申请/专利权人：中国农业科学院生物技术研究所

申请日：2018-06-26

公开（公告）日：2021-11-02

公开（公告）号：CN108893471B

主分类号：C12N15/113(20100101)

分类号：C12N15/113(20100101);C12N15/70(20060101);C12N15/75(20060101);C12N15/77(20060101);C12R1/125(20060101);C12R1/15(20060101);C12R1/19(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.11.02#授权;2018.12.21#实质审查的生效;2018.12.21#实质审查的生效 ;2018.11.27#公开

摘要：本发明发现了一个可以响应氧化胁迫信号，激活下游目的基因表达的启动子序列。通过构建含该启动子的融合表达载体，并将表达载体分别转至大肠杆菌、枯草芽孢杆菌及谷氨酸棒状杆菌等工业微生物发酵菌株中，获得三株重组表达菌株。实验证实，在氧化胁迫条件下，本发明的启动子序列在都能够特异启动下游目的基因的表达，在微生物基因工程及发酵工程等相关领域具有应用价值。

主权项：1.一个响应氧化胁迫信号并高效启动功能基因表达的启动子，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。

全文数据：一个特异响应氧化胁迫信号的启动子P-OSi及其应用技术领域：[0001]本发明涉及一个能够特异响应氧化胁迫信号的启动子DNA序列。本发明还涉及该启动子在微生物发酵工业与基因工程领域中的应用。背景技术：[0002]现代生物技术是利用微生物的生长和相应的代谢活动生产各种有用物质的一种工程技术，而基因工程菌株是整个现代生物技术的研宄热点。基因工程菌株在生产发酵时常常面临高浓度底物和产物形成的多种环境胁迫，导致菌株细胞内出现大量活性氧自由基R0S影响微生物生理功能发挥，限制微生物产量和目的产物的生产。因此发现能够特异响应氧化胁迫信号的启动子序列，对微生物菌株进行遗传改造，以增强微生物对氧化胁迫的响应效率与适应能力。[0003]许多细菌非编码RNA在细胞应激反应过程中能够高效表达，进而在细菌的胁迫应答反应系统中发挥着重要的调节作用。耐福射异常球菌Deinococcusradiodurans具有极强的逆境胁迫适应性，对强氧化剂如过氧化氢）、高温、辐射UV辐射、丫辐射等和干旱等都具有超强的抗性。近年来有关耐辐射微生物ncRNA的研究己有报道，有关研宄认为耐辐射异常球菌ncRNA在辐射、氧化等胁迫抗性反应中发挥了极其重要的作用。发明内容：[0004]本发明的目的是得到一个能够响应氧化胁迫信号，并能够有效启动目的基因转录的启动子DNA序列，以应用于发酵工程与基因工程中工程菌株的改造。[0005]本发明首次发现了耐辐射异常球菌的一个非编码RNAOsiR基因，该基因能够特异响应氧化胁迫信号进行转录，发挥调控功能。[0006]通过实验本发明鉴定了非编码RNAOsiR的启动子序列并证实其功能：[0007]l.OsiR基因的鉴定及其启动子p-〇si分析[0008]本发明人在进行耐辖射异常球菌Deinococcusradiodurans的转录组分析过程中，首次发现了一种可转录的有功能性的非编码RNA新基因，其表达受氧化胁迫诱导（图1，参与细菌的抵抗逆境的生命过程，命名为OsiR基因。[0009]通过5’-RACE实验确定OsiR的转录起始位点和方向。结果表明OsiR的转录起始位点始于一个腺嘌呤A，确定从该转录起始位点起上游170bp的基因区域为OsiR基因的启动子，命名为P-〇si图2，其核苷酸序列是SEQIDN0:1。[0010]2•构建启动子P-〇si融合表达载体，并分别转入3种不同细菌，获得3种重组表达菌株[0011]利用PCR扩增获得完整的启动子p-〇si片段，克隆片段进行Mull和Spel双酶切，插入到启动子表达载体PRADZ3的报告基因lacZ前，获得启动子P-〇si与lacZ基因的融合表达载体pRAD-P-〇si-lacZ图3。将该表达载体分别转入大肠杆菌Escherichcoli、枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis或谷氨酸棒状杆菌Corynebacteriumglutamicum，获得3种重组表达菌株：E_coliP-〇si-lacZ;B.subtillisP-Osi-lacZ;C.glutamicumP-〇si-lacZ。[0012]3.启动子P-Osi对氧化胁迫信号的响应的验证实验[0013]将上述3种重组表达菌株分别进行H202氧化胁迫处理，测定在诱导条件下重组菌中lacZ基因编码产物¢-半乳糖苷酶的酶活。研究结果显示，3株重组菌中，氧化胁迫信号能够激活本发明启动子的表达启动lacZ基因的翻译。