申请/专利权人：皮里斯制药有限公司

申请日：2016-05-18

公开（公告）日：2022-09-23

公开（公告）号：CN108112253B

主分类号：C07K14/47

分类号：C07K14/47;C07K14/705;C07K16/28;C07K16/32

优先权：["20150518 EP 15167927.1","20160108 EP 16150508.6"]

专利状态码：有效-授权

法律状态：2022.09.23#授权;2018.06.29#实质审查的生效;2018.06.01#公开

摘要：本公开内容提供了对CD137和GPC3两者特异的融合多肽，所述融合多肽可用于将CD137聚集和活化导向至GPC3阳性肿瘤细胞。这种融合多肽可用于许多制药应用中，例如用作用于治疗或预防人类疾病如各种肿瘤的抗癌剂和或免疫调节剂。本公开内容还涉及制备本文所述的融合多肽的方法以及包含这种融合多肽的组合物。本公开内容还涉及编码这种融合多肽的核酸分子以及用于产生这种融合多肽和核酸分子的方法。此外，本申请公开了这种融合多肽以及包含一种或多种这种融合多肽的组合物的治疗和或诊断用途。

主权项：1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白能够结合CD137和GPC3两者，并且所述融合蛋白包含至少两个任意顺序的亚基，其中第一亚基是对CD137特异性的，第二亚基是对GPC3特异性的，并且其中a所述融合蛋白由两条重链和两条轻链组成，其中，所述重链和所述轻链的氨基酸序列分别如SEQIDNO：36和SEQIDNO：37所示，所述重链和所述轻链的氨基酸序列分别如SEQIDNO：38和SEQIDNO：39所示，所述重链和所述轻链的氨基酸序列分别如SEQIDNO：40和SEQIDNO：41所示，所述重链和所述轻链的氨基酸序列分别如SEQIDNO：42和SEQIDNO：43所示，或所述重链和所述轻链的氨基酸序列分别如SEQIDNO：53和SEQIDNO：54所示；b所述融合蛋白由两条相同的多肽链组成，其中所述多肽链的氨基酸序列如SEQIDNO：44所示或如SEQIDNO：45所示；或者c所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：46所示或如SEQIDNO：47所示。

全文数据：抗癌融合多肽背景技术[0001]磷脂酰肌醇蛋白聚糖3GPC3是属于糖基-磷脂酰肌醇-锚定硫酸肝素蛋白聚糖的磷脂酰肌醇蛋白聚糖家族的癌胚抗原。在发育过程中，GPC3在胎肝和胎盘中表达，并在正常成人组织中下调或沉默。GPC3基因中的突变和缺失负责人的辛普森-戈拉比-贝默尔或辛普森畸形综合征。GPC3在各种癌症，特别是肝细胞癌（“HCC”）、黑素瘤、Merkel细胞癌、WiIm月中瘤和肝母细胞瘤中表达（He，Η·等人AppliedImmunohistochemMolMorphol.17:40-62009;Jakubovic和Jothy;Ex.MoI.Path.82:184-1892007;Nakatsura和Nishimura，Biodrugs192:71-772005ACC是全球癌症相关死亡的第三大原因。每年由于HCC约有100万人死亡。（Nakatsura和Nishimura，Biodrugs19⑵：71-772005〇[0002]针对GPC3表达的癌症诸如HCC的有效治疗需要靶向GPC3并且还产生抗肿瘤作用的治疗化合物。[0003]CD137是共刺激免疫受体，是肿瘤坏死因子受体TNFR超家族的成员。它主要在活化的CD4+和CD8+T细胞、活化的B细胞以及天然杀伤NK细胞上表达，但也可以被发现于静息的单核细胞和树突状细胞Li，S.Y.等人，ClinPharmacol，20135SupplI:47-53或内皮细胞上（Snell，L.M·等人，ImmunolRev2011Nov;2441:197-2172的阈值。⑶应答者数量。[0065]图24:提供了如实施例24和25中描述的关于多肽对FcgRI、FcgRIII和FcRn的亲和力的代表性实验。[0066]图25:提供了小鼠中双特异性融合多肽SEQIDNO:44和SEQIDNO:45的药代动力学分析结果。给雄性CD-I小鼠（每个时间点3只小鼠）以10mgkg的剂量静脉内注射融合多肽。使用通过靶标GPC3和⑶137检测完整的双特异性构建体的夹心ELISA检测了药物水平。使用二室模型拟合数据。[0067]图26:提供了食蟹猴中双特异性融合多肽SEQIDN0:44和SEQIDN0:45的药代动力学分析的结果。雄性食蟹猴以3mgkg的剂量接受测试品，静脉内输注持续60分钟。使用通过靶标GPC3和CD137检测完整的双特异性构建体的夹心ELISA检测了药物水平。使用二室模型拟合数据。具体实施方式[0068]在一些实施方案中，所述融合多肽包含至少两个任意顺序的亚基:包含对GPC3特异的全长免疫球蛋白、其抗原结合结构域或脂质运载蛋白突变蛋白的第一亚基，以及包含对CD137特异的全长免疫球蛋白、其抗原结合结构域或脂质运载蛋白突变蛋白的第二亚基。[0069]在一些实施方案中，所述融合多肽还可以包含第三亚基。例如，所述多肽可以包含对⑶137特异的亚基。在一些实施方案中，所述第三亚基包含对⑶137特异的脂质运载蛋白关变蛋白。[0070]在一些实施方案中，一个亚基可基本如图1中描述连接至另一个亚基。