申请/专利权人：中国人民解放军南京军区南京总医院

申请日：2018-09-17

公开（公告）日：2021-07-23

公开（公告）号：CN109022466B

主分类号：C12N15/62(20060101)

分类号：C12N15/62(20060101);C12N15/11(20060101);C12Q1/6858(20180101);C12Q1/6886(20180101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.07.23#授权;2019.01.11#实质审查的生效;2018.12.18#公开

摘要：本发明公开了一种ACTA2‑MITF融合基因及其检测引物和应用。ACTA2‑MITF基因融合发生于ACTA2的2号外显子与MITF基因3号外显子之间；ACTA2基因位于ACTA2基因位于10q23.31，所述的融合基因包含SEQIDNO.3所示的核苷酸序列。检测ACTA2‑MITF易位性肿瘤的PCR引物，由SEQIDNO.1和SEQIDNO.2组成。ACTA2‑MITF融合基因的检测试剂在制备ACTA2‑MITF易位性肿瘤诊断试剂中的应用。本发明针对高通量测序发现的新融合基因设计了特异性的PCR引物，扩大了原有检测手段的检测范围，应用于临床，可提高诊断MiT家族易位性肾细胞癌的检出率和准确率。

主权项：1.ACTA2-MITF融合基因的检测试剂在制备ACTA2-MITF易位性血管周上皮样细胞肿瘤诊断试剂中的应用；所述的融合基因包含SEQIDNO.3所示的核苷酸序列；所述的ACTA2-MITF融合基因的检测试剂为检测ACTA2-MITF融合基因的特异性引物；所述的检测ACTA2-MITF融合基因的特异性引物为：ACTA2-E2-F2：SEQIDNO.1；MITF-E3-R4：SEQIDNO.2。

