申请/专利权人：河北国际旅行卫生保健中心

申请日：2019-03-13

公开（公告）日：2022-03-11

公开（公告）号：CN109706251B

主分类号：C12Q1/6888(20180101)

分类号：C12Q1/6888(20180101);C12N15/11(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2022.03.11#授权;2019.05.28#实质审查的生效;2019.05.03#公开

摘要：本发明公开了一种鉴定趋黄库蠓的分子标记、试剂盒及其使用方法，该分子标记包括具有SEQIDNO:5所示核苷酸序列的COI基因和具有SEQIDNO:6所示核苷酸序列的Cytb基因，所述试剂盒能够同时扩增所述COI基因和Cytb基因。本发明采用两种不同分子标记相结合的方法对趋黄库蠓进行鉴定，有利于实现趋黄库蠓的准确鉴定，缩短鉴定时间。

主权项：1.一种鉴定趋黄库蠓的分子标记，其特征在于，所述分子标记由SEQIDNO:5所示核苷酸序列的COI基因和SEQIDNO:6所示核苷酸序列的Cytb基因组成。

全文数据：一种鉴定趋黄库蠓的试剂盒及方法技术领域本发明涉及物种鉴定领域，具体涉及一种鉴定趋黄库蠓的试剂盒及方法。背景技术库蠓在动物分类上属节肢动物门Arthropoda昆虫纲Insecta双翅目Diptera蠓科Ceratopogonidae库蠓属Culicoides，是蠓科中最大的一个属，也是吸血蠓属中分布最广，种类最多，与人畜关系最密切的一个属，是多种重要动物虫媒病的传播媒介。近年来，随着全球气候变暖，在一定程度上使库蠓传播虫媒病病毒的能力提高，也使库蠓的分布范围向地球两极和高海拔地区扩大，库蠓种群传播虫媒病毒给动物的能力增强，一些传统的“非媒介”库蠓种类具备了传播疫病的能力。由库蠓传播的虫媒病如蓝舌病、水泡性口炎等，在全球一些国家或地区的传播流行，造成了巨大的经济损失，对畜牧业发展构成了严重威胁。趋黄库蠓Culicoidesparaflavescens属库蠓属的三囊亚属，在我国分布于福建、海南、江苏、广东、广西、云南、台湾等地。对吸血蠓的鉴定和识别，是监测与控制蠓传疾病发生的基础，也是疾病预防与控制领域的核心步骤。目前，对吸血蠓的鉴定主要依靠经验丰富的分类学专家识别形态学特征来实现，一旦遇到近缘种和形态特征掌握不全的标本鉴定就很棘手；而且，对吸血蠓的形态鉴定需要通过制作玻片标本来完成，操作步骤繁琐、周期长、难度大，因此，亟需寻求一种新的方法，以弥补传统分类方法的缺陷。分子鉴定技术是以遗传物质DNA序列分析为依据来阐明物种间的差别，从分子水平上快速而准确地鉴别物种。它是分子生物学、计算机科学与传统分类学相结合的产物，作为一种崭新的分类学技术，极大弥补了传统形态学鉴定的缺陷，已引起越来越多生物学家们的重视。但目前对蠓类的分子鉴定主要采用单一基因作为分子标记，可能会存在杂交或者基因渗透现象，尤其对同一复合组内的种类难以准确进行鉴定。发明内容针对现在技术的不足，发明人尝试多个分子标记的结合使用。通过大量的创造性研究，发明人发现利用线粒体DNAmtDNA的细胞色素C氧化酶亚基ICOI和线粒体细胞色素bCytb结合起来对趋黄库蠓进行鉴定具有意想不到的效果，从而完成本发明。本发明的第一方面提供一种鉴定趋黄库蠓的分子标记，其特征在于，所述分子标记包括具有SEQIDNO:5所示核苷酸序列的COI基因和具有SEQIDNO:6所示核苷酸序列的Cytb基因。由于COI基因在能够保证足够变异的同时又很容易被通用引物扩增，而且其DNA序列本身很少存在插入和缺失即使有少数也主要分布于该基因的3端，对结果的分析不会造成很大的影响。同时，它还拥有蛋白编码基因所共有的特征，即密码子第三位碱基不受自然选择压力的影响，可以自由变异，故选定COI基因中的一个片段作为DNA条形编码基因。Cytb基因是mtDNA中目前结构和功能研究得最为清楚的基因之一。该基因大小和结构较为保守，进化速度适中，能在同一物种内表现出稳定的遗传性，却在不同物种间具有明显的遗传差异。本发明的第二方面提供一种鉴定趋黄库蠓的试剂盒，包括能够扩增本发明第一方面所述COI基因的第一引物组和能够扩增本发明第一方面所述Cytb基因的第二引物组，第一引物组包括具有SEQIDNO:1所示核苷酸序列的第一上游引物和具有SEQIDNO:2所示核苷酸序列的第一下游引物，第二引物组包括具有SEQIDNO:3所示核苷酸序列的第二上游引物和具有SEQIDNO:4所示核苷酸序列的第二下游引物。