[0071]例如，一个脂质运载蛋白突变蛋白可通过肽键连接至所述免疫球蛋白重链结构域VH的C末端、VH的N末端、免疫球蛋白轻链VL的C末端和或VL的N末端，如图IA中描述。在一些具体的实施方案中，脂质运载蛋白突变蛋白亚基可在其N末端和或其C末端融合至免疫球蛋白亚基。例如，所述脂质运载蛋白突变蛋白可以通过肽键被连接至免疫球蛋白的重链恒定区CH的C末端和或轻链恒定区（CL的C末端。在更进一步的一些实施方案中，肽键可以是连接子，特别是非结构化的G4S3连接子，例如，如SEQIDN0:49所示。[0072]作为另一个说明性实例，一个脂质运载蛋白突变蛋白可以通过肽键被连接至免疫球蛋白-Fc片段的C末端或N末端，如图IB所示。[0073]作为另外的实例，一个脂质运载蛋白突变蛋白可以通过肽键被连接至一个或多个其它脂质运载蛋白突变蛋白，如图IC所示。[0074]在这方面，一个亚基可以在其N末端和或其C末端融合至另一个亚基。例如，当一个亚基包含全长免疫球蛋白时，另一个亚基可以通过肽键被连接至第二亚基的N末端和所述免疫球蛋白的重链恒定区（CH的C末端。在进一步的一些实施方案中，第三亚基可以通过肽键被连接至第三结合结构域的N末端和所述免疫球蛋白的轻链恒定区CL的C末端。在更进一步的一些实施方案中，肽键可以是连接子，特别是非结构化的G4S3连接子，例如，如SEQIDN0:49所示，或者可以是非结构化的G4S2连接子，例如，如SEQIDN0:48所示。[0075]在一些实施例中，第三亚基通过肽键被连接至第一亚基，所述肽键结合到第三亚基的脂质运载蛋白突变蛋白的N末端和第一亚基的免疫球蛋白的轻链恒定区CL的C末端。[0076]在关于本公开内容的融合多肽的一些实施方案中，其亚基之一包含全长免疫球蛋白，而所述多肽同时接合GPC3和CD137,同时可以保存全长免疫球蛋白的Fc区对Fc受体阳性细胞的Fc功能。[0077]在关于本公开内容的融合多肽的一些其它实施方案中，其亚基之一包含全长免疫球蛋白，而所述多肽同时接合GPC3和CD137,通过蛋白质工程化可以减少或完全抑制全长免疫球蛋白的Fc区的Fc功能，即与Fcy或FcRn受体阳性细胞的结合。这可以通过例如采用显示与Fc-γ或FcRn受体例如IgG2或IgG4的低相互作用的主链来实现。为了减少与Fc-y受体的残留结合，可以将突变引入IgG主链中，如F234A突变和或L235A突变。此外，关于IgG4主链，可以引入S228P突变以最小化IgG4半抗体的交换。在另外一些实施方案中，在所述融合多肽的免疫球蛋白重链中可能存在另外的N297A突变以便去除天然糖基化基序。[0078]在一些实施方案中，由于同时结合肿瘤细胞上的GPC3和来自免疫系统的效应细胞例如T细胞或NK细胞）的表面上的CDl37，本公开内容的融合多肽可以表现出GPC3依赖性的效应细胞活化，由此所述免疫系统的效应细胞积极地裂解表达GPC3的肿瘤细胞。[0079]在另外一些实施方案中，例如，当在基本如Chacon，J.A.等人PloSone20138⑷：e60031中描述的显示靶标依赖性肿瘤浸润淋巴细胞离体扩增的试验中测量时，所述融合多肽能够显示出与这样的融合多肽中包含的免疫球蛋白相当的或更优的GPC3依赖性CD137活化水平。在另外一些实施方案中，例如，当在类似于Kohrt，H.等人，JClinInvest.2012Mar;1223:1066-75中描述内容的人肝细胞癌（“HCC”）、黑素瘤、Merkel细胞癌、Wilm’s月中瘤和肝母细胞瘤的体内异种移植模型中测量时，所述融合多肽能够显示出与这样的融合多肽中包含的免疫球蛋白相当的或更优的GPC3依赖性CD137活化水平。[0080]在一些实施方案中，包含于本公开内容的融合多肽中的免疫球蛋白的Fc部分可有助于维持所述融合多肽的血清水平，这对于其在体内的稳定性和持久性至关重要。例如，当Fc部分结合到内皮细胞上的和吞噬细胞上的Fc受体时，所述融合多肽可变得内化并再循环回到血流中，从而增加其在体内的半衰期。[0081]在一些实施方案中，包含于本公开内容的融合多肽中的⑶137特异性亚基可以是对CD137特异的脂质运载蛋白突变蛋白，例如SEQIDN0:26的脂质运载蛋白突变蛋白。在一些实施方案中，包含于本公开内容的融合多肽中的CD137特异性亚基可以是对CD137特异的全长免疫球蛋白或其抗原结合结构域，例如单克隆抗体例如SEQIDN0s:34和35的抗体或SEQIDN0s:51和52的抗体）。[0082]在一些实施方案中，包含于本公开内容的融合多肽中的GPC3特异性亚基可以是对GPC3特异的脂质运载蛋白突变蛋白，例如SEQIDNO:8的脂质运载蛋白突变蛋白或SEQIDNO:10的脂质运载蛋白突变蛋白。在一些实施方案中，包含于本公开内容的融合多肽中的CD137特异性亚基可以是对GPC3特异的全长免疫球蛋白或其抗原结合结构域。[0083]在一些实施方案中，在本公开内容的融合多肽中，CD137特异性亚基融合至GPC3特异性亚基。[0084]在一些更具体的实施方案中，GPC3特异性亚基包含脂质运载蛋白突变蛋白，以及⑶137特异性亚基包含单克隆抗体。[0085]在另外一些实施方案中，本公开内容的融合多肽具有两个GPC3特异性亚基和一个⑶137特异性亚基。在一些更具体的实施方案中，每一个GPC3特异性亚基包含脂质运载蛋白突变蛋白，以及每一个CD137特异性亚基包含单克隆抗体。在进一步的一些实施方案中，两个GPC3特异性亚基是相同的。在更进一步的一些实施方案中，所述三个亚基彼此融合，如图IA的结构性描述所示。