申请/专利权人：四川大学华西医院

申请日：2018-04-19

公开（公告）日：2022-09-20

公开（公告）号：CN110386985B

主分类号：C07K19/00

分类号：C07K19/00;C07K1/22;C12N15/62;C12N15/70;A61K38/17;A61P35/00

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2022.09.20#授权;2019.11.22#实质审查的生效;2019.10.29#公开

摘要：本发明提供了一种肿瘤靶向性促凋亡融合蛋白，它由TRAIL片段及肿瘤导向肽RGR连接而成。本发明还提供了该融合蛋白的制备方法和用途。本发明融合蛋白可以显著增强TRAIL片段的抗肿瘤活性，在体内外均对多种肿瘤模型表现出强大的杀伤甚至清除能力，可作为高效的潜在广谱抗肿瘤药物，临床应用前景良好。

主权项：1.一种肿瘤靶向性促凋亡融合蛋白，其特征在于：它由TRAIL片段及肿瘤导向肽RGR连接而成，其中肿瘤导向肽RGR的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；所述TRAIL片段的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；所述肿瘤导向肽RGR连接在TRAIL片段的N端。

全文数据：一种肿瘤靶向性促凋亡融合蛋白及其用途技术领域本发明属于肿瘤治疗技术领域，具体涉及一种肿瘤靶向性促凋亡融合蛋白及其用途。背景技术癌症是致人类死亡的主要疾病之一，据WHO统计2015年全球约880万癌症相关死亡病例。目前，临床上治疗癌症主要依赖手术切除、放疗和化疗三种传统方法，存在着手术会造成创伤及并发症，放化疗具有毒副作用影响患者生活质量等缺点。肿瘤治疗的理想目标是药物能高效进入肿瘤组织杀伤肿瘤细胞但对正常细胞无损伤，避免给机体带来毒副作用Yapetal.,NatRevCancer2009,93:167-81；Gotwalsetal.,NatRevCancer2017,175:286-301。TRAILTNFrelatedapoptosisinducingligand，TRAIL即Apo-2L，是肿瘤坏死因子超家族成员之一，是一种Ⅱ型跨膜糖蛋白，研究表明TRAIL主要通过两条不同的信号通路调控细胞凋亡，即死亡受体介导的外源性凋亡途径和线粒体介导的内源性凋亡途径。正常细胞则可通过上调诱骗受体等多种机制逃逸TRAIL诱导的凋亡反应。因此，TRAIL能选择性的诱导肿瘤细胞凋亡而对机体正常组织无明显损伤。目前，通过基因工程重组的胞外段114-281aa可溶性TRAILSolubleTRAIL，sTRAIL作为抗肿瘤药物已进入临床试验II期。然而，重组sTRAIL在体内的抗肿瘤效果远不及其体外作用效果。由于sTRAIL受体分布广泛，与正常细胞诱骗受体的结合可能会阻碍sTRAIL向肿瘤组织富集和活性的发挥。更为重要的是，肿瘤细胞常常表现出对sTRAIL的抗性，使得sTRAIL凋亡诱导能力不足Dimbergetal.,Oncogene2013,3211:1341-50；deMigueletal.,CellDeathDiffer2016,235:733-47。通过改进sTRAIL蛋白，有望提高其对肿瘤的靶向性并增强对肿瘤细胞的凋亡诱导能力。肿瘤导向肽是一类能够特异识别并结合肿瘤组织的小分子肽，可作为肿瘤靶向载体。公开号为EP2567983A1的专利申请报道了一种由肿瘤导向肽NGR与sTRAIL连接的重组多肽，其仅在一定程度上提高了sTRAIL对肿瘤细胞的杀伤作用。发明内容本发明的目的在于提供一种对肿瘤细胞具有良好杀伤作用的肿瘤靶向性促凋亡融合蛋白及其用途。本发明提供了一种肿瘤靶向性促凋亡融合蛋白，它由TRAIL片段及肿瘤导向肽RGR连接而成，其中肿瘤导向肽RGR的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。SEQIDNO.1：CRGRRST其中，所述TRAIL片段的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。SEQIDNO.2：VRERGPQRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVG其中，它还包含连接肽；优选地，连接肽的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。SEQIDNO.3：GGGGSGGGGSGGGGS其中，所述肿瘤导向肽RGR连接在TRAIL片段的N端。其中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。SEQIDNO.4：CRGRRSTGGGGSGGGGSGGGGSVRERGPQRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVGSEDIDNO.5：VRERGPQRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVGGGGGSGGGGSGGGGSCRGRRST本发明还提供了编码上述融合蛋白的核苷酸序列；其中，核苷酸序列如SEQIDNO.6或SEQIDNO.7所示。SEQIDNO.6：tgccgtggccgccgtagcactggtggaggcggttcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcggtgagagaaagaggtcctcagagagtagcagctcacataactgggaccagaggaagaagcaacacattgtcttctccaaactccaagaatgaaaaggctctgggccgcaaaataaactcctgggaatcatcaaggagtgggcattcattcctgagcaacttgcacttgaggaatggtgaactggtcatccatgaaaaagggttttactacatctattcccaaacatactttcgatttcaggaggaaataaaagaaaacacaaagaacgacaaacaaatggtccaatatatttacaaatacacaagttatcctgaccctatattgttgatgaaaagtgctagaaatagttgttggtctaaagatgcagaatatggactctattccatctatcaagggggaatatttgagcttaaggaaaatgacagaatttttgtttctgtaacaaatgagcacttgatagacatggaccatgaagccagttttttcggggcctttttagttggctaa；SEQIDNO.7：gtgagagaaagaggtcctcagagagtagcagctcacataactgggaccagaggaagaagcaacacattgtcttctccaaactccaagaatgaaaaggctctgggccgcaaaataaactcctgggaatcatcaaggagtgggcattcattcctgagcaacttgcacttgaggaatggtgaactggtcatccatgaaaaagggttttactacatctattcccaaacatactttcgatttcaggaggaaataaaagaaaacacaaagaacgacaaacaaatggtccaatatatttacaaatacacaagttatcctgaccctatattgttgatgaaaagtgctagaaatagttgttggtctaaagatgcagaatatggactctattccatctatcaagggggaatatttgagcttaaggaaaatgacagaatttttgtttctgtaacaaatgagcacttgatagacatggaccatgaagccagttttttcggggcctttttagttggcggtggaggcggttcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcgtgccgtggccgccgtagcacttaa。本发明还提供了上述融合蛋白的制备方法，步骤如下：用上述核苷酸序列构建表达载体，并将其在宿主细胞中诱导表达纯化；其中，所述表达载体为pQE30重组载体，所述宿主细胞为大肠杆菌M15，所说纯化方法为镍离子金属鳌合亲和层析法。本发明还提供了上述融合蛋白、核苷酸序列在制备抗肿瘤药物中的用途。其中，所述肿瘤为结肠癌、胆管癌、乳腺癌、肝癌、肺癌和或宫颈癌。本发明还提供了一种抗肿瘤药物，它是以上述融合蛋白或核苷酸序列为活性成分，加入其它辅料或辅助性成分制备而成。本发明提供的融合蛋白，利用肿瘤导向肽RGR融合sTRAIL，可以显著增强sTRAIL片段的抗肿瘤活性，尤其是RGR-TRAIL重组融合蛋白，在体内外均对多种肿瘤模型表现出强大的杀伤甚至清除能力，可作为高效的潜在广谱抗肿瘤药物，临床应用前景良好。显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。附图说明图1RGR靶向的TRAIL突变体构建示意图TRAIL胞外段114-281氨基酸部分为可溶表达结构域，命名为sTRAIL。将肿瘤导向肽RGR分别融合至sTRAIL的N端和C端，构建RGR-TRAIL和TRAIL-RGR重组蛋白。示意图基于PathwayBuilderTool2.0版构建。图2重组蛋白的SDS-PAGE还原电泳图3融合RGR增强了TRAIL对肿瘤细胞的活性细胞存活率测定显示，将RGR与sTRAIL融合，尤其是连接至sTRAIL的N末端，显著增强了sTRAIL对肿瘤细胞的杀伤活性，但对正常细胞HUVEC无明显细胞毒性。图4RGR-TRAIL在体内的靶向性重组蛋白用FAM染料标记后，通过尾静脉注射，不同时间点取瘤体冰冻切片进行免疫荧光染色。FAM标记的蛋白呈绿色荧光，CD31抗体染色的肿瘤血管内皮细胞呈红色荧光，细胞核复染为蓝色荧光。图5不同融合方式对结肠癌COLO205的体内抑制效果比较A.肿瘤生长至近160mm3时，尾静脉按照5mgkg剂量给药1次箭头所示，绘制瘤体生长曲线。B.治疗观察结束后的瘤体重量比较。*PTRAIL-RGRsTRAIL。尤其是RGR-TRAIL组，给药后5天内肿瘤持续减小至约20mm3，且给药后8天内肿瘤仍无明显生长，此后瘤体的生长速度仍然受到抑制。TRAIL-RGR在给药2天内肿瘤减小至约50％，但瘤体随后恢复生长。与TRAIL-RGR相比，RGR-TRAIL体现出更为高效的肿瘤杀伤和抑制能力P四川大学华西医院一种肿瘤靶向性促凋亡融合蛋白及其用途GY026-18P11857SIPOSequenceListing1.017PRT人工序列Artificialsequence，肿瘤导向肽RGR1CysArgGlyArgArgSerThr152168PRT人工序列Artificialsequence，TRAIL片段2ValArgGluArgGlyProGlnArgValAlaAlaHisIleThrGlyThr151015ArgGlyArgSerAsnThrLeuSerSerProAsnSerLysAsnGluLys202530AlaLeuGlyArgLysIleAsnSerTrpGluSerSerArgSerGlyHis354045SerPheLeuSerAsnLeuHisLeuArgAsnGlyGluLeuValIleHis505560GluLysGlyPheTyrTyrIleTyrSerGlnThrTyrPheArgPheGln65707580GluGluIleLysGluAsnThrLysAsnAspLysGlnMetValGlnTyr859095IleTyrLysTyrThrSerTyrProAspProIleLeuLeuMetLysSer100105110AlaArgAsnSerCysTrpSerLysAspAlaGluTyrGlyLeuTyrSer115120125IleTyrGlnGlyGlyIlePheGluLeuLysGluAsnAspArgIlePhe130135140ValSerValThrAsnGluHisLeuIleAspMetAspHisGluAlaSer145150155160PhePheGlyAlaPheLeuValGly165315PRT人工序列Artificialsequence，连接肽3GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer1510154190PRT人工序列Artificialsequence，