在本发明的一些实施方案中，试剂盒中，第一上游引物和第一下游引物混合在一起。在本发明的一些实施方案中，试剂盒中，第二上游引物和第二下游引物混合在一起。在本发明的一些实施方案中，试剂盒中，第一上游引物和第一下游引物以及第二上游引物和第二下游引物全部混合在一起。在本发明的一些实施方案中，试剂盒还包括dNTPs、缓冲液和DNA聚合酶。在本发明的另一些实施方案中，试剂盒还包括2×Mastermix。本发明的第三方面提供一种鉴定未知库蠓是否为趋黄库蠓的方法，包括以下步骤：1提取未知库蠓的总DNA；2利用本发明第二方面所述的第一引物组和第二引物组分别以步骤1获取的总DNA为模板进行PCR扩增；3对第一引物组的扩增产物和第二引物组的扩增产物分别进行测序，如果第一引物组扩增得到的序列与SEQIDNO:5具有98％以上的相似性，并且第二引物组扩增得到的序列与SEQIDNO:6具有98％以上的相似性，则该未知库蠓为趋黄库蠓。在本发明的一些实施方案中，从未知库蠓的胸部组织提取总DNA。在本发明的一些实施方案中，在步骤2或步骤3之间进一步包括利用凝胶电泳对PCR扩增产物进行检测的过程。在本发明的一些实施方案中，第一引物组扩增产物片段长度约为650bp，第二引物组扩增产物片段长度约为410bp。在本发明的一些具体实施方案中，所述步骤2中利用第一引物组进行PCR扩增的PCR反应体系为25μL，其中：模板DNA1μL，第一上游引物0.5μL，第一下游引物0.5μL，2×Mastermix4.25μL，加ddH2O高至终体积25μL。进一步地，所述步骤2中利用第一引物组进行PCR扩增的PCR反应程序如下：94℃预变性3min；94℃变性45s，48℃退火60s，72℃延伸60s，35个循环；72℃延伸10min。在本发明的又一些具体实施方案中，所述步骤2中利用第二引物组进行PCR扩增的PCR反应体系为25μL，其中：模板DNA1μL，第一上游引物0.5μL，第一下游引物0.5μL，2×Mastermix4.25μL，加ddH2O高至终体积25μL。进一步地，所述步骤2中利用第一引物组进行PCR扩增的PCR反应程序如下：94℃预变性3min；94℃变性45s，48℃退火60s，72℃延伸60s，35个循环；72℃延伸10min。在本发明的又一些实施方案中，在步骤2中利用本发明第一方面所述的第一引物组和第二引物组同时以步骤1获取的总DNA为模板进行PCR扩增。在本发明的一些具体实施方案中，所述PCR扩增的PCR反应体系为20μL，其中：模板DNA1μL，第一上游引物0.5μL，第二下游引物0.5μL，第一上游引物0.5μL，第二下游引物0.5μL，2×Mastermix4.25μL，加ddH2O高至终体积25μL。进一步地，所述PCR扩增的PCR反应程序如下：94℃预变性3min；94℃变性45s，48℃退火60s，72℃延伸60s，35个循环；72℃延伸10min。本发明的有益效果本发明采用两种不同分子标记相结合的方法对趋黄库蠓进行鉴定，有利于实现趋黄库蠓的准确鉴定，缩短鉴定时间。采用小型昆虫微量DNA模板制备方法，通过优化后的PCR反应条件，由合成的引物扩增趋黄库蠓的COI基因和Cytb基因，PCR产物序列送由专业生物公司测定。测序结果通过手工校对、序列拼接，并在NCBI中进行BLAST同源性搜索，确保所得序列为目标序列。趋黄库蠓的种类鉴定依靠形态学鉴定所实现，并经权威复核，从而保证了结果的可靠性。附图说明图1示出了趋黄库蠓COⅠ基因PCR产物电泳图。编号说明：泳道1～3均为趋黄库蠓雌虫的COⅠ基因，检出大小约为658bp的条带，泳道4为阴性对照。M为2000bp的DNALadderMarker。图2示出了趋黄库蠓Cytb基因PCR产物电泳图。编号说明：泳道1～3均为趋黄库蠓雌虫的Cytb基因，检出大小约为414bp的条带，泳道4为阴性对照。M为2000bp的DNALadderMarker。图3示出了未知库蠓COI和Cytb基因PCR扩增结果电泳鉴定图。编号说明如下：泳道1为阳性对照，泳道2为未知库蠓雌虫的COI和Cytb基因，可同时检出大小约为658bp和414bp的特异性条带，泳道3为空白对照。M为2000bp的DNALadderMarker。具体实施方式为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。实施例以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。