在一些实施方案中，所述融合多肽包含选自SEQIDN0s:36和37、38和39、40和41或42和43的氨基酸序列。[0086]在其它一些具体实施方案中，GPC3特异性亚基包含脂质运载蛋白突变蛋白，以及CD137特异性亚基包含脂质运载蛋白突变蛋白。在进一步的一些实施方案中，所述两个亚基彼此融合，如图IC的结构性描述所示。在一些实施方案中，所述融合多肽包含SEQIDN0:46的氨基酸序列。[0087]在另外一些具体实施方案中，本公开内容的融合多肽具有两个CD137特异性亚基和一个GPC3特异性亚基。在一些更具体的实施方案中，GPC3特异性亚基包含脂质运载蛋白突变蛋白，以及每一个CD137特异性亚基包含脂质运载蛋白突变蛋白。在进一步的一些实施方案中，两个CD137特异性亚基是相同的。在进一步的一些实施方案中，所述三个亚基彼此融合，如图IC的结构性描述所示。在一些实施方案中，所述融合多肽包含SEQIDN0:47的氨基酸序列。[0088]在另外一些实施方案中，在本公开内容的融合多肽中，所述GPC3特异性亚基包含脂质运载蛋白突变蛋白，以及CD137特异性亚基包含脂质运载蛋白突变蛋白，并且所述两个亚基融合至免疫球蛋白-Fc片段。在进一步的一些实施方案中，如图IB的结构性描述所示，所述两个亚基各自融合至所述免疫球蛋白-Fe片段。在一些具体的实施方案中，所述免疫球蛋白-Fe片段是IgG4-Fc片段。在另外一些实施方案中，将IgG4-Fc片段工程化为具有S228P突变，并最小化在体外和体内的IgG4半抗体交换。在一些实施方案中，所述IgG4-Fc片段具有SEQIDNO:73的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述融合多肽包含SEQIDNO:44或SEQIDNO:45的氨基酸序列。[0089]在一些实施方案中，包含于本公开内容的融合多肽中的免疫球蛋白具有IgG2或IgG4主链。在另外一些实施方案中，所述IgG4主链具有以下选自S228P、N297A、F234A和L235A的突变中的任一个。在另外一些实施方案中，所述IgG2主链具有以下选自N297A、F234A和L235A的突变中的任一个。[0090]在一些实施方案中，例如，当在基本如实施例3、实施例8或实施例15中描述的ELISA试验中测量所述多肽时，所述融合多肽可能够以至少约5nM或甚至更低诸如约InM或更低、约0.6nM或更低、约0.5nM或更低、约0.4nM或更低、或者约0.3nM或更低的EC50值结合CD137〇[0091]在一些实施方案中，例如，当在基本如实施例8或实施例15中描述的ELISA试验中测量包含于本公开内容的融合多肽中的对CD137特异的脂质运载蛋白突变蛋白（诸如SEQIDN0:26的脂质运载蛋白突变蛋白）或包含于本公开内容的融合多肽中的对CD137特异的抗体诸如SEQIDNOs:34和35的抗体或SEQIDNOs:51和52的抗体和所述融合多肽时，所述融合多肽可能够以与所述脂质运载蛋白突变蛋白或所述抗体的EC50值至少一样好或更优的EC50值结合CD137。[0092]在一些实施方案中，例如，当通过基本如实施例6、实施例11或实施例18中描述的表面等离子体共振SPR分析测量时，所述融合多肽可能够以至少约5nM或甚至更低，诸如约InM或更低、约0.6nM或更低、约0.5nM或更低、约0.3nM或更低、约200pM或更低、约150pM或更低、约IOOpM或更低、或约70pM或更低、或约2pM或更低的Kd的亲和力结合CD137。[0093]另一方面，例如，当在基本如实施例2、实施例7、实施例12或实施例14中描述的ELISA试验中测量所述融合多肽时，所述融合多肽可能够以至少约5nM或甚至更低，诸如约InM或更低、约0.6nM或更低、约0.5nM或更低、约0.4nM或更低、约0.3nM或更低、或约0.2nM或更低的EC50值结合GPC3。[0094]在一些实施方案中，例如，当在基本如实施例7、实施例12或实施例14中描述的ELISA试验中测量包含于本公开内容的融合多肽中的对GPC3特异的脂质运载蛋白突变蛋白诸如SEQIDNO:8的脂质运载蛋白突变蛋白或SEQIDNO:10的脂质运载蛋白突变蛋白）和所述融合多肽时，所述融合多肽可能够以与所述脂质运载蛋白突变蛋白的EC50值相当的EC50值结合GPC3。[0095]在一些实施方案中，例如，当通过基本如实施例5、实施例10或实施例17中描述的表面等离子体共振SPR分析测量时，所述融合多肽可能够以至少约5nM或甚至更低，诸如约InM、约0.3nM、约100pM、约50pM或更低、约20pM或更低、或约IOpM或更低的Kd的亲和力结合GPC3〇[0096]在一些实施方案中，例如，当在基本如实施例4、实施例9、实施例13或实施例16中描述的ELISA试验中测量所述融合多肽时，本公开内容的对CDl37和GPC3两者特异的融合多肽可能够同时结合⑶137和GPC3。[0097]在一些实施方案中，例如，当在基本如实施例4、实施例9、实施例13或实施例16中描述的ELISA试验中测量所述融合多肽时，本公开内容的对CDl37和GPC3两者特异的融合多肽可以以至少约IOnM或甚至更低，诸如约8nM或更低、约5nM或更低、约2.5nM或更低、约2nM或更低或约1.5nM或更低的EC50值同时结合CDl37和GPC3。[0098]在一些实施方案中，本公开内容的对CD137和GPC3两者特异的融合多肽可能够在基本如实施例19中描述的功能性T细胞活化试验中共刺激T细胞应答。