[0014]实验证实，在氧化胁迫条件下，本发明所述启动子无论是在3种工业微生物发酵菌株中都能够特异、高效的启动目的基因的表达，可应用于微生物发酵工程菌株的遗传改造。序列信息[0015]SEQIDN0:1:非编码RNAOsiR基因的启动子P-Osi核苷酸序列附图说明[0016]图1:耐辐射异常球菌中非编码RNAOsiR基因的启动子分析[0017]图中osiR基因的转录起始位点用下划线表示，转录方向用箭头表示。启动子序列用黑色粗体表示；[0018]图2:耐辐射异常球菌非编码RNAosiR氧化胁迫信号响应的分析；[0019]图3:启动子P-Osi与目的基因融合表达示意图；[0020]图4:氧化胁迫下3株重组表达菌株¢-半乳糖苷酶的酶活测定结果[0021]其中，E、B、C分别代表E•coliP_0si-lacZ;B_subtillisP-〇si-lacZ;C.glutamicumP-Osi-lacZ。具体实施方式[0022]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。实施例仅用于举例说明本发明的方法，而不能够限制本发明的范围。凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件或按照制造厂商所建议的条件。[0023]实施例1非编码RNAOsiR基因的鉴定及其启动子分析[0024]—、实验材料：[0025]试验菌株:耐车虽射异常球菌Deinococcusradiodurans[0026]购置于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌株编号CGMCc丨.633。[0027]二、实验方法：[0028]通过5’RACE实验方法确定了osiR的转录起始位点和转录方向。具体步骤参照Roche公司的5’3’RACEKit试剂盒说明书。将目的片段切胶回收进行序列测序，将测序获得的序列通过与耐辐射异常球菌基因组中的序列进行比对分析最终确定〇siR的转录起始位点和方向。[0029]三、实验结果：_0]通过5RACE实验结果表明，0SiR为反向转录，转录起始于—个腺嘌呤⑷。同时，在通过5’RACE确定的转录起始位点上游的启动子区进行序列分析发现了保守的—1〇区和一邪区（AGGAAA-N17-TAAAAT，从该转录起始位点起上游i7〇bp的基因区域为〇siR基因的启动子，命名为P-〇si图1[0031]四、实验结论：[0032]研究结果表明，osiR为反向转录，转录起始于一个腺噪呤A，该转录起始位点起上游170bp的基因区域为〇siR基因的启动子，命名为p-〇si。[0033]实施例2非编码RNAOsiR基因氧化胁迫下表达特征分析[0034]一、实验材料：[0035]试验菌株:耐车虽射异常球菌Deinococcusradiodurans[0036]购置于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌株编号CGMCC1.633。[0037]二、实验方法：[0038]1将耐辐射异常球菌在TGY液体培养基中活化，3〇。：过夜培养。次日转接至TGY培养基中30°C培养至0D_〜1.〇;[0039]2首先各取lmL菌体，作为对照，然后再各取lmL菌体加入终浓度为8〇mm〇lLH2〇2,30°C冲击30min;[0040]⑶8000Xg禺心5min，收集菌体。采用Promega试剂盒Z3741提取细菌总RNA，将使用量相同的样品RNA进行cDNA反转；[0041]⑷通过qRT-PCR方法对OsiR基因在不同胁迫条件下的表达水平进行了分析。[0042]三、实验结果：[0043]研宄结果显示，与未处理条件下相比，H2〇2氧化胁迫条件下OsiR基因的转录水平显著提尚，局达约51倍图2。[0044]四、实验结论：[0045]实验结果表明，OsiR受氧化胁迫诱导，能响应氧化胁迫过程中产生的信号，调控其它基因的表达。[0046]实施例3启动子P-〇si融合表达载体的构建[0047]―、实验材料：[0048]载体:pRADZ3:本实验室保存质粒[0049]受体菌株:E.coli、B_subtilis和C.glutamicum:本实验室保存菌株[0050]二、实验方法：[0051]⑴OsiR基因启动子片段的PCR扩增：以耐辐射异常球菌基因组DNA为模板，利用引物P-〇si-F和P-〇si-R进行PCR扩增获得长度约为170bp的启动子P-〇si的片段；[0052]弓丨物：[0053]P-〇si-F：ACCACGCGTGATGTTTACGAATGACAGG[0054]P-〇si-R：CCGACTAGTGTCTGTTTTTAGCGTGTTAG[0055]2OsiR基因启动子表达载体的构建:将PCR扩增获得的〇siR基因启动子片段进行Mull和Spel双酶切后，连入启动子检测载体pRADZ3上，挑取阳性克隆提取质粒，酶切和PCR验证后得到lacZ融合载体pRAD-P-〇si-lacZ。