实施例1趋黄库蠓COI和Cytb基因序列的获取1、趋黄库蠓DNA模板制备取同一批采获并经形态学鉴定为趋黄库蠓的其他标本，采用改进的小型昆虫痕量DNA抽提法文礼章主编.昆虫学研究方法与技术导论[M].北京：科学出版社，2010.278-286，提取的DNA样品于-20℃保存备用。2、引物合成本实施例所用引物如表1所示：表1相关基因的引物信息3、PCR扩增本实施例的PCR反应体系如表2所示。表1PCR反应体系25μL体系成分体积μL模板1正向引物10.5反向引物10.52×Mastermix4.25ddH2O18.75本实施例的反应程序如表3所示。表3PCR反应程序PCR产物于4℃保存备用。4、PCR扩增产物检测取5μLPCR扩增产物，用1％琼脂糖凝胶电泳130V电压，电泳35min。溴乙锭染色，凝胶成像系统检测，电泳图谱参见图1和图2。5、基因序列测定选取3～5个效果较好的PCR扩增产物送生物公司纯化后测序测序所用引物与PCR所用引物相同，所得基因序列经校正拼接后分别得到趋黄库蠓的COI基因序列和Cytb基因序列，如下所示。COI基因序列SEQIDNO:5TACTTTATATTTTATTTTTGGAGCCTGAGCAGGTATAGTAGGCACATCATTAAGAATATTAATCCGTGCAGAATTAGGCCACCCCGGAGCTTTAATTGGTAATGACCAAATTTATAATGTAATTGTTACAGCTCATGCTTTTATTATAATTTTTTTTATAGTAATGCCAATTATAATTGGTGGATTTGGAAATTGATTAGTTCCCTTAATGGTAGGGGCGCCAGATATGGCTTTCCCTCGAATAAATAATATAAGATTTTGAATACTACCCCCTTCCTTAACTTTATTATTGATAAGAAGCCTAGTAGAAAATGGGGCAGGTACAGGATGAACAGTATACCCTCCTCTTTCTTCTAATATTTCCCATGCTGGGGCATCCGTCGATTTAGCAATTTTTTCATTACATTTAGCTGGGATCTCTTCTATCTTAGGGGCAGTAAATTTTATTACTACAATTATTAATATACGTTCTAACGGGATTACTTTCGACCGTATGCCCCTATTTGCCTGATCCGTTTTAATTACTGCAATTTTACTTCTTCTATCTTTGCCAGTATTAGCCGGAGCTATCACTATACTTCTTACAGATCGTAATATTAATACTTCATTTTTTGACCCGGCCGGAGGAGGAGACCCCATTCTTTACCAACATCTTTTCCytb基因序列SEQIDNO:6TAATTACAAATCTTTTATCTGCCGTACCTTATCTTGGATTAGACCTAGTCCAATGATTATGAGGAGGATTTGCCGTAGATAACGCTACCCTAACCCGCTTTTTTACATTTCATTTTCTTATACCTTTTATAATTATAGGAGCTACAATAATTCATTTATTATTTTTACATCAAACAGGATCTAATAATCCATTAGGAATTAGAACAAATTCTAATAAAATCCCCTTTCATCCATATTTTACTTATAAGGATTTAGTAGGATTTATAGTATTAACAATAGTATTATTTATTTTATCCCTAGAAGCTCCCTATTTATTAGGAGACCCCGATAATTTTATTCCCGCTAATCCTTTAGTGACCCCTGTCCATATTCAACCCGAATGGTACTTTTTATTTGCATATGCAATTTTACGAT实施例2未知库蠓的鉴定1、标本的采集与保存采用灯诱法进行采集，采获的标本经冷冻处死后直接保存于95％酒精中。2、试验样品的前处理取出保存于95％酒精中的库蠓标本，在解剖镜下进行解剖，除胸部外其余部分制成玻片标本用于形态鉴定。将库蠓胸部单独编号后进行分子生物学实验，并确保与玻片标本一一对应。若需较长时间保存，则应将装有库蠓胸部组织部位的PCR管置于-20℃冰箱冻存。3、DNA模板制备采用小型昆虫微量DNA模板制备方法提取未知库蠓基因组DNA文礼章主编.昆虫学研究方法与技术导论[M].北京：科学出版社，2010.278-286，提取的DNA样品于-20℃保存备用。4、目的基因序列的扩增3.1引物合成本实施例所有引物与实施例1相同。