在一些实施方案中，本公开内容的融合多肽可能够在基本如实施例19中描述的功能性T细胞活化试验中，在存在T细胞的刺激的情况下诱导IL-2产生，并且甚至可以显示出在较高的涂覆浓度下趋于更强的IL-2诱导的趋势。在一些实施方案中，本公开内容的融合多肽在基本如实施例19中描述的功能性T细胞活化试验中，在不存在T细胞的抗CD3刺激的情况下不诱导IL-2产生。在进一步的一些实施方案中，本公开内容的对CD137和GPC3两者特异的融合多肽可能够在基本如实施例19中描述的功能性T细胞活化试验中，共刺激采用次最佳浓度的抗CD3和抗CD28抗体刺激的T细胞的活化。[0099]在一些实施方案中，本公开内容的对CD137和GPC3两者特异的融合多肽可能够在基本如实施例20中描述的功能性T细胞活化试验中共刺激T细胞应答。在一些实施方案中，本公开内容的融合多肽可能够在基本如实施例20中描述的功能性T细胞活化试验中诱导IL-2产生。在一些实施方案中，本公开内容的融合多肽在基本如实施例20中描述的功能性T细胞活化试验中以GPC3靶标依赖性方式共刺激T细胞活化。[0100]A.包含于所述融合多肽中的示例性免疫球蛋白[0101]在一些实施方案中，关于所述融合多肽，第一结合结构域包含全长免疫球蛋白或其对GPC3或CD137特异的抗原结合结构域。所述免疫球蛋白例如可以是IgGl、IgG2或IgG4。在进一步的实施方案中，所述免疫球蛋白是针对GPC3或CD137的单克隆抗体。GPC3结合免疫球蛋白的说明性实例是GC33CancerSci.2014Apr;105⑷：455-62。0137结合抗体的说明性实例是BMS-663513Jure-KunkeI，M.等人，美国专利7288638和PF-05082566Fisher，T.S.等人，CancTmmunolImmunother20120ct;6110:1721-1733。13·包含于所述融合多肽中的示例性GPC3特异性脂质运载蛋白突变蛋白[0102]本公开内容的一方面提供了能够以通过约InM或更低的KD量度的亲和力结合人磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3GPC3的脂质运载蛋白突变蛋白。更优选地，所述突变蛋白能够具有通过约InM或0·2nM或更低的KD量度的亲和力。[0103]在另一个实施方案中，本公开内容涉及脂质运载蛋白突变蛋白，其中所述突变蛋白在对应于hNGALSEQIDN0:2的线性多肽序列的位置36、40、41、49、52、65、68、70、72、73、77、79、81、87、96、100、103、105、106、125、127、132、134、136和或175的一个或多个位置处包含取代，优选为如本文所述的取代。[0104]在具体实施方案中，本公开内容的突变蛋白在对应于成熟hNGALSEQIDNO:2的线性多肽序列的序列位置36、40、41、49、52、65、68、70、72、73、77、79、81、87、96、100、103、105、106、125、127、132、134、136和或175的序列位置处包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20或甚至更多个如21、22、23、24、25和26个取代。[0105]在进一步的具体实施方案中，根据本公开内容的脂质运载蛋白突变蛋白包含选自SEQIDN0s:4-17的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述突变蛋白与成熟hNGALSEQIDNO:2的序列具有至少70%的同一性。优选地，所述突变蛋白在成熟hNGALSEQIDNO:2的线性多肽序列的序列位置36、40、41、49、52、65、68、70、72、73、77、79、81、87、96、100、103、105、106、125、127、132、134、136和或175处包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20或甚至更多个例如21、22、23、24、25和26个突变的氨基酸残基。[0106]在另外一些实施方案中，为了促进在真核细胞中的表达，在根据本公开内容的脂质运载蛋白突变蛋白的相应序列位置处，在成熟hNGALSEQIDN0:2的线性多肽序列的位置65处的天然N-糖基化位点Asn例如通过在位置65处的从Asn到Asp的突变而被去除。此外，优选在根据本公开内容的脂质运载蛋白突变蛋白上不存在N-糖基化位点（Asn-X-SerThr〇[0107]在其它一些实施方案中，根据公开内容的脂质运载蛋白突变蛋白在对应于成熟hNGALSEQIDN0:2的线性多肽序列的序列位置28的序列位置处不包含突变，例如，为了进一步优化稳定性。[0108]在另一个实施方案中，本公开内容的突变蛋白是GPC3的拮抗剂。[0109]如本文所使用的，本公开内容的脂质运载蛋白突变蛋白“特异性结合”靶标此处为GPC3，如果它能够区分该靶标和一个或多个参照靶标的话，因为结合特异性不是绝对的，而是相对的性质。能够例如根据Western印迹、ELISA-、RIA-、ECL-、IRMAlBi、FACS、IHC和肽扫描来确定“特异性结合”。