全文数据：_种AGTA2-MITF融合基因及其检测引物和应用技术领域[0001]本发明属于医学检验领域，涉及一种ACTA2-MITF融合基因及其检测引物和应用。背景技术[0002]小眼畸形转录因子家族（microphthalmia-associatedtranscriptionfactorfamily，MiT包括了小眼畸形转录因子MiTF、TFE3、TFEB和TFEC基因。[0003]目前已经发现了Xpll.2易位TFE3基因融合相关性肾细胞癌和t6;llp21;ql2易位TFEB基因融合相关性肾细胞癌，这两类肿瘤己被2016版新版WHO肾脏肿瘤病理收录，并且一并归入MiT家族易位性肾细胞癌中。近期本研宄团队利用高通量测序技术成功诊断出一例PRCC-MITF易位性肾细胞癌，这也填补了MiT家族易位性肾细胞中MiTF易位类型的空白。目前MITF易位性肾癌包括PRCC-MITF和CLTC-MITF两种基因易位模式。TFEC基因易位的肿瘤在世界范围内暂无文献报道。[0004]MiT家族易位性肾细胞癌致病机理清晰明确，MiT家族成员基因（TFE3TFEB的易位是其关键致病因素:这类肿瘤均涉及MiT家族成员基因同其它染色体易位及其所致形成融合基因，通过启动子变换从而高表达TFE3TFEB融合蛋白，而TFE3TFEB作为一个转录因子，通过与特异的DNA结构相结合，转录调控体内多种基因表达最终致病。目前至少有1〇种不同的易位伴侣和融合基因被报道，包括ASPL-TFE3、PRCC-TFE3、SFPQ-TFE3、N0N0-TFE3、CLTC-TFE3、LUC7L3-TFE3、KHSRP-TFE3、PARP14-TFE3、DVL2-TFE3、RBM10-TFE3和MALAT1-TFEB等，每例肿瘤内仅存在单一的易位形式。[0005]此外，越来越多的TFE3相关的间叶源性肿瘤被报道，如伴有TFE3基因重排的血管周上皮样细胞肿瘤perivascularepithelioidcelltumor，PEComa，该肿瘤与不伴有TFE3基因重排的PEComa相比具有更加侵袭性的生物学行为，患者多出现肿瘤复发、转移或死亡。研究发现SFPQ-TFE3融合基因是其最常见的融合基因，偶尔也可见其他融合基因，如N0N0-TFE3、DVL2-TFE3及MED15-TFE3。[0006]有证据表明哺乳动物雷帕霉素革巴蛋白（mammaliantargetofrapamycin，mT0R信号通路在多种MiT基因相关性肿瘤中被激活。MiT基因家族接受mTOR信号通路的调控。随着肿瘤个体化及靶向治疗时代的到来，针对mTOR等基因靶向治疗成为MiT基因家族易位相关性肿瘤患者新的选择。因此，精确诊断此类肿瘤显得十分重要。[0007]本发明科研团队通过高通量测序技术，在一例形态学符合血管周上皮样细胞肿瘤PEComa特征的病例中检测出ACTA2-MITF融合基因，该融合基因型为首次发现，国内外均无报道，且这是国际首次发现MITF基因易位相关性PEComa。[0008]目釗尚通量测序是唯一可以明确未知易位位点的检测手段，然而高通量测序费用高昂，检测周期长，检测平台稀缺，对样品质量要求高，不利于普及推广，对于大多数患者来说也不是首选检测手段。依赖以往经验，针对已知的融合位点设计特异性的PCR引物组合，对肿瘤组织中提取出的RNA逆转录之后进行PCR扩增并测序，检测融合基因具体易位位点i是最准确、便捷、经济的方法。因此，发现新的致病融合位点，进而设计pCR引物将有利于肘^基因家族易位相关的PEComa检测准确度的进一步提局。发明内容[0009]本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种MITF的新易位伴侣:ACTA2-MHF融合基因。[0010]本发明的另一目的是提供该ACTA2-MITF融合基因的检测引物。[0011]本发明的又一目的是提供引物的应用。[0012]本发明的目的可通过以下技术方案实现：[0013]—种ACTA2-MITF融合基因，为MITF的新易位伴侣，基因融合发生于ACTA2的2号外显子与MITF基因3号外显子之间；ACTA2基因位于10q23.3110号染色体，位置88935074-88991397,序列来自GeneBank，序列版本号GRCh38.pl2，共10个外显子;所述的新融合基因优选包含SEQIDN0.3所示的核苷酸序列。[0014]我们通过高通量测序方法检测未知融合基因的PEComa肿瘤患者的标本，发现所述的MITF的新基因易位。本发明ACTA2-MITF基因易位，这一位点国内外文献均未报道过，原有MITF融合基因扩增引物也无法检测出这一融合基因，因此会导致漏诊。[0015]本发明所述的ACTA2-MITF融合基因的检测试剂在制备ACTA2-MITF易位性肿瘤诊断试剂中的应用。[0016]所述的ACTA2-MITF融合基因的检测试剂优选检测ACTA2-MITF融合基因的特异性引物。[0017]所述的检测ACTA2-MITF融合基因的特异性引物进一步优选为:ACTA2-E2-F2:SEQIDN0.1;MITF-E3-R4:SEQIDN0.2。[0018]—种检测ACTA2-MITF易位性肿瘤的PCR引物，为检测本发明所述的ACTA2-MITF融合基因的PCR引物。所有能够检测本发明所述ACTA2-MITF融合基因的引物对均在本发明的保护范围内。[0019]针对本发明找到的新的融合基因，我们在ACTA2的2号外显子和MITF的3号外显子内分别设计引物。遵循引物设计原则，引物最好在模板cDNA的保守区内设计，引物长度在15bp-30bp之间，引物GC含量在40%〜60%之间，退火温度最好接近72°C，引物自身及引物之间不应存在互补序列，扩增条带单一特异。由于工作中经常需要在石蜡固定标本中开展工作，石蜡标本RNA碎裂严重，因此扩增产物不宜过长，需要控制在300bp以下。[0020]经过多次调试和验证，最终设计的引物序列为：ACTA2-E2-F2:GCTATGTGTGAAGAAGAGGACSEQIDNO.1；MITF-E3-R4：AAGTGGTAGAAAGGTACTGCTSEQIDNO.2，理论扩增产物长217bp，扩增产物（融合基因）的全部序列如下：GCTATGTGTGAAGAAGAGGACAGCACTGCCTTGGTGTGTGACAATGGCTCTGGGCTCTGTAAGGCCGGCTTTGCTGGGGACGATGCTCCCAGGGCTGTTTTCCCATCCATTGTGGGACGTCCCAGACATCAGGTGCAGACCCACCTCGAAAACCCCACCAAGTACCACATACAGCAAGCCCAACGGCAGCAGGTAAAGCAGTACCTTTCTACCACTTSEQIDN0.3〇经实验验证，该引物可成功扩增出目的条带，条带单一、特异。[0021]一种ACTA2_MITF易位性肿瘤诊断试剂盒，包括本发明所述的PCR引物。[0022]有益效果：[0023]本发明针对高通量测序发现的新融合基因设计了特异性的PCR引物，扩大了原有检测手段的检测范围，应用于临床，可提高诊断MiT家族易位性肾细胞癌的检出率和准确率。为诊断分型及分子靶向治疗提供依据。根据我们的实验结果，该引物组合诊断的特异性和敏感性均达到了100%，且操作对象只需要在石蜡包埋组织切片上进行，时间仅为三个工作日。采用本发明提供的引物组合进行检测PRCCHOTF易位性肿瘤，不但方便、快速、可靠而且检出率高，可用于制备ACTA2-MITF易位性肿瘤诊断试剂盒，为ACTA2_MITF易位性肿瘤的快速准确的诊断提供了新的工具。附图说明[0024]图1:在已知ACTA2-MITF融合型肿瘤中应用本发明引物组合ACTA2-E2_F;MITF-E3-R进行验证，成功检出的ACTA2-MITF融合基因测序图。具体实施方式[0025]以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。[0026]实施例1针对明确诊断的病例进行验证：[0027]本发明团队通过高通量测序技术，在一例形态学符合血管周上皮样细胞肿瘤特征的病例中检测出ACTA2-MITF融合基因，发现该基因由ACTA2外显子2和MITF外显子3融合形成。对于这例高通量测序RNA-seq检测出ACTA2exon2_MITFexon3新融合基因的病例，使用我们设计的引物对该病例的石蜡包埋组织切片进行PCRRT-PCR验证。[0028]—、RNA的提取：[0029]严格按照RNeasyFFPEKit操作说明进行提取。①脱蜡:将收集好的玻片进行二甲苯脱蜡，再用无水乙醇漂洗，风干后用手术刀片刮下来装入1•5mlEP管中；②酶解:加入150y1消化液，再加入l〇yl蛋白酶K，混匀，56°C酶解15min，80°C15min，冰上冷却；③加入16y1DNDNA酶缓冲液，再加入10ylDNaseI，混匀，室温静置15mimin,12000rpm离心15min，取上清;④加入320yl结合液液再加入720yl无水乙醇，混匀，分2次转移至吸附柱中，8000rpm离心lmin，，弃废液;⑤洗涤:加入5〇〇yl洗涤液，8〇OOrpm离心lmin;重复洗涤一次，弃废液，将吸附柱转移到一个新的2ml收集管中，12000rpm离心5min;⑥洗脱:将吸附柱转移到1.5ml的EP管中，加入100U1的洗脱液，室温静置lmin，l2〇OOrpm离心lmin，将收集好的洗脱液（即DNA提取液进行浓度和纯度测定，-8TC保存存待用。[0030]二、逆转录PCRRT-PCR[0031]米用试剂盒（K1622，RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit，MBI对RNA进行逆转录，方法详见试剂盒说明。PCR扩增引物为本专利PRCC-MITF融合基因引物组合：ACTA2-E2-F2：GCTATGTGTGAAGAAGAGGACSEQIDNO.1；MITF-E3-R4：AAGTGGTAGMAGGTACTGCTSEQIDN0_2。反应体系包括：0_125iilTaKaRaExTaq™HS液，2.5ullOXTaqBufferMg2+plus，2tildNTP均购自日本Takara公司），引物浓度为2〇umoll，cDNA模版为100ng，无菌去离子水加至25UUPCR扩增条件为94°C变性3min后，94°C308、601：303、72111^11，共35次循环，最后72。：延伸51^11。？〇?产物用3%琼脂糖，电压10扒，电泳，溴化乙啶染色后于紫外光下观察结果，并送测序。[0032]结果:使用本发明引物PCR后可见单一特异的电泳条带，对扩增产物进行测序，得到ACTA2exon2-MITFex〇n3融合基因序列（图1，证明本项目设计的引物组合可靠且敏感。[0033]实施例2针对对照组病例进行检测[0034]我们对30例诊断明确的对照组病例包括10例透明细胞性肾细胞癌，5例乳头状肾细胞癌，5例嫌色细胞性肾细胞癌，5例TFE3易位相关性肾细胞癌和5例TFEB易位相关性肾癌，理论上均不存在MITF基因易位使用本发明的引物组合进行检测，RNA提取、逆转录PCR和测序方法同上。[0035]结果:使用本发明设计引物组合检测，未检测出ACTA2-MITF融合基因，证明本项目设计的引物特异性高。[0036]评价:本发明引物组合是对原有MiT基因家族易位相关性肿瘤融合基因引物的补充，扩展了MiT基因家族易位相关性肿瘤融合基因的类型，增加了RT-PCR方法诊断该肿瘤的检出率。

