申请/专利权人：武汉明德生物科技股份有限公司

申请日：2019-01-17

公开（公告）日：2022-05-24

公开（公告）号：CN109734790B

主分类号：C07K14/47

分类号：C07K14/47;C12N15/70;G01N33/68;G01N33/558

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2022.05.24#授权;2019.06.04#实质审查的生效;2019.05.10#公开

摘要：本发明提供了人Agrin抗原、ELISA检测试剂盒及其制备方法与应用。所述人Agrin抗原包括SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6和SEQIDNO:7所示的氨基酸序列，还提供了七种分别含有上述七种人Agrin的抗原的检测试剂盒，以及1种同时含有上述七种人Agrin抗原的检测试剂盒。该人Agrin检测试剂盒，检测人血清中的Agrin抗体，特异性强，反应灵敏度高，高通量、成本低，能够对对重症肌无力病症进行诊断，适于大规模推广应用。

主权项：1.一种人Agrin抗原的制备方法，其特征在于，所述人Agrin抗原由以下任意一种片段或者七种片段组成：片段1：Agrin-40，氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；片段2：Agrin-411，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；片段3：Agrin-701，氨基酸序列如SEQIDNO.3所示；片段4：Agrin-1103，氨基酸序列如SEQIDNO.4所示；片段5：Agrin-1281，氨基酸序列如SEQIDNO.5所示；片段6：Agrin-1635，氨基酸序列如SEQIDNO.6所示；片段7：Agrin-1864，氨基酸序列如SEQIDNO.7所示；所述制备方法包括如下步骤：步骤1、将Agrin-40、Agrin-411、Agrin-701、Agrin-1103、Agrin-1281、Agrin-1635和Agrin-1864共7个片段的DNA序列分别进行基因合成，设计引物PCR扩增后，分别连接进表达载体，构建7个重组表达质粒；步骤2、将构建好的重组质粒分别转化进入表达菌，构建7个重组表达工程菌；步骤3、Agrin-40、Agrin-411、Agrin-701、Agrin-1103、Agrin-1281、Agrin-1635和Agrin-1864的抗原片段的诱导表达及纯化；所述步骤3中诱导表达的具体步骤为：将7个重组菌分别接种于LB培养液中摇菌至OD600至0.6-0.8时，按1:1000加入24mgml浓度的IPTG诱导4-6小时。

全文数据：人Agrin抗原、人Agrin抗体检测试剂盒及其制备方法与应用技术领域本发明涉及生物制药技术领域，尤其涉及人Agrin抗原、人Agrin抗体检测试剂盒及其制备方法与应用。背景技术重症肌无力Myastheniagravis，MG，是常见的肌肉神经接头neuromuscularjunction，NMJ疾病。在大多数患者中，MG可能来自一个对乙酰胆碱受体AChRs的自身免疫反应，能够在80％-85％的MG患者中检测到AChRs的自身抗体。然而，AChR抗体在大约20％的MG患者中没有被检测到。有证据表明，这些“血清反应阴性”的患者可以产生对NMJ形成或保持非常关键的蛋白抗体。从运动神经元释放的聚集蛋白Agrin，结合到低密度脂蛋白受体相关的蛋白4LRP4，激活受体酪氨酸激酶MuSK来指导NMJ的形成。大约40％-70％的血清反应阴性患者有MuSK自身抗体。其余6％-12％的MG患者对AChR和MuSK抗体具有双血清阴性反应。聚集蛋白Agrin是从运动神经终端释放出来的硫酸类肝素蛋白多糖。其调节神经肌肉接点的形成、维持和再生，并且干扰聚集蛋白功能，可导致神经肌肉传递不足在少数MG病人中聚集蛋白抗体可以在有或者没有针对AChR，MuSK或者LRP4抗体的情况下被检测出来。聚集蛋白抗体只有在MG病人中可以被检测出来，提示这些抗体对于MG来说是特异性的。目前还没有人Agrin抗体检测试剂盒的相关报道。发明内容本发明的目的在于克服现有技术之缺陷，提供了一种人Agrin抗原及其制备方法、人Agrin抗体检测试剂盒及其制备方法与应用，该检测试剂盒能特异性检测人血清中的LRP4抗体，对重症肌无力有诊断意义，反应灵敏，成本低、适于大规模推广应用。本发明是这样实现的：本发明的目的之一在于一种人Agrin抗原，包括以下任意一种片段或者七种片段：片段1：Agrin-40，氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；片段2：Agrin-411，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；片段3：Agrin-701，氨基酸序列如SEQIDNO.3所示；片段4：Agrin-1103，氨基酸序列如SEQIDNO.4所示；片段5：Agrin-1281，氨基酸序列如SEQIDNO.5所示；片段6：Agrin-1635，氨基酸序列如SEQIDNO.6所示；片段7：Agrin-1864，氨基酸序列如SEQIDNO.7所示。本发明的目的之二在于提供人Agrin抗原的制备方法，包括如下步骤：步骤1、将Agrin-40、Agrin-411、Agrin-701、Agrin-1103、Agrin-1281、Agrin-1635和Agrin-1864的7个片段的DNA序列分别进行基因合成，设计引物PCR扩增后，分别连接进表达载体，构建重组表达质粒；步骤2、将构建好的重组质粒转化进入表达菌，构建重组表达工程菌；步骤3、人Agrin抗原的诱导表达及纯化。具体地，所述步骤1中所述7个片段的引物对分别为：Agrin-40-P1：核苷酸序列如SEQIDNO.8所示；Agrin-40-P2：核苷酸序列如SEQIDNO.9所示；Agrin-411-P1：核苷酸序列如SEQIDNO.10所示；Agrin-411-P2：核苷酸序列如SEQIDNO.11所示；Agrin-701-P1：核苷酸序列如SEQIDNO.12所示；Agrin-701-P2：核苷酸序列如SEQIDNO.13所示；Agrin-1103-P1：核苷酸序列如SEQIDNO.14所示；Agrin-1103-P2：核苷酸序列如SEQIDNO.15所示；Agrin-1281-P1：核苷酸序列如SEQIDNO.16所示；Agrin-1281-P2：核苷酸序列如SEQIDNO.17所示；Agrin-1635-P1：核苷酸序列如SEQIDNO.18所示；Agrin-1635-P2：核苷酸序列如SEQIDNO.19所示；Agrin-1864-P1：核苷酸序列如SEQIDNO.20所示；Agrin-1864-P2：核苷酸序列如SEQIDNO.21所示。