[0110]同样，另一方面，本公开内容涉及一种hNGAL突变蛋白，其中所述突变蛋白在对应于成熟hNGALSEQIDNO:2的线性多肽序列的位置36、40、41、49、52、68、70、72、73、77、79、81、96、100、103、106、125、127、132和或134的一个或多个位置处包含取代，优选如本文所述的取代。[0111]另一方面，本公开内容涉及包含hNGAL突变蛋白的多肽，其中所述hNGAL突变蛋白在对应于成熟hNGALSEQIDN0:2的线性多肽序列的位置36、40、41、49、52、65、68、70、72、73、77、79、81、87、96、100、103、105、106、125、127、132、134、136和或175的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20或甚至更多个诸如21、22、23、24、25和26个氨基酸位置处包含取代，优选如本文所述的取代。[0112]类似地，本公开内容涉及源自具有圆柱形β折叠片超二次结构区的hNGAL的脂质运载蛋白突变蛋白，该区包含通过在一端由四个环成对地连接的八个β链，由此定义结合袋，其中所述四个环中的至少三个中的每一个的至少一个氨基酸已经突变，并且其中所述脂质运载蛋白以可检测的亲和力有效地结合作为给定非天然靶标的GPC3。有利地，所述脂质运载蛋白突变蛋白在对应于在hNGALSEQIDΝ0:1的线性多肽序列的位置36、40、41、49、52、65、68、70、72、73、77、79、81、87、96、100、103、105、106、125、127、132、134、136和或175处的氨基酸的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸位置处包含取代，优选如本文所述的取代。本公开内容还涉及编码这些蛋白的核酸。[0113]鉴于上述，本领域技术人员因此可容易地确定如本文所述在hNGAL中突变的哪个氨基酸位置对应于骨架中除了hNGAL之外的氨基酸。具体地，本领域技术人员可以将如本文所述的突变蛋白的氨基酸序列、特别是本公开内容的hNGAL突变蛋白与不同的突变蛋白的氨基酸序列进行比对，以确定所述突变蛋白的哪一个哪一些氨基酸对应于所述不同的脂质运载蛋白的氨基酸序列的各自的氨基酸。更具体地，本领域技术人员因此可以确定所述不同的脂质运载蛋白的氨基酸序列的哪一个氨基酸对应于在hNGALSEQIDNO:2的线性多肽序列的位置36、40、41、49、52、65、68、70、72、73、77、79、81、87、96、100、103、105、106、125、127、132、134、136和或175处的氨基酸。[0114]本公开内容的针对GPC3或对GPC3特异的蛋白质包括基于定义的蛋白质骨架的任何数量的特异性结合蛋白质突变蛋白。如本文所使用的，“突变蛋白”、“突变的”实体无论是蛋白质还是核酸或“突变体”是指分别与天然存在的野生型核酸或蛋白质“参照”骨架相比的一个或多个核苷酸或氨基酸的交换、缺失或插入。优选地，分别经交换、缺失或插入的核苷酸或氨基酸的数目是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或甚至更多个诸如21、22、23、24、25和26个。然而，优选本公开内容的突变蛋白仍然能够结合GPC3〇[0115]在一些优选的实施方案中，根据本公开内容的突变蛋白以约InM或更低，包括0.5nM或更低、0.3nM或更低和或0.2nM或更低的Kd结合人或小鼠GPC3。本公开内容的突变蛋白可以特异性地结合成熟、折叠生物活性形式的GPC3的一个或多个连续、不连续或构象表位。[0116]本公开内容的蛋白质例如脂质运载蛋白的突变蛋白）与所选的靶标在本例中为GPC3的结合亲和力可通过本领域技术人员已知的众多方法测量并由此确定突变蛋白-配体复合物的Kd值）。这些方法包括但不限于荧光滴定、竞争ELISA、量热法诸如等温滴定量热法ITC以及表面等离子体共振BIAcore。这样的方法在本领域中已经完全建立，其实例也在以下详细描述。[0117]本公开内容的突变蛋白的氣基酸序列可以与成熟人脂质运载蛋白2具有尚序列同一性。在本文中，本公开内容的蛋白质可以与选自SEQIDN0:2的序列的蛋白质具有至少70%、至少75%、至少80%、至少82%、至少85%、至少87%、至少90%的同一性，包括至少95%的同一性，例如选自SEQIDN0s:4-17的氨基酸序列的突变蛋白。[0118]本公开内容还包括选自SEQIDN0s:4-17的序列的蛋白质的结构同系物，所述结构同系物具有关于其的大于约60%、优选大于65%、大于70%、大于75%、大于80%、大于85%、大于90%、大于92%和最优选大于95%的氨基酸序列同源性或序列同一性。[0119]根据上述，本公开内容的突变蛋白优选起到GPC3的拮抗剂的作用。在一些实施方案中，本公开内容的突变蛋白可以通过抑制GPC3分子与其同源配体结合或以其它方式相互作用的能力来起到GPC3的拮抗剂的作用。[0120]另一方面，本公开内容包括特异性结合GPC3的人脂质运载蛋白2的突变蛋白。在这个意义上，GPC3可被认为是野生型人脂质运载蛋白2的非天然配体，其中“非天然配体”是指在生理条件下不结合人脂质运载蛋白2的化合物。通过在某些位置处以突变工程化野生型脂质运载蛋白诸如人脂质运载蛋白2,本发明人已经证明了对非天然配体的高亲和力和高特异性是可能的。