3.2PCR扩增本实施例的PCR反应体系如表4所示。表4PCR反应体系50μL体系成分体积μL模板2LCO14900.5HCO21980.5CytbFW0.5CytbRW0.52×Mastermix8.5ddH2O37.5PCR反应条件与实施例1相同。3.3PCR扩增产物检测与基因序列测定取5μLPCR扩增产物，用1％琼脂糖凝胶电泳130V电压，电泳35min。溴化乙锭染色。凝胶成像系统检测，电泳图谱参见图3。由图3看出，利用COI引物对和Cytb引物对未知库蠓特异性扩增，可同时扩增出约为658bp和约为414bp两种大小的片段，将大小约为658bp和约为414bp的产物送生物公司测序。结果显示，大小约为658bp的序列与SEQIDNO.5的同源性大于99％，大小约为414bp的序列与SEQIDNO.6的同源性也大于99％，可确定该未知库蠓为趋黄库蠓。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。序列表河北国际旅行卫生保健中心一种鉴定趋黄库蠓的试剂盒及方法XY-2019-1-W-0086SIPOSequenceListing1.0125DNA人工序列ArtificialSequence1ggtcaacaaatcataaagatattgg25226DNA人工序列ArtificialSequence2taaacttcagggtgaccaaaaaatca26328DNA人工序列ArtificialSequence3ggacaaatatcattttgaggagcwacag28428DNA人工序列ArtificialSequence4attactcctcctaatttattaggaattg285658DNA人工序列ArtificialSequence5tactttatattttatttttggagcctgagcaggtatagtaggcacatcattaagaatatt60aatccgtgcagaattaggccaccccggagctttaattggtaatgaccaaatttataatgt120aattgttacagctcatgcttttattataattttttttatagtaatgccaattataattgg180tggatttggaaattgattagttcccttaatggtaggggcgccagatatggctttccctcg240aataaataatataagattttgaatactacccccttccttaactttattattgataagaag300cctagtagaaaatggggcaggtacaggatgaacagtataccctcctctttcttctaatat360ttcccatgctggggcatccgtcgatttagcaattttttcattacatttagctgggatctc420ttctatcttaggggcagtaaattttattactacaattattaatatacgttctaacgggat480tactttcgaccgtatgcccctatttgcctgatccgttttaattactgcaattttacttct540tctatctttgccagtattagccggagctatcactatacttcttacagatcgtaatattaa600tacttcattttttgacccggccggaggaggagaccccattctttaccaacatcttttc6586414DNA人工序列ArtificialSequence6taattacaaatcttttatctgccgtaccttatcttggattagacctagtccaatgattat60gaggaggatttgccgtagataacgctaccctaacccgcttttttacatttcattttctta120taccttttataattataggagctacaataattcatttattatttttacatcaaacaggat180ctaataatccattaggaattagaacaaattctaataaaatcccctttcatccatatttta240cttataaggatttagtaggatttatagtattaacaatagtattatttattttatccctag300aagctccctatttattaggagaccccgataattttattcccgctaatcctttagtgaccc360ctgtccatattcaacccgaatggtactttttatttgcatatgcaattttacgat414

权利要求：1.一种鉴定趋黄库蠓的分子标记，其特征在于，所述分子标记包括具有SEQIDNO:5所示核苷酸序列的COI基因和具有SEQIDNO:6所示核苷酸序列的Cytb基因。2.一种鉴定趋黄库蠓的试剂盒，其特征在于，包括能够扩增权利要求1所述COI基因的第一引物组和能够扩增权利要求1所述Cytb基因的第二引物组，所述第一引物组包括具有SEQIDNO:1所示核苷酸序列的第一上游引物和具有SEQIDNO:2所示核苷酸序列的第一下游引物，所述第二引物组包括具有SEQIDNO:3所示核苷酸序列的第二上游引物和具有SEQIDNO:4所示核苷酸序列的第二下游引物。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括dNTPs、缓冲液和DNA聚合酶。4.一种鉴定未知库蠓是否为趋黄库蠓的方法，其特征在于，包括以下步骤：1提取未知库蠓的总DNA；2利用权利要求1所述的第一引物组和第二引物组分别以步骤1获取的总DNA为模板进行PCR扩增；3对第一引物组的扩增产物和第二引物组的扩增产物分别进行测序，如果第一引物组扩增得到的序列与SEQIDNO:5具有98％以上的相似性，并且第二引物组扩增得到的序列与SEQIDNO:6具有98％以上的相似性，则该未知库蠓为趋黄库蠓。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤2中利用第一引物组进行PCR扩增的PCR反应体系为25μL，其中：模板DNA1μL，第一上游引物0.5μL，第一下游引物0.5μL，2×Mastermix4.25μL，加ddH2O高至终体积25μL。6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤2中利用第一引物组进行PCR扩增的PCR反应程序如下：94℃预变性3min；94℃变性45s，48℃退火60s，72℃延伸60s，35个循环；72℃延伸10min。7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤2中利用第二引物组进行PCR扩增的PCR反应体系为50μL，其中：模板DNA1μL，第一上游引物0.5μL，第一下游引物0.5μL，2×Mastermix4.25μL，加ddH2O高至终体积25μL。8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤2中利用第一引物组进行PCR扩增的PCR反应程序如下：94℃预变性3min；94℃变性45s，48℃退火60s，72℃延伸60s，35个循环；72℃延伸10min。9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤2中利用权利要求1所述的第一引物组和第二引物组同时以步骤1获取的总DNA为模板进行PCR扩增。10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的PCR反应体系为25μL，其中：模板DNA1μL，第一上游引物0.5μL，第二下游引物0.5μL，第二上游引物0.5μL，第二下游引物0.5μL，2×Mastermix4.25μL，加ddH2O高至终体积25μL，所述PCR扩增的PCR反应程序如下：94℃预变性3min；94℃变性45s，48℃退火60s，72℃延伸60s，35个循环；72℃延伸10min。

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