具体地，所述步骤1中PCR扩增的反应体系为：H2O38.7ul；Buffer5ul；dNTP3ul；上引物1ul；下引物1ul；DNA1ul；TaqE0.3ul；扩增程序为：94度变性5min；94度变性45sec、57度150sec、72度90sec，32个循环；72度延伸10min。具体地，所述步骤3中诱导表达的具体步骤为：将7个重组菌分别接种于LB培养液中摇菌至OD600至0.6-0.8时，按1:1000加入24mgml浓度的IPTG诱导4-6小时。具体地，所述步骤3中诱导表达后的纯化条件是：上样缓冲液：0.5MNaCl、20mMNa2HPO3、10mM咪唑；结合缓冲液：0.5MNaCl、20mMNa2HPO3、20mM咪唑；洗脱缓冲液：0.5MNacl、20mMNa2HPO3、500mM咪唑。本发明的目的之三在于提供一种人Agrin抗原的表达载体，所述表达载体为7个，所述7个表达载体的表达区的核苷酸序列分别为：如SEQIDNO.22、SEQIDNO.23、SEQIDNO.24、SEQIDNO.25、SEQIDNO.26、SEQIDNO.27、SEQIDNO.28所示。本发明的目的之四在于提供一种人Agrin抗原的表达工程菌，该工程菌为7个，所述7个工程菌分别包含所述7个人Agrin抗原的表达载体。本发明的目的之五在于提供人Agrin抗体检测试剂盒，所述的ELISA检测试剂盒包括：A包被有所述的人Agrin抗原的ELISA酶标板；所述人Agrin抗原包括Agrin-40、Agrin-411、Agrin-701、Agrin-1103、Agrin-1281、Agrin-1635和Agrin-1864中的任意一种或者七种；B标准阴性血清：Agrin抗体阴性的血清；C标准阳性血清：Agrin抗体阳性的血清；D辣根过氧化物酶标记的酶标二抗：抗人IGG、IGM和IGA；E样品稀释液、包被缓冲液、封闭液、ELISA酶标板洗涤液、抗体稀释液、显色液和终止液。其中，所述人Agrin抗原Agrin-40、Agrin-411、Agrin-701、Agrin-1103、Agrin-1281、Agrin-1635和Agrin-1864的包被浓度分别为200ngml、200ngml、250ngml、250ngml、300ngml、150ngml和150ngml。本发明的目的之六在于提供人Agrin抗体的检测方法，所述的检测方法包括以下步骤：S1、制备检测ELISA酶标板：包被缓冲液将权利要求1所述的人Agrin抗原稀释后加到酶标板中吸附，空干包被用洗液，加包被用封闭液封闭；所述人Agrin抗原包括Agrin-40、Agrin-411、Agrin-701、Agrin-1103、Agrin-1281、Agrin-1635和Agrin-1864中的任意一种或者七种；S2、待检血清、阴性血清、阳性血清分别作为一抗，加样至ELISA酶标板孔中进行孵育；S3、酶标二抗的孵育：辣根过氧化物酶标记的酶标二抗加入ELISA酶标板，洗涤液洗涤，甩干；S4、加入显色液，室温避光孵育，加入终止液终止反应；在酶标仪上450nm波长下测定OD值。本发明的目的之七在于提供所述的检测试剂盒在诊断重症肌无力MG疾病中的应用。本发明具有的有益效果是：本发明提供了人Agrin抗原、人Agrin抗体检测试剂盒及检测方法，首先制备得到人Agrin抗原Agrin-40、Agrin-411、Agrin-701、Agrin-1103、Agrin-1281、Agrin-1635和Agrin-1864，然后以人Agrin抗原为包被抗原对样本血清进行间接ELISA检测，该试剂盒可以用于检测诊断对重症肌无力MG疾病，特异性强，灵敏度高，稳定性好。附图说明图1为本发明实施例1提供的构建的重组质粒的酶切图；其中，A为包含Agrin-40的重组质粒的酶切图；B为包含Agrin-411的重组质粒的酶切图；C为包含Agrin-701的重组质粒的酶切图；D为包含Agrin-1103的重组质粒的酶切图；E为包含Agrin-1281的重组质粒的酶切图；F为包含Agrin-1635的重组质粒的酶切图；G为包含Agrin-1864的重组质粒的酶切图；其中1泳道为未酶切的质粒，2泳道为经相应的内切酶酶切的条带；F为Marker条带图，该Marker为1Kbladder；图2为本发明实施例2提供的Agrin-40、Agrin-411、Agrin-701、Agrin-1103、Agrin-1281、Agrin-1635和Agrin-1864片段的纯化产物电泳图。具体实施方式实施例1构建重组表达质粒以及工程菌1、聚集蛋白Agrin是一种硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，由多个结构域构成，这些结构域包括9个蛋白激酶抑制剂结构域，4个表皮生长因子样结构域和1个粘附分子G同源结构域。成熟的Agrin蛋白是由2038个氨基酸组成。本研究对Agrin蛋白的氨基酸序列经过包括亲水性、表面可及性等分析，并结合其空间构象和各个结构域的修饰特点，选择成熟的Agrin蛋白的7个区域的片段以分别获取。本发明人经过一系列的研究，获得七种人Agrin抗原，Agrin-40、Agrin-411、Agrin-701、Agrin-1103、Agrin-1281、Agrin-1635和Agrin-1864。2、PCR扩增人Agrin抗原基因1、将7个片段的DNA序列分别进行基因合成，设计引物带上酶切位点PCR扩增，设计PCR引物如表1所示，下划线的部分是限制性核酸内切酶位点。表12、运用PCR扩增体系如表2所示，温度循环参数：94℃，5min→94℃,45S,→57℃,150S,→72℃,90S×32→72℃,10min。扩增产物用于后续酶切酶连。表24、PCR扩增后，琼脂糖凝胶电泳回收扩增带，酶切，酶连，分别将7个DNA片段连接进PET-28a表达载体构建重组表达质粒。重组质粒跑胶酶切图见说明书附图1。5、将构建好的重组质粒转化BL21DE3菌，构建重组菌，重组菌的测序后结果验证本实施例的重组质粒构建成功。实施例2抗原的表达及纯化1、用构建成的重组蛋白表达工程菌进行诱导表达实验。将7个重组菌分别接种于600ml的LB培养液成分：10g氯化钠升、10g蛋白胨升和5g酵母浸膏升，37度200RPM摇菌至OD600至0.6-0.8时，按1:1000加入24mgml浓度的IPTG诱导4小时。离心，收菌，准备纯化。2、纯化选择的填料是GE的NiSepharose货号是17-0729-10，根据其说明书分别配制如下溶液：上样缓冲液A：0.5MNaCl+20mMNa2HPO3+10mM咪唑。结合缓冲液B：0.5MNaCl+20mMNa2HPO3+20mM咪唑洗脱缓冲液C：0.5MNaCl、20mMNa2HPO3、500mM咪唑；以及用于纯化包涵体的溶液：纯化包涵体抗原的上样缓冲液a：0.5MNaCl、20mMNa2HPO3、20mM咪唑、8M尿素；结合缓冲液b：0.5MNaCl、20mMNa2HPO3、20mM咪唑、8M尿素；洗脱缓冲液c：0.5MNaCl、20mMNa2HPO3、300mM咪唑、8M尿素。