一方面，至少在编码成熟人脂质运载蛋白（SEQIDN0:2的线性多肽序列的序列位置36、40、41、49、52、65、68、70、72、73、77、79、81、87、96、100、103、105、106、125、127、132、134、136和或175中任一个的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和或20个核苷酸三联体处，可通过核苷酸三联体的子集在这些位置处进行取代来进行随机诱变。[0121]此外，所述脂质运载蛋白可用于产生突变蛋白，该突变蛋白在对应于成熟人脂质运载蛋白2SEQIDN0:2的线性多肽序列的序列位置36、40、41、49、52、65、68、70、72、73、77、79、81、87、96、100、103、105、106、125、127、132、134、136和或175的序列位置中的任一个或多个，包括至少任2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个处具有突变的氨基酸残基。[0122]在序列位置36处的取代可以例如为取代Leu36—Val或Arg。在序列位置40处的取代可以例如为取代Ala40—Leu、Val或Gly。在序列位置41处的取代可以例如为取代IIe41—1^11^找、161617或41。在序列位置49处的取代可以例如为取代6111494?仰或1^11。在序列位置52处的取代可以例如为Tyr52—Arg或Trp。在序列位置68处的取代可以例如为取代Asn65—Asp。在序列位置68处的取代可以例如为取代Ser68—Val、Gly、Asn或Ala。在序列位置70处的取代可以例如为取代Leu70—Arg、Ser、Ala或Val。在序列位置72处的取代可以例如为取代Arg72—ASp、Trp、Ala或Gly。在序列位置73处的取代可以例如为取代Lys73—617^找^811、6111或36^在序列位置76处的取代可以例如为取代〇78764¥1或116。在序列位置77处的取代可以例如为取代Asp77—把8、16丨、¥1、1^11、11^或1^8。在序列位置79处的取代可以例如为取代Trp79—Lys、Ser或Thr。在序列位置81处的取代可以例如为取代Arg81—Gly。在序列位置81处的取代可以例如为取代Cys87—Ser。在序列位置96处的取代可以例如为取代Asn96—Arg、Asp、Gln或Pro。在序列位置100处的取代可以例如为取代Tyr100—Gly、Glu、Pro或Gin。在序列位置103处的取代可以例如为取代Leu103—Glu、Gln、Asn、Gly、Ser或Tyr。在序列位置106处的取代可以例如为取代Serl054Ala。在序列位置106处的取代可以例如为取代Tyr106—Asn、Ser或Thr。在序列位置125处的取代可以例如为取代Lys125—Glu。在序列位置127处的取代可以例如为取代Ser127—Arg或Tyr。在序列位置132处的取代可以例如为取代Tyr132—Trp或lie。在序列位置134处的取代可以例如为取代Lys134—Ala或Phe。在序列位置134处的取代可以例如为取代Thr136—Ile。在序列位置175处的取代可以例如为取代Cys175—Ala。需要注意的是，任何取代参照序列中的相应氨基酸的氨基酸可以被相应的保守氨基酸交换。特别地，保守取代是以下组的成员之间的替代：1丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸;2天冬氨酸和谷氨酸;3天冬酰胺和谷氨酰胺；4精氨酸和赖氨酸;5异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸；以及6苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。[0123]在一个实施方案中，本公开内容的结合GPC3的突变蛋白包含以下氨基酸替代：[0124]aLeu36^Val；Ile41^Leu；Gln49^Leu；Tyr52^Arg；Asn65^Asp；Ser68-^Val；Leu70^Ser；Arg72^Trp；Lys73^Arg；Asp77^His；Trp79^Lys；Arg81^Gly；Cys87^Ser；Asn96^Asp；Tyr100^Gly；Leu103^Gln；Tyr106^Asn；Lys125^Glu；Ser127^Arg；Tyr132^Trp；Lys134^Ala；[0125]bLeu36^Val；Ala40^Val；Ile41^Arg；Gln49^Pro；Tyr52^Arg；Asn65-^Asp；Ser68^Gly；Leu70^Ser；Lys73^Gly；Asp77^His；Trp79^Lys；Arg81^Gly；Cys87^Ser；Asn96^Asp；Tyr100^Glv；Leu103^Glu；Tyr106^Asn；Lys125^Glu；Ser127^Arg；Tyr132^Trp；Lys134^Phe；[0126]cLeu36—Val;Ala40—Gly;lie41—Met;Gln49—Leu;Tyr52—Arg;Asn65-^Asp；Leu70^Ala；Lys73^Asn；Asp77^His；Trp79^Lys；Arg81^Gly；Cys87^Ser；Asn96^Gln；Tyr100^Gly；Leu103^Glu；Tyr106^Asn；Lys125^Glu；Ser127^Arg；Tyr132^Trp；Lys134^Phe；[0127]dLeu36^Arg；Ala40