融合蛋白14CysArgGlyArgArgSerThrGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGly151015SerGlyGlyGlyGlySerValArgGluArgGlyProGlnArgValAla202530AlaHisIleThrGlyThrArgGlyArgSerAsnThrLeuSerSerPro354045AsnSerLysAsnGluLysAlaLeuGlyArgLysIleAsnSerTrpGlu505560SerSerArgSerGlyHisSerPheLeuSerAsnLeuHisLeuArgAsn65707580GlyGluLeuValIleHisGluLysGlyPheTyrTyrIleTyrSerGln859095ThrTyrPheArgPheGlnGluGluIleLysGluAsnThrLysAsnAsp100105110LysGlnMetValGlnTyrIleTyrLysTyrThrSerTyrProAspPro115120125IleLeuLeuMetLysSerAlaArgAsnSerCysTrpSerLysAspAla130135140GluTyrGlyLeuTyrSerIleTyrGlnGlyGlyIlePheGluLeuLys145150155160GluAsnAspArgIlePheValSerValThrAsnGluHisLeuIleAsp165170175MetAspHisGluAlaSerPhePheGlyAlaPheLeuValGly1801851905190PRT人工序列Artificialsequence，融合蛋白25ValArgGluArgGlyProGlnArgValAlaAlaHisIleThrGlyThr151015ArgGlyArgSerAsnThrLeuSerSerProAsnSerLysAsnGluLys202530AlaLeuGlyArgLysIleAsnSerTrpGluSerSerArgSerGlyHis354045SerPheLeuSerAsnLeuHisLeuArgAsnGlyGluLeuValIleHis505560GluLysGlyPheTyrTyrIleTyrSerGlnThrTyrPheArgPheGln65707580GluGluIleLysGluAsnThrLysAsnAspLysGlnMetValGlnTyr859095IleTyrLysTyrThrSerTyrProAspProIleLeuLeuMetLysSer100105110AlaArgAsnSerCysTrpSerLysAspAlaGluTyrGlyLeuTyrSer115120125IleTyrGlnGlyGlyIlePheGluLeuLysGluAsnAspArgIlePhe130135140ValSerValThrAsnGluHisLeuIleAspMetAspHisGluAlaSer145150155160PhePheGlyAlaPheLeuValGlyGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGly165170175GlySerGlyGlyGlyGlySerCysArgGlyArgArgSerThr1801851906573DNA人工序列Artificialsequence，16tgccgtggccgccgtagcactggtggaggcggttcaggcggaggtggctctggcggtggc60ggatcggtgagagaaagaggtcctcagagagtagcagctcacataactgggaccagagga120agaagcaacacattgtcttctccaaactccaagaatgaaaaggctctgggccgcaaaata180aactcctgggaatcatcaaggagtgggcattcattcctgagcaacttgcacttgaggaat240ggtgaactggtcatccatgaaaaagggttttactacatctattcccaaacatactttcga300tttcaggaggaaataaaagaaaacacaaagaacgacaaacaaatggtccaatatatttac360aaatacacaagttatcctgaccctatattgttgatgaaaagtgctagaaatagttgttgg420tctaaagatgcagaatatggactctattccatctatcaagggggaatatttgagcttaag480gaaaatgacagaatttttgtttctgtaacaaatgagcacttgatagacatggaccatgaa540gccagttttttcggggcctttttagttggctaa5737573DNA人工序列Artificialsequence，27gtgagagaaagaggtcctcagagagtagcagctcacataactgggaccagaggaagaagc60aacacattgtcttctccaaactccaagaatgaaaaggctctgggccgcaaaataaactcc120tgggaatcatcaaggagtgggcattcattcctgagcaacttgcacttgaggaatggtgaa180ctggtcatccatgaaaaagggttttactacatctattcccaaacatactttcgatttcag240gaggaaataaaagaaaacacaaagaacgacaaacaaatggtccaatatatttacaaatac300acaagttatcctgaccctatattgttgatgaaaagtgctagaaatagttgttggtctaaa360gatgcagaatatggactctattccatctatcaagggggaatatttgagcttaaggaaaat420gacagaatttttgtttctgtaacaaatgagcacttgatagacatggaccatgaagccagt480tttttcggggcctttttagttggcggtggaggcggttcaggcggaggtggctctggcggt540ggcggatcgtgccgtggccgccgtagcacttaa573