3、将7种离心收集的细菌用上样缓冲液A分散均匀，超声250W，超3s，间隔3s，全程20min、第一次离心12000RPM，15min，4℃，得到含较高浓度的目的抗原的上清溶液。包涵体抗原需将第一次离心的沉淀用上样缓冲液a再分散均匀，再超声250W，超3s，间隔3s，全程20min、再离心12000RPM，15min，4℃，弃掉沉淀，得到含较高浓度的目的抗原的溶液。将该7种目的蛋白的溶液对填料柱分别进行上样、洗涤、洗脱，分别得到7个目的蛋白。纯化好的包涵体抗原需复性，采用与待复性包涵体抗原同体积的含不同尿素浓度4.5M、3.5M、2.5M、1.5M、0.5M、0M的复性缓冲液继续透析复性，每种复性缓冲液透析4小时。可溶性抗原Agrin-609和复性完的包涵体抗原Agrin-40、Agrin-411、Agrin-701、Agrin-1103、Agrin-1281、Agrin-1635和Agrin-1864，进行12％浓度凝胶的SDS-PAGE电泳，检测七个目的蛋白纯度分别为：93.5％，94.9％，93.4％，94.5％，94.1％，94.8％，和95.1％。见说明书附图2。每种抗原测定浓度后储存备用。实施例3人Agrin抗体检测试剂盒及使用方法1、包被酶标板1包被液：NaCl8.5g,Na2HPO4·12H2O30.8g，KH2PO42.2g,加ddH2O至1000ml，调PH至7.4。2包被用洗液：NaCl8.0g、KH2PO40.24g、Na2HPO4·12H2O2.9g、KCl0.2g、TWEEN200.5ml，加至ddH2O至1000ml，调至PH7.4。3包被方法：将7个Agrin抗原片段分别用0.1MPBSPH7.4包被缓冲液进行包被在酶标板孔内，4度过夜，其中Agrin-25，Agrin-344、Agrin-530、Agrin-824和Agrin-1048的包被浓度分别为200ngml、200ngml、250ngml、150ngml和250ngml。96孔酶标板中每孔加100μL，置2-8℃吸附24小时。空去包被液，包被用洗液洗板3次。2、封闭1包被用封闭液：Na2HPO4·12H2O3.582g，NaH2PO4·2H2O1.561g，NaCl9.0g，BSA20g，木糖10g，调pH至7.2，定容至1000ml。2封闭操作：空干包被用洗液，用1.5％BSA封闭液37度封闭2小时，或者置2-8℃过夜。去除封闭液后自然干燥密封备用。3、阴阳性血清的孵育一抗孵育将待检测的血清按10-100倍稀释，分别加入7种抗原的板条内每种抗原有经过优化的特定的血清稀释倍数，并加入阳性对照和阴性对照，37度孵育1小时，用洗涤液进行洗板，所述洗涤液的配方如下：洗涤液0.15M：NaCl8.0g、KH2PO40.24g、Na2HPO4·12H2O2.9g、KCl0.2g、TWEEN200.5ml，加至ddH2O至1000ml，调至PH7.4。操作：待检血清用PBS液作血清稀释液，按1:400倍的比例稀释，加入包被板孔中，100μL孔。直接吸取标准阳性血清或标准阴性血清加入包被板孔中，100μL孔。置酶标板于37℃，30min。4、酶标二抗的孵育加入一定浓度的辣根过氧化物酶标记的二抗抗人IGG、IGM和IGA，向酶标板孔中加入100μL孔，置37℃，15min，洗板。5、显色加入底物液A50μL，底物液B50μL，轻摇混合，37℃反应15min。1底物溶液A：醋酸钠13.6g、柠檬酸1.6g、30％双氧水0.3ml、蒸馏水加至500ml2底物溶液B：取0.2gTMB溶于20mlDMSO中、乙二胺四乙酸二钠0.2g、柠檬酸0.95g、甘油50ml、蒸馏水加至500ml。6、终止：终止液：2molLH2SO4。显色结束后每孔加入50ul终止液进行终止。7、读板：用酶标仪测量OD450值。需要说明的是，血清经7种抗原的板条检测，其中任何一种板条的OD450值达到阳性值时，则判定该血清对Agrin是阳性，对该抗原片段成阳性。该血清个体体内存在对Agrin以及该Agrin片段的抗体。这7种抗原制备成的7种检测试剂盒可以分开使用也可以组合使用。本发明提供的人Agrin抗体检测试剂盒也可用于制备免疫胶体金检测试纸条、免疫荧光、免疫比浊、化学发光等各种形式的产品。实施例4人Agrin抗体检测试剂盒的应用一、应用1、本研究对613份神经系统自身免疫性疾病患者血清按照实施例3进行了检测，这613份血清来自于慢性炎性脱髓性多发性神经炎神经病CIDP、格林巴利GBS和重症肌无力MG等患者，其中慢性炎性脱髓性多发性神经炎神经病CIDP患者血清已在医院经临床检测验证是CIDP抗体阳性的血清，本研究也同批检测了300份正常人血清样本。2、实验结果如下表仅列出60份样本数据，本次检测结果显示，Agrin-1635抗体检测试剂盒。在MG患者血清的阳性率达25％，在CIDP阳性患者血清的阳性率达10％，在正常人血清的阳性率达5％，临界值为0.49。表3-样本数据检测结果4、此外，Agrin-40、Agrin-411、Agrin-701、Agrin-1103、Agrin-1281、Agrin-1635和Agrin-1864检测也表明在MG患者血清的阳性比例是正常人的3倍以上。结果用SPSS统计分析软件17.0，进行单因素方差分析，并用Student-Newman-Keuls进行多重比较检验。结果如下表：表4-检测结果统计分析表注：检测数据用SPSS17.0统计分析软件的One-WayANOVA程序的Student-Newman-Keuls检验方法进行多重比较分析，同栏中带有不同字母肩号a,b,c的组之间差异显著P武汉明德生物科技股份有限公司人Agrin抗原、人Agrin抗体检测试剂盒及其制备方法与应用28SIPOSequenceListing1.01381PRT人AgrinAgrin-301ThrCysProGluArgAlaLeuGluArgArgGluGluGluAlaAsnVal151015ValLeuThrGlyThrValGluGluIleLeuAsnValAspProValGln202530HisThrTyrSerCysLysValArgValTrpArgTyrLeuLysGlyLys354045AspLeuValAlaArgGluSerLeuLeuAspGlyGlyAsnLysValVal505560IleSerGlyPheGlyAspProLeuIleCysAspAsnGlnValSerThr65707580GlyAspThrArgIlePhePheValAsnProAlaProProTyrLeuTrp859095ProAlaHisLysAsnGluLeuMetLeuAsnSerSerLeuMetArgIle100105110ThrLeuArgAsnLeuGluGluValGluPheCysValGluAspLysPro115120125GlyThrHisPheThrProValProProThrProProAspAlaCysArg130135140GlyMetLeuCysGlyPheGlyAlaValCysGluProAsnAlaGluGly145150155160ProGlyArgAlaSerCysValCysLysLysSerProCysProSerVal165170175ValAlaProValCysGlySerAspAlaSerThrTyrSerAsnGluCys180185190GluLeuGlnArgAlaGlnCysSerGlnGlnArgArgIleArgLeuLeu195200205SerArgGlyProCysGlySerArgAspProCysSerAsnValThrCys210215220SerPheGlySerThrCysAlaArgSerAlaAspGlyLeuThrAlaSer225230235240CysLeuCysProAlaThrCysArgGlyAlaProGluGlyThrValCys245250255GlySerAspGlyAlaAspTyrProGlyGluCysGlnLeuLeuArgArg260265270AlaCysAlaArgGlnGluAsnValPheLysLysPheAspGlyProCys275280285AspProCysGlnGlyAlaLeuProAspProSerArgSerCysArgVal290295300AsnProArgThrArgArgProGluMetLeuLeuArgProGluSerCys305310315320ProAlaArgGlnAlaProValCysGlyAspAspGlyValThrTyrGlu325330335AsnAspCysValMetGlyArgSerGlyAlaAlaArgGlyLeuLeuLeu340345350GlnLysValArgSerGlyGlnCysGlnGlyArgAspGlnCysProGlu355360365ProCysArgPheAsnAlaValCysLeuSerArgArgGly3703753802290PRT人AgrinAgrin-4112ArgProArgCysSerCysAspArgValThrCysAspGlyAlaTyrArg151015ProValCysAlaGlnAspGlyArgThrTyrAspSerAspCysTrpArg202530GlnGlnAlaGluCysArgGlnGlnArgAlaIleProSerLysHisGln354045GlyProCysAspGlnAlaProSerProCysLeuGlyValGlnCysAla505560PheGlyAlaThrCysAlaValLysAsnGlyGlnAlaAlaCysGluCys65707580LeuGlnAlaCysSerSerLeuTyrAspProValCysGlySerAspGly859095ValThrTyrGlySerAlaCysGluLeuGluAlaThrAlaCysThrLeu100105110GlyArgGluIleGlnValAlaArgLysGlyProCysAspArgCysGly115120125GlnCysArgPheGlyAlaLeuCysGluAlaGluThrGlyArgCysVal130135140CysProSerGluCysValAlaLeuAlaGlnProValCysGlySerAsp145150155160GlyHisThrTyrProSerGluCysMetLeuHisValHisAlaCysThr165170175HisGlnIleSerLeuHisValAlaSerAlaGlyProCysGluThrCys180185190GlyAspAlaValCysAlaPheGlyAlaValCysSerAlaGlyGlnCys195200205ValCysProArgCysGluHisProProProGlyProValCysGlySer210215220AspGlyValThrTyrGlySerAlaCysGluLeuArgGluAlaAlaCys225230235240LeuGlnGlnThrGlnIleGluGluAlaArgAlaGlyProCysGluGln245250255AlaGluCysGlySerGlyGlySerGlySerGlyGluAspGlyAspCys260265270GluGlnGluLeuCysArgGlnArgGlyGlyIleTrpAspGluAspSer275280285GluAsp2903400PRT人AgrinAgrin-7013GlyProCysValCysAspPheSerCysGlnSerValProGlySerPro151015ValCysGlySerAspGlyValThrTyrSerThrGluCysGluLeuLys202530LysAlaArgCysGluSerGlnArgGlyLeuTyrValAlaAlaGlnGly354045AlaCysArgGlyProThrPheAlaProLeuProProValAlaProLeu505560HisCysAlaGlnThrProTyrGlyCysCysGlnAspAsnIleThrAla65707580AlaArgGlyValGlyLeuAlaGlyCysProSerAlaCysGlnCysAsn859095ProHisGlySerTyrGlyGlyThrCysAspProAlaThrGlyGlnCys100105110SerCysArgProGlyValGlyGlyLeuArgCysAspArgCysGluPro115120125GlyPheTrpAsnPheArgGlyIleValThrAspGlyArgSerGlyCys130135140ThrProCysSerCysAspProGlnGlyAlaValArgAspAspCysGlu145150155160GlnMetThrGlyLeuCysSerCysLysProGlyValAlaGlyProLys165170175CysGlyGlnCysProAspGlyArgAlaLeuGlyProAlaGlyCysGlu180185190AlaAspAlaSerAlaProAlaThrCysAlaGluMetArgCysGluPhe195200205GlyAlaArgCysValGluGluSerGlySerAlaHisCysValCysPro210215220MetLeuThrCysProGluAlaAsnAlaThrLysValCysGlySerAsp225230235240GlyValThrTyrGlyAsnGluCysGlnLeuLysThrIleAlaCysArg245250255GlnGlyLeuGlnIleSerIleGlnSerLeuGlyProCysGlnGluAla260265270ValAlaProSerThrHisProThrSerAlaSerValThrValThrThr275280285ProGlyLeuLeuLeuSerGlnAlaLeuProAlaProProGlyAlaLeu290295300ProLeuAlaProSerSerThrAlaHisSerGlnThrThrProProPro305310315320SerSerArgProArgThrThrAlaSerValProArgThrThrValTrp325330335ProValLeuThrValProProThrAlaProSerProAlaProSerLeu340345350ValAlaSerAlaPheGlyGluSerGlySerThrAspGlySerSerAsp355360365GluGluLeuSerGlyAspGlnGluAlaSerGlyGlyGlySerGlyGly370375380LeuGluProLeuGluGlySerSerValAlaThrProGlyProProVal3853903954004180PRT人AgrinAgrin-11034AlaSerCysTyrAsnSerAlaLeuGlyCysCysSerAspGlyLysThr151015ProSerLeuAspAlaGluGlySerAsnCysProAlaThrLysValPhe202530GlnGlyValLeuGluLeuGluGlyValGluGlyGlnGluLeuPheTyr354045ThrProGluMetAlaAspProLysSerGluLeuPheGlyGluThrAla505560ArgSerIleGluSerThrLeuAspAspLeuPheArgAsnSerAspVal65707580LysLysAspPheArgSerValArgLeuArgAspLeuGlyProGlyLys859095SerValArgAlaIleValAspValHisPheAspProThrThrAlaPhe100105110ArgAlaProAspValAlaArgAlaLeuLeuArgGlnIleGlnValSer115120125ArgArgArgSerLeuGlyValArgArgProLeuGlnGluHisValArg130135140PheMetAspPheAspTrpPheProAlaPheIleThrGlyAlaThrSer145150155160GlyAlaIleAlaAlaGlyAlaThrAlaArgAlaThrThrAlaSerArg165170175LeuProSerSer1805229PRT人AgrinAgrin-12815SerSerAlaValThrProArgAlaProHisProSerHisThrSerGln151015ProValAlaLysThrThrAlaAlaProThrThrArgArgProProThr202530ThrAlaProSerArgValProGlyArgArgProProAlaProGlnGln354045ProProLysProCysAspSerGlnProCysPheHisGlyGlyThrCys505560GlnAspTrpAlaLeuGlyGlyGlyPheThrCysSerCysProAlaGly65707580ArgGlyGlyAlaValCysGluLysValLeuGlyGlyAspHisProCys859095LeuProAsnProCysHisGlyGlyAlaProCysGlnAsnLeuGluAla100105110GlyArgPheHisCysGlnCysProProGlyArgValGlyProThrCys115120125AlaAspGluLysSerProCysGlnProAsnProCysHisGlyAlaAla130135140ProCysArgValLeuProGluGlyGlyAlaGlnCysGluCysProLeu145150155160GlyArgGluGlyThrPheCysGlnThrAlaSerGlyGlnAspGlySer165170175GlyAlaGlyHisProCysThrArgAlaSerGlyHisProCysLeuAsn180185190GlyAlaSerCysValProArgGluAlaAlaTyrValCysLeuCysPro195200205GlyGlyPheSerGlyProHisCysGluLysGlyLeuValGluLysSer210215220AlaGlyAspValAsp2256188PRT人AgrinAgrin-16356ProPheLeuAlaAspPheAsnGlyPheSerHisLeuGluLeuArgGly151015LeuHisThrPheAlaArgAspLeuGlyGluLysMetAlaLeuGluVal202530ValPheLeuAlaArgGlyProSerGlyLeuLeuLeuTyrAsnGlyGln354045LysThrAspGlyLysGlyAspPheValSerLeuAlaLeuArgAspArg505560ArgLeuGluPheArgTyrAspLeuGlyLysGlyAlaAlaValIleArg65707580SerArgGluProValThrLeuGlyAlaTrpThrArgValSerLeuGlu859095ArgAsnGlyArgLysGlyAlaLeuArgValGlyAspGlyProArgVal100105110LeuGlyGluSerProLysSerArgLysValProHisThrValLeuAsn115120125LeuLysGluProLeuTyrValGlyGlyAlaProAspPheSerLysLeu130135140AlaArgAlaAlaAlaValSerSerGlyPheAspGlyAlaIleGlnLeu145150155160ValSerLeuGlyGlyArgGlnLeuLeuThrProGluHisValLeuArg165170175GlnValAspValThrSerPheAlaGlyHisProCys1801857204PRT人AgrinAgrin-18647SerAlaGlyAspValAspThrLeuAlaPheAspGlyArgThrPheVal151015GluTyrLeuAsnAlaValThrGluSerGluLeuAlaAsnGluIlePro202530ValProGluThrLeuAspSerGlyAlaLeuHisGluLysAlaLeuGln354045SerAsnHisPheGluLeuSerLeuArgThrGluAlaThrGlnGlyLeu505560ValLeuTrpSerGlyLysAlaThrGluArgAlaAspTyrValAlaLeu65707580AlaIleValAspGlyHisLeuGlnLeuSerTyrAsnLeuGlySerGln859095ProValValLeuArgSerThrValProValAsnThrAsnArgTrpLeu100105110ArgValValAlaHisArgGluGlnArgGluGlySerLeuGlnValGly115120125AsnGluAlaProValThrGlySerSerProLeuGlyAlaThrGlnLeu130135140AspThrAspGlyAlaLeuTrpLeuGlyGlyLeuProGluLeuProVal145150155160GlyProAlaLeuProLysAlaTyrGlyThrGlyPheValGlyCysLeu165170175ArgAspValValValGlyArgHisProLeuHisLeuLeuGluAspAla180185190ValThrLysProGluLeuArgProCysProThrPro195200828DNA人工序列ArtificialSequence8gacggatccacatgcccggagcgcgcgc28927DNA人工序列ArtificialSequence9agctcgagtcagccacggcgggacagg271027DNA人工序列ArtificialSequence10gacggatcccgtccccgctgctcctgc271126DNA人工序列ArtificialSequence11agctcgagtcagtcctccgagtcctc261227DNA人工序列ArtificialSequence12gacggatccgggccgtgtgtctgtgac271325DNA人工序列ArtificialSequence13agctcgagtcagacaggtggcccag251427DNA人工序列ArtificialSequence14gacggatccgccagctgctacaatagc271526DNA人工序列ArtificialSequence15agctcgagttagctactcggcagacg261628DNA人工序列ArtificialSequence16gacggatccagcagcgcagtgacacctc281726DNA人工序列ArtificialSequence17agctcgagttagtccacatcaccggc261827DNA人工序列ArtificialSequence18gacggatcccccttcctggctgacttc271926DNA人工序列ArtificialSequence19agctcgagtcagcaggggtgacctgc262027DNA人工序列ArtificialSequence20gacggatcctcagcgggggacgtggat272126DNA人工序列ArtificialSequence21agctcgagtcatggggtggggcaggg26221146DNA人AgrinAgrin-3022acatgcccggagcgcgcgctggagcggcgcgaggaggaggcgaacgtggtgctcaccggg60acggtggaggagatcctcaacgtggacccggtgcagcacacgtactcctgcaaggttcgg120gtctggcggtacttgaagggcaaagacctggtggcccgggagagcctgctggacggcggc180aacaaggtggtgatcagcggctttggagaccccctcatctgtgacaaccaggtgtccact240ggggacaccaggatcttctttgtgaaccctgcacccccatacctgtggccagcccacaag300aacgagctgatgctcaactccagcctcatgcggatcaccctgcggaacctggaggaggtg360gagttctgtgtggaagataaacccgggacccacttcactccagtgcctccgacgcctcct420gatgcgtgccggggaatgctgtgcggcttcggcgccgtgtgcgagcccaacgcggagggg480ccgggccgggcgtcctgcgtctgcaagaagagcccgtgccccagcgtggtggcgcctgtg540tgtgggtcggacgcctccacctacagcaacgaatgcgagctgcagcgggcgcagtgcagc600cagcagcgccgcatccgcctgctcagccgcgggccgtgcggctcgcgggacccctgctcc660aacgtgacctgcagcttcggcagcacctgtgcgcgctcggccgacgggctgacggcctcg720tgcctgtgccccgcgacctgccgtggcgcccccgaggggaccgtctgcggcagcgacggc780gccgactaccccggcgagtgccagctcctgcgccgcgcctgcgcccgccaggagaatgtc840ttcaagaagttcgacggcccttgtgacccctgtcagggcgccctccctgacccgagccgc900agctgccgtgtgaacccgcgcacgcggcgccctgagatgctcctacggcccgagagctgc960cctgcccggcaggcgccagtgtgtggggacgacggagtcacctacgaaaacgactgtgtc1020atgggccgatcgggggccgcccggggtctcctcctgcagaaagtgcgctccggccagtgc1080cagggtcgagaccagtgcccggagccctgccggttcaatgccgtgtgcctgtcccgccgt1140ggctga114623873DNA人AgrinAgrin-41123cgtccccgctgctcctgcgaccgcgtcacctgtgacggggcctacaggcccgtgtgtgcc60caggacgggcgcacgtatgacagtgattgctggcggcagcaggctgagtgccggcagcag120cgtgccatccccagcaagcaccagggcccgtgtgaccaggccccgtccccatgcctcggg180gtgcagtgtgcatttggggcgacgtgtgctgtgaagaacgggcaggcagcgtgtgaatgc240ctgcaggcgtgctcgagcctctacgatcctgtgtgcggcagcgacggcgtcacatacggc300agcgcgtgcgagctggaggccacggcctgtaccctcgggcgggagatccaggtggcgcgc360aaaggaccctgtgaccgctgcgggcagtgccgctttggagccctgtgcgaggccgagacc420gggcgctgcgtgtgcccctctgaatgcgtggctttggcccagcccgtgtgtggctccgac480gggcacacgtaccccagcgagtgcatgctgcacgtgcacgcctgcacacaccagatcagc540ctgcacgtggcctcagctggaccctgtgagacctgtggagatgccgtgtgtgcttttggg600gctgtgtgctccgcagggcagtgtgtgtgtccccggtgtgagcaccccccgcccggcccc660gtgtgtggcagcgacggtgtcacctacggcagtgcctgcgagctacgggaagccgcctgc720ctccagcagacacagatcgaggaggcccgggcagggccgtgcgagcaggccgagtgcggt780tccggaggctctggctctggggaggacggtgactgtgagcaggagctgtgccggcagcgc840ggtggcatctgggacgaggactcggaggactga873241203DNA人AgrinAgrin-70124gggccgtgtgtctgtgacttcagctgccagagtgtcccaggcagcccggtgtgcggctca60gatggggtcacctacagcaccgagtgtgagctgaagaaggccaggtgtgagtcacagcga120gggctctacgtagcggcccagggagcctgccgaggccccaccttcgccccgctgccgcct180gtggcccccttacactgtgcccagacgccctacggctgctgccaggacaatatcaccgca240gcccggggcgtgggcctggctggctgccccagtgcctgccagtgcaacccccatggctct300tacggcggcacctgtgacccagccacaggccagtgctcctgccgcccaggtgtggggggc360ctcaggtgtgaccgctgtgagcctggcttctggaactttcgaggcatcgtcaccgatggc420cggagtggctgtacaccctgcagctgtgatccccaaggcgccgtgcgggatgactgtgag480cagatgacggggctgtgctcgtgtaagcccggggtggctggacccaagtgtgggcagtgt540ccagacggccgtgccctgggccccgcgggctgtgaagctgacgcttctgcgcctgcgacc600tgtgcggagatgcgctgtgagttcggtgcgcggtgcgtggaggagtctggctcagcccac660tgtgtctgcccgatgctcacctgtccagaggccaacgctaccaaggtctgtgggtcagat720ggagtcacatacggcaacgagtgtcagctgaagaccatcgcctgccgccagggcctgcaa780atctctatccagagcctgggcccgtgccaggaggctgttgctcccagcactcacccgaca840tctgcctccgtgactgtgaccaccccagggctcctcctgagccaggcactgccggccccc900cccggcgccctccccctggctcccagcagtaccgcacacagccagaccacccctccgccc960tcatcacgacctcggaccactgccagcgtccccaggaccaccgtgtggcccgtgctgacg1020gtgccccccacggcaccctcccctgcacccagcctggtggcgtccgcctttggtgaatct1080ggcagcactgatggaagcagcgatgaggaactgagcggggaccaggaggccagtgggggt1140ggctctggggggctcgagcccttggagggcagcagcgtggccacccctgggccacctgtc1200tga120325543DNA人AgrinAgrin-110325gcttcctgctacaactccgcgttgggctgctgctctgatgggaagacgccctcgctggac60gcagagggctccaactgccccgccaccaaggtgttccagggcgtcctggagctggagggc120gtcgagggccaggagctgttctacacgcccgagatggctgaccccaagtcagaactgttc180ggggagacagccaggagcattgagagcaccctggacgacctcttccggaattcagacgtc240aagaaggattttcggagtgtccgcttgcgggacctggggcccggcaaatccgtccgcgcc300attgtggatgtgcactttgaccccaccacagccttcagggcacccgacgtggcccgggcc360ctgctccggcagatccaggtgtccaggcgccggtccttgggggtgaggcggccgctgcag420gagcacgtgcgatttatggactttgactggtttcctgcgtttatcacgggggccacgtca480ggagccattgctgcgggagccacggccagagccaccactgcatcgcgcctgccgtcctct540taa54326687DNA人AgrinAgrin-128126tcctctgctgtgacccctcgggccccgcaccccagtcacacaagccagcccgttgccaag60accacggcagcccccaccacacgtcggccccccaccactgcccccagccgtgtgcccgga120cgtcggcccccggccccccagcagcctccaaagccctgtgactcacagccctgcttccac180ggggggacctgccaggactgggcattgggcgggggcttcacctgcagctgcccggcaggc240aggggaggcgccgtctgtgagaaggtgcttggcggggaccacccctgcctgcccaacccc300tgccatggcggggccccatgccagaacctggaggctggaaggttccattgccagtgcccg360cccggccgcgtcggaccaacctgtgccgatgagaagagcccctgccagcccaacccctgc420catggggcggcgccctgccgtgtgctgcccgagggtggtgctcagtgcgagtgccccctg480gggcgtgagggcaccttctgccagacagcctcggggcaggacggctctggggcaggtcac540ccctgcacccgggcctcaggccacccctgcctcaatggggcctcctgcgtcccgagggag600gctgcctatgtgtgcctgtgtcccgggggattctcaggaccgcactgcgagaaggggctg660gtggagaagtcagcgggggacgtggat68727567DNA人AgrinAgrin-163527cccttcctggctgacttcaacggcttctcccacctggagctgagaggcctgcacaccttt60gcacgggacctgggggagaagatggcgctggaggtcgtgttcctggcacgaggccccagc120ggcctcctgctctacaacgggcagaagacggacggcaagggggacttcgtgtcgctggca180ctgcgggaccgccgcctggagttccgctacgacctgggcaagggggcagcggtcatcagg240agcagggagccagtcaccctgggagcctggaccagggtctcactggagcgaaacggccgc300aagggtgccctgcgtgtgggcgacggcccccgtgtgttgggggagtccccgaaatcccgc360aaggttccgcacaccgtcctcaacctgaaggagccgctctacgtagggggcgctcccgac420ttcagca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权利要求：1.