1，按质量百分比计聚乙烯吡咯烷酮含量为0.01％；步骤二：纳米羟基磷灰石溶胶的陈化上述纳米羟基磷灰石溶胶在20℃的温度下，自然放置陈化24小时，然后用去离子水充分洗涤溶胶得到颗粒定向排列的纳米羟基磷灰石溶胶；步骤三：纳米羟基磷灰石壳聚糖支架的成型1用质量百分比浓度为2％醋酸溶液配制质量百分比为1％的壳聚糖溶液；2采用100转分的速度的高速分散机，按照纳米羟基磷灰石溶胶∶壳聚糖溶质的质量比为9∶1的比例，将壳聚糖溶液与步骤二的纳米羟基磷灰石溶胶充分混合，得到纳米羟基磷灰石壳聚糖的混合液；3将纳米羟基磷灰石壳聚糖的混合液静置除去气泡后注入模型，置于-5℃的超低温冰箱中冷冻24小时，接着转入冷冻干燥机中冷冻干燥24小时，即得到纳米羟基磷灰石壳聚糖支架；步骤四：纳米羟基磷灰石壳聚糖支架的后处理1首先将纳米羟基磷灰石壳聚糖支架用质量百分比浓度为0.5％的氨水浸泡1小时，然后再用去离子水浸泡3小时，每隔半小时换一次水；2将清洗后的支架材料放回模型，再次放入-5℃的超低温冰箱中冷冻24小时后再转入冷冻干燥机中冷冻干燥24小时，最后得到颗粒定向排列的纳米羟基磷灰石壳聚糖支架。试验例1人工骨力学性能测试取本发明实施例1、实施例2以及对比例的方法制备的人工骨或支架，作为样品，采用三点抗弯法，以万能试验机测定人工骨支架材料的抗拉强度、抗弯强度和弹性模量，测试指点的跨距为25mm，加载速率为5.00mmmin。结果见表1。表1力学性能测试结果表n＝10由表1可见，本发明公开的方法制备的人工骨有较好的力学性能，并且根据资料，人体骨骼的弹性模量为17-18.9GPa，抗弯强度160MPa，本发明制备的人工骨材料极其接近这个数据。试验例2亲水性试验取本发明实施例1、实施例2以及对比例的方法制备的人工骨或支架，作为样品，使用接触角测试仪测定水与样品及对照的接触角，以评价样品的亲水性。结果显示，实施例1、实施例2所得到的人工骨的接触角分别为45.3°和47.2°，对照即对比实施例的人工骨材料的接触角测定结果为68.4°。生物材料的亲水性对细胞在材料表面的黏附、增殖、分化能力具有重要影响，是体外实验中评价生物相容性的重要指标。接触角又称亲水角，是指在气、液、固三相交点处所作的气-液界面的切线穿过液体与固-液交界线之间的夹角θ，是对材料亲水性能的量度。本试验的结果表明本发明提供的方法明显改善了纳米羟基磷灰石-壳聚糖材料的亲水性，可以推断人工骨具有较好的生物相容性。试验例3体外细胞生物相容性试验利用小鼠胚胎干细胞检测人工骨材料的细胞生物相容性。主要试验材料及步骤如下：1.细胞传代培养：取C57小鼠胚胎干细胞MESCs第2代传代细胞悬浮培养5d，经0.05％胰酶+0.02％EDTA消化后制成单细胞悬液，备用。2.人工骨材料准备：本发明实施例1、实施例2以及对比例的方法制备的人工骨或支架，制成厚0.2cm，宽0.5cm的正方形片状，用蒸馏水超声下清洗45min，放入干燥箱干燥24h，高温高压消毒备用。3.将步骤1中的单细胞悬液分为试验组、空白组、对照组，其中试验组与实施例1、实施例2制备的人工骨混合培养，对照组与对比例制备的人工骨混合培养，空白组继续单纯培养MESCs细胞。分别于第2、4、6、8天行MTT法检测细胞增殖活性。选择490nm波长，以酶联免疫检测仪检测光密度值。4.试验结果：培养期内MTT法检测MESCs细胞的增殖情况结果见表2。表2MTT法检测MESCs细胞的增殖结果n＝5组别2d4d6d8d*试验组1实施例10.192±0.0260.401±0.029*0.465±0.033*0.565±0.027**试验组2实施例20.194±0.0180.405±0.0220.458±0.042*0.566±0.032*对照组0.191±0.0200.389±0.0310.449±0.018*0.534±0.016空白组0.192±0.0130.392±0.0170.428±0.0340.507±0.042注：*表示与空白组相比，P＜0.05；**表示与空白组比较，P＜0.01。由上表结果可知，实验组、对照组与空白组比较，细胞增殖情况在粘附培养早期无显著性差异，表明在粘附培养早期本发明的人工骨材料对MESCs增殖未产生不良影响；在粘附培养后期，实验组细胞增殖数据明显高于对照组和空白组，表明后期本发明的人工骨材料对MESCs增殖具有促进作用。以上结果提示，本发明的人工骨材料具有良好的的细胞生物相容性，对细胞增殖无毒性作用。

权利要求：1.一种纳米羟基磷灰石壳聚糖人工骨的制备方法，其采用表面改性的纳米羟基磷灰石和丁酰化的壳聚糖作为原料，具体方法为，取表面改性的纳米羟基磷灰石和丁酰化的壳聚糖混合均匀，100～150℃真空干燥2～24小时后，共混挤出后经注塑成型，得人工骨材料。2.如权利要求1所述的人工骨的制备方法，其特征在于，所述表面改性纳米羟基磷灰石与丁酰化壳聚糖的质量比为7：1～7：9。3.如权利要求1所述的人工骨的制备方法，其特征在于，所述混合挤出的主要工艺参数为，加工温度120～220℃，螺杆转速60～100rmin，反应时间3～10min。4.如权利要求1所述的人工骨的制备方法，其特征在于，所述注塑成型步骤的主要工艺参数为，模具温度40～100℃，注塑压力40～80MPa，保压压力10～50MPa，保压时间8～24s。5.如权利要求1所述的人工骨的制备方法，其特征在于，所述表面改性的纳米羟基磷灰石为聚乙二醇改性纳米羟基磷灰石。6.如权利要求1所述的人工骨的制备方法，其特征在于，所述表面改性的纳米羟基磷灰石制备方法为，取浓度为2～10％的聚乙二醇水溶液，边搅拌边加入纳米羟基磷灰石，加入完毕后30～80℃保温搅拌2～10h，超声分散1～5h，过滤，滤饼依次用无水乙醇、氯仿洗涤，晾干有机溶剂后，80～140℃下真空干燥8～40h，研磨，即得改性纳米羟基磷灰石。7.如权利要求6所述的人工骨的制备方法，其特征在于，所述聚乙二醇为聚乙二醇200、聚乙二醇400、聚乙二醇600、聚乙二醇800、聚乙二醇1000中的一种或几种。8.如权利要求1所述的人工骨的制备方法，其特征在于，所述丁酰化壳聚糖制备方法为，取壳聚糖粉，冰水浴中加入甲磺酸，搅拌使壳聚糖充分溶胀，持续搅拌状态下缓慢滴加丁酸酐，室温反应8小时后，-20℃过夜，取出，滤过，双蒸水悬浮，用氨水调pH值为7，煮沸2h，趁热滤过，乙醚洗涤，30～80℃下真空干燥48h，即得。9.如权利要求8所述的人工骨的制备方法，其特征在于，真空干燥的条件为60℃下真空干燥48h。10.一种根据权利要求1-9任一项所述的人工骨的制备方法获得的产品。

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