权利要求：1.一种肿瘤靶向性促凋亡融合蛋白，其特征在于：它由TRAIL片段及肿瘤导向肽RGR连接而成，其中肿瘤导向肽RGR的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：所述TRAIL片段的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于：它还包含连接肽；优选地，连接肽的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。4.根据权利要求1-3任意一项所述的融合蛋白，其特征在于：所述肿瘤导向肽RGR连接在TRAIL片段的N端或C端。5.根据权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.4或SEQIDNO.5所示。6.编码权利要求1-5任意一项所述融合蛋白的核苷酸序列；其中，核苷酸序列如SEQIDNO.6或SEQIDNO.7所示。7.权利要求1-5任意一项所述融合蛋白的制备方法，其特征在于：步骤如下：用权利要求6所述的核苷酸序列构建表达载体，并将其在宿主细胞中诱导表达纯化；其中，所述表达载体为pQE30重组载体，所述宿主细胞为大肠杆菌M15，所说纯化方法为镍离子金属鳌合亲和层析法。8.权利要求1-5任意一项所述的融合蛋白、权利要求6所述的核苷酸序列在制备抗肿瘤药物中的用途。9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：所述肿瘤为结肠癌、胆管癌、乳腺癌、肝癌、肺癌和或宫颈癌。10.一种抗肿瘤药物，其特征在于：它是以权利要求1-5任意一项所述的融合蛋白或权利要求6所述的核苷酸序列为活性成分，加入其它辅料或辅助性成分制备而成。

百度查询： 四川大学华西医院 一种肿瘤靶向性促凋亡融合蛋白及其用途

免责声明
1、本报告根据公开、合法渠道获得相关数据和信息，力求客观、公正，但并不保证数据的最终完整性和准确性。
2、报告中的分析和结论仅反映本公司于发布本报告当日的职业理解，仅供参考使用，不能作为本公司承担任何法律责任的依据或者凭证。

阅读全文 双屏查看 官方信息 专利公告 收藏专利 下载PDF 下载WORD