权利要求：1.一种ACTA2-MITF融合基因，其特征在于基因融合发生于ACTA2的2号外显子与MITF基因3号外显子之间；其中，ACTA2基因位于10号染色体，位置88935074-88991397,在GeneBank中的序列版本号为01?〇138.?12，共10个外显子，所述的融合基因包含36010屻.3所示的核苷酸序列。2.权利要求1所述的ACTA2-MITF融合基因的检测试剂在制备ACTA2-MITF易位性肿瘤诊断试剂中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的ACTA2-MITF融合基因的检测试剂为检测ACTA2-MITF融合基因的特异性引物。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的检测ACTA2-MITF融合基因的特异性引物为:ACTA2-E2-F2:SEQIDN0.1;MITF-E3-R4:SEQIDN0.2。5.—种检测ACTA2-MITF易位性肿瘤的PCR引物，其特征在于所述的PCR引物为检测权利要求1所述的ACTA2-MITF融合基因的PCR引物。6.根据权利要求5所述的PCR引物，其特征在于检测ACTA2_MITF易位性肿瘤的PCR引物为：ACTA2-E2-F2:SEQIDNO_l;MITF-E3-R4:SEQIDN0.2。7.—种ACTA2-MITF易位性肿瘤诊断试剂盒，其特征在于包括权利要求5或6所述的PCR引物。

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