^Val；Ile41^Gly；Gln49^Pro；Tyr52^Trp；Asn65-^Asp；Ser68^Asn；Leu70^Arg；Arg72^Ala；Lys73^Arg；Asp77^Leu；Trp79^Ser；Arg81^Gly；Cys87^Ser；Asn96^Gln；Tyr100^Glu；Leu103^Asn；Ser105^Ala；Tyr106^Asn；Lys125^Glu；Ser127^Tyr；Tyr132^Ile；Lys134^Phe；Thr136~Ie；[0128]eLeu36^Arg；Ala40^Val；Ile41^Gly；Gln49^Pro；Tyr52^Trp；Asn65-^Asp；Ser68^Asn；Leu70^Arg；Arg72^Ala；Lys73^Arg；Asp77^Thr；Trp79^Ser；Arg81^Gly；Cys87^Ser；Asn96^Gln；Tyr100^Glu；Leu103^Gly；Ser105^Ala；Tyr106^Asn；Lys125^Glu；Ser127^Tyr；Tyr132^Ile；Lys134^Phe；Thr136~Ie；[0129]fLeu36^Arg；Ala40^Gly；Ile41^Ala；Gln49^Pro；Tyr52^Trp；Asn65-^Asp；Ser68^Asn；Leu70^Arg；Arg72^Ala；Lys73^Arg；Asp77^Val；Trp79^Ser；Arg81^Gly；Cys87^Ser；Asn96^Pro；Tyr100^Glu；Leu103^Asn；Ser105^Ala；Tyr106^Ser；Lys125^Glu；Ser127^Tyr；Tyr132^Ile；Lys134^Phe；Thr136~Ie；[0130]gLeu36^Arg；Ala40^Val；Ile41^Ala；Gln49^Pro；Tyr52^Arg；Asn65-^Asp；Ser68^Ala；Leu70^Arg；Arg72^Ala；Lys73^Arg；Asp77^Leu；Trp79^Ser；Arg81^Gly；Cys87^Ser；Asn96^Arg；Tyr100^Glu；Leu103^Tyr；Ser105^Ala；Tyr106^Asn；Lys125^Glu；Ser127^Tyr；Tyr132^Ile；Lys134^Phe；Thr136~Ie；[0131]hLeu36^Arg；Ala40^Val；Ile41^Ala；Gln49^Pro；Tyr52^Arg；Asn65^Asp；Ser68^Asn；Leu70^Val；Arg72^Ala；Lys73^Gly；Asp77^Lys；Trp79^Ser；Arg81^Gly；Cys87^Ser；Asn96^Arg；Tyr100^Pro；Leu103^Asn；Ser105^Ala；Tyr106^Asn；Lys125^Glu；Ser127^Tyr；Tyr132^Ile；Lys134^Phe；Thr136~Ie；[0132]iLeu36^Arg；Ala40^Leu；Ile41^Gly；Gln49^Pro；Tyr52^Trp；Asn65-^Asp；Ser68^Asn；Leu70^Arg；Arg72^Ala；Lys73^Arg；Asp77^Met；Trp79^Ser；Arg81^Gly；Cys87^Ser；Asn96^Gln；Tyr100^Glu；Leu103^Ser；Ser105^Ala；Tyr106^Asn；Lys125^Glu；Ser127^Tyr；Tyr132^Ile；Lys134^Phe；[0133]jLeu36^Arg；Ala40^Val；Ile41^Gly；Gln49^Pro；Tyr52^Trp；Asn65^Asp；Ser68^Asn；Leu70^Arg；Arg72^Ala；Lys73^Gly；Cys76^Val；Asp77^Lys；Trp79^Thr；Arg81^Gly；Cys87^Ser；Asn96^Gln；Tyr100^Glu；Leu103^Asn；Ser105^Ala；Tyr106^Thr；Lys125^Glu；Ser127^Tyr；Tyr132^Ile；Lys134-^Phe；Cys175—Ala;[0134]kLeu36^Arg；Ala40^Val；Ile41^Gly；Gln49^Pro；Tyr52^Arg；Asn65^Asp；Ser68^Gly；Leu70^Arg；Arg72^Gly；Lys73^Glu；Cys76^Ile；Asp77^Lys；Trp79^Ser；Arg81^Gly；Cys87^Ser；Asn96^Gln；Tyr100^Gln；Leu103^Asp；Ser105^Ala；Tyr106^Thr；Lys125^Glu；Ser127^Tyr；Tyr132^Ile；Lys134—Phe;Thr136—Ile;Cys175—Ala;或[0135]ILeu36^Arg；Ala40^Val；Ile41^Gly；Gln49^Pro；Tyr52^Arg；Asn65-^Asp；Ser68^Gly；Leu70^Arg；Arg72^Asp；Lys73^Ser；Cys76^Val；Asp77^Thr；Trp79^Ser；Arg81^Gly；Cys87^Ser；Asn96^Gln；Tyr100^Glu；Leu103^Asn；Ser105^Ala；Tyr106^Thr；Lys125^Glu；Ser127^Tyr；Tyr132^Ile；Lys134^Phe5Thr136^Ile；Cys175^Ala〇[0136]编号优选与成熟hNGALSEQIDN0:2的线性多肽序列相关。