一种人Agrin抗原，其特征在于，包括以下任意一种片段或者七种片段：片段1：Agrin-40，氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；片段2：Agrin-411，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；片段3：Agrin-701，氨基酸序列如SEQIDNO.3所示；片段4：Agrin-1103，氨基酸序列如SEQIDNO.4所示；片段5：Agrin-1281，氨基酸序列如SEQIDNO.5所示；片段6：Agrin-1635，氨基酸序列如SEQIDNO.6所示；片段7：Agrin-1864，氨基酸序列如SEQIDNO.7所示。2.一种权利要求1所述的人Agrin抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1、将Agrin-40、Agrin-411、Agrin-701、Agrin-1103、Agrin-1281、Agrin-1635和Agrin-1864共7个片段的DNA序列分别进行基因合成，设计引物PCR扩增后，分别连接进表达载体，构建7个重组表达质粒；步骤2、将构建好的重组质粒分别转化进入表达菌，构建7个重组表达工程菌；步骤3、Agrin-40、Agrin-411、Agrin-701、Agrin-1103、Agrin-1281、Agrin-1635和Agrin-1864的抗原片段的诱导表达及纯化。3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1中所述7个片段的引物对分别为：Agrin-40-P1：核苷酸序列如SEQIDNO.8所示；Agrin-40-P2：核苷酸序列如SEQIDNO.9所示；Agrin-411-P1：核苷酸序列如SEQIDNO.10所示；Agrin-411-P2：核苷酸序列如SEQIDNO.11所示；Agrin-701-P1：核苷酸序列如SEQIDNO.12所示；Agrin-701-P2：核苷酸序列如SEQIDNO.13所示；Agrin-1103-P1：核苷酸序列如SEQIDNO.14所示；Agrin-1103-P2：核苷酸序列如SEQIDNO.15所示；Agrin-1281-P1：核苷酸序列如SEQIDNO.16所示；Agrin-1281-P2：核苷酸序列如SEQIDNO.17所示；Agrin-1635-P1：核苷酸序列如SEQIDNO.18所示；Agrin-1635-P2：核苷酸序列如SEQIDNO.19所示；Agrin-1864-P1：核苷酸序列如SEQIDNO.20所示；Agrin-1864-P2：核苷酸序列如SEQIDNO.21所示。4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1中PCR扩增的反应体系为：H2O38.7ul；Buffer5ul；dNTP3ul；上引物1ul；下引物1ul；DNA1ul；TaqE0.3ul；扩增程序为：94度变性5min；94度变性45sec、57度150sec、72度90sec，32个循环；72度延伸10min。5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3中诱导表达的具体步骤为：将7个重组菌分别接种于LB培养液中摇菌至OD600至0.6-0.8时，按1:1000加入24mgml浓度的IPTG诱导4-6小时；所述步骤3中诱导表达后的纯化条件是：上样缓冲液：0.5MNaCl、20mMNa2HPO3、10mM咪唑；或者上样缓冲液：8M尿素、0.5MNaCl、20mMNa2HPO3、10mM咪唑；结合缓冲液：0.5MNaCl、20mMNa2HPO3、20mM咪唑；洗脱缓冲液：0.5MNaCl、20mMNa2HPO3、500mM咪唑。6.一种人Agrin抗原的表达载体，其特征在于，所述表达载体为7个，所述7个表达载体的表达区的核苷酸序列分别为：如SEQIDNO.22、SEQIDNO.23、SEQIDNO.24、SEQIDNO.25、SEQIDNO.26、SEQIDNO.27、SEQIDNO.28所示。7.一种人Agrin抗体检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括：A包被有权利要求1所述的人Agrin抗原的ELISA酶标板；所述人Agrin抗原包括Agrin-40、Agrin-411、Agrin-701、Agrin-1103、Agrin-1281、Agrin-1635和Agrin-1864中的任意一种或者七种；B标准阴性血清：Agrin抗体阴性的血清；C标准阳性血清：Agrin抗体阳性的血清；D辣根过氧化物酶标记的酶标二抗：抗人IGG、IGM和IGA；E样品稀释液、包被缓冲液、封闭液、ELISA酶标板洗涤液、抗体稀释液、显色液和终止液。8.如权利要求7所述的人Agrin抗体检测试剂盒，其特征在于，所述人Agrin抗原中Agrin-40、Agrin-411、Agrin-701、Agrin-1103、Agrin-1281、Agrin-1635和Agrin-1864的包被浓度分别为200ngml、200ngml、250ngml、250ngml、300ngml、150ngml和150ngml。9.一种人Agrin抗体的检测方法，其特征在于，所述的检测方法包括以下步骤：S1、制备检测ELISA酶标板：包被缓冲液将权利要求1所述的人Agrin抗原稀释后加到酶标板中吸附，空干包被用洗液，加包被用封闭液封闭；所述人Agrin抗原包括Agrin-40、Agrin-411、Agrin-701、Agrin-1103、Agrin-1281、Agrin-1635和Agrin-1864中的任意一种或者七种；S2、待检血清、阴性血清、阳性血清分别作为一抗，加样至ELISA酶标板孔中进行孵育；S3、酶标二抗的孵育：辣根过氧化物酶标记的酶标二抗加入ELISA酶标板，洗涤液洗涤，甩干；S4、加入显色液，室温避光孵育，加入终止液终止反应；在酶标仪上450nm波长下测定OD值。10.权利要求7所述的检测试剂盒在诊断重症肌无力疾病中的应用。

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