[0056]3重组表达菌株的获得:将构建的启动子pnfiS融合表达载体分别通过电激转入E.coli、B•subti1is和C.glutamicum中，通过抗性筛选和PCR验证获得3株重组表达菌株。[0057]三、实验结果：[0058]成功构建融合载体pRAD-P-〇si-lacZ，启动子P-〇si插入在报告基因lacZ上游（图3。通过电激转化法将融合载体pRAD-P-〇si-lacZ分别转化E.coli、B.subtili#PC.glutamicum中，获得重组表达菌株。[0059]四、实验结论：[0060]构建启动子P-Osi与lacZ基因的融合表达载体pRAD-P-Osi-lacZ。获得3种重组表达菌株:大肠杆菌E.COliP-0si_laCZ;枯草芽孢杆菌B•SubtiliSP-0Si-lacZ;谷氨酸棒状杆菌C.glutamicumP-〇si-lacZ。[0061]实施例4氧化胁迫下3株重组表达菌株¢-半乳糖苷酶的活性测定[0062]一、实验材料：[0063]实验菌株：大肠杆菌E.coliP-〇si-lacZ;枯草芽孢杆菌B.subtilisP-〇si-lacZ;谷氨酸棒状杆菌C.glutamicumP-〇si-lacZ〇[0064]二、实验方法：[0065]E.coli、B.thuringiensis、C.glutamicum的¢-半乳糖苷酶活性测定的方法如下：[0066]1分别挑取3株重组菌株单菌落，接种于含抗生素的LB液体培养基，过夜培养。其中E.coliP-〇si-lacZ培养温度为37°C，其余2株重组菌株的培养温度为30°C。次日按照2%转接量接种于新鲜LB液体培养基，测菌液0D6QQ值，直到OD600值达到0.6以上，分别加入40、6〇mmolLH2O2，冲击10min，未冲击菌株作为阴性对照；[0067]2取适量菌液，4°C，5，000Xg离心5min，弃上清，用无菌水洗两次，弃上清。按需要重新悬浮菌体。菌体悬浮液与bufferZ混合，使总体积为lmL，加入2-3滴氯仿，混匀。开盖于37°C保温4〇min。转入30。：保温5min，之后加入200yL4•0mgmL邻硝基苯-e_D-半乳吡喃糖苷0NPG，混勾后30°C继续保温，开始反应，记录反应起始时间。待样品出现黄色，再加入500yLlmolL的Na2C〇3终止反应，记录反应终止时间，样品放冰上待测。[0068]3用紫外分光光度计分别测定0D42q和0D55q值。按照以下公式计算f半乳糖苷酶活性值[0069]P-GalactosidaseUnits=1000XOD42〇-1.75X〇D55〇VTXVX〇D6〇〇〇[0070]每株重组表达菌株的以上每个实验均进行平行实验三次，所得到的结果是计算了三次独立实验的平均误差的e-半乳糖苷酶活性值。[0071]三、实验结果：[0072]不同浓度的出〇2冲击均能够激活本发明启动子序列，进而提高报告基因lacZ的表达，启动子P-Osi的活性与H2O2浓度正相关（图4。其中：[0073]大肠杆菌E.coliP-〇si-lacZ在40mM的H2〇2冲击诱导下¢-半乳糖苷酶的活性为192.2±7•26U，而在60mM的Hs〇2冲击诱导下，f3-半乳糖苷酶的活性进一步提高为446•3士12.侧。[0074]枯草芽孢杆菌B.subtilisP-Osi-lacZ在60mM的H2〇2冲击诱导下，半乳糖苷酶的活性为293.7±21.32U;[0075]谷氨酸棒状杆菌C.glutamicumP-〇si-lacZ在60mM的H2〇2冲击诱导下，半乳糖苷酶的活性也提高为385.3±19.19U。[0076]说明在氧化透胁迫条件下，启动子P-〇si在3株不同的工业微生物菌株中都能够特异、高效地启动下游目的基因的表达。[0077]四、实验结论：[0078]本发明发现的启动子能够特异响应氧化胁迫信号，启动目的基因表达，可以应用于发酵工程与基因工程中工程菌株的改造。

权利要求：1.一个响应氧化胁迫信号并高效启动功能基因表达的启动子，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。2.权利要求1所述的启动子在基因工程与发酵工程的应用。3.权利要求2所述的应用，是所述启动子在氧化胁迫条件下能够有效启动目的基因的表达。4.含权利要求1所述启动子的融合表达载体在培养基因工程菌的表达产物中的应用。5.权利要求4所述的应用，所述基因工程菌，是将权利要求4所述的融合表达载体分别转入所得到的以下重组工程菌：大肠杆菌Escherichcoli、枯草芽孢杆菌BacilluSsubtillis或谷氨酸棒状杆菌（corynebacteriumglutamicum。

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