因此，鉴于本公开内容的教导，技术人员可以容易地确定成熟hNGALSEQIDN0:2的优选参照序列中哪些氨基酸对应于上述a至⑴中所述的那些氨基酸;从而使参照序列中的所述氨基酸突变。[0137]C.包含于所述融合多肽中的示例性⑶137特异性脂质运载蛋白突变蛋白。[0138]—方面，本公开内容提供了结合CD137的人脂质运载蛋白突变蛋白及其有用应用。本公开内容还提供了制备本文所述CD137结合蛋白的方法以及包含这样的蛋白质的组合物。本公开内容的CD137结合蛋白及其组合物可以用于检测样品中CD137的方法或者在受试者中结合CD137的方法。先前并未描述这样具有与本公开内容提供的用途相关的这些特征的人脂质运载蛋白突变蛋白。[0139]本公开内容的另一个实施方案提供了能够通过结合CD137来活化CD137的下游信号传导通路的脂质运载蛋白突变蛋白。[0140]在一个实施方案中，本公开内容提供了结合CD137的人泪脂蛋白突变蛋白。[0141]在这方面，本公开内容提供了一种或多种能够以通过约300nM或更低、甚至约IOOnM或更低的Kd量度的亲和力结合CD137的Tlc突变蛋白。[0142]在一些实施方案中，这样的Tlc突变蛋白在对应于成熟人泪脂质运载蛋白（SEQIDN0:1的线性多肽序列的位置5、26-31、33-34、42、46、52、56、58、60-61、65、71、85、94、101、104-106、108、111、114、121、133、148、150和153的一个或多个位置处包含突变的氨基酸残基。[0143]在一些具体实施方案中，这样的Tlc突变蛋白可以在对应于成熟人泪脂质运载蛋白的线性多肽序列的位置26-34、55-58、60-61、65、104-106和108的一个或多个位置处含有突变的氨基酸残基。[0M4]在进一步的具体实施方案中，这样的Tlc突变蛋白还可以在对应于成熟人泪脂质运载蛋白的线性多肽序列的位置101、111、114和153的一个或多个位置处包含突变的氨基酸残基。[0145]在其他具体实施方案中，这种Tlc突变蛋白可以在对应于成熟人泪脂质运载蛋白的线性多肽序列的位置5、26-31、33-34、42、46、52、56、58、60-61、65、71、85、94、101、104-106、108、111、114、121、133、148、150和153的一个或多个位置处含有突变的氨基酸残基。[0146]在一些进一步的实施方案中，这种Tlc突变蛋白可以在对应于成熟人泪脂质运载蛋白的线性多肽序列的序列位置5、26-31、33-34、42、46、52、56、58、60-61、65、71、85、94、101、104-106、108、111、114、121、133、148、150和153的一个或多个序列位置处包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或甚至更多个突变的氨基酸残基，并且其中所述多肽结合CDl37,特别是人CDl37。[0147]在一些更进一步的实施方案中，本公开内容涉及多肽，其中所述多肽为Tlc突变蛋白，与成熟人泪脂质运载蛋白的线性多肽序列相比较，其在序列位置5、26-34、55-58、60-61、65、104-106和108处包含至少l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、ll、12或更多个突变的氨基酸残基，并且其中所述多肽结合⑶137,特别是人⑶137。[0148]在一些实施方案中，根据本公开内容的脂质运载蛋白突变蛋白可以包含天然半胱氨酸残基被例如丝氨酸残基的至少一个氨基酸取代。在一些实施方案中，根据本公开内容的Tlc突变蛋白包含在位置61和或153处的天然半胱氨酸残基被另一个氨基酸例如丝氨酸残基的氨基酸取代。这方面注意到的是，已经发现去除野生型泪脂质运载蛋白的由半胱氨酸残基61和153形成的结构二硫键在各自的初始核酸文库的水平上）（参见Breustedt等人，2005,见上文）可以提供这样的泪脂质运载蛋白突变蛋白：该泪脂质运载蛋白突变蛋白不仅稳定地折叠，而且能够以高亲和力结合给定非天然配体。在一些具体实施方案中，根据本公开内容的Tlc突变蛋白包含氨基酸取代Cys61—Ala、Phe、Lys、Arg、Thr、Asn、Gly、Gln、Asp、AsruLeu、Tyr、Met、Ser、Pro或Trp和Cys153—Ser或Ala。已经证明这样的取代可用于防止连接Cys61和Cys153的天然存在的二硫键的形成，从而有助于处理突变蛋白。然而，结合⑶137并且具有在Cys61和Cys153之间形成的二硫键的泪脂质运载蛋白突变蛋白也是本公开内容的一部分。[0149]在一些实施方案中，消除结构性二硫键可提供进一步的优点，即允许非天然人造二硫键（自发生成或有意引入到本公开内容的突变蛋白中，由此增加突变蛋白的稳定性。例如，在一些实施方案中，在位置61、101和153处的半胱氨酸密码子中的任两个或全部三个被另一个氨基酸的密码子替代。此外，在一些实施方案中，根据本公开内容的Tlc突变蛋白包含在位置101处的天然半胱氨酸残基被丝氨酸残基或组氨酸残基的氨基酸取代。[0150]在一些实施方案中，根据本公开内容的突变蛋白包含在关于成熟人泪脂质运载蛋白的氨基酸序列的位置28或105处的天然氨基酸被半胱氨酸残基的氨基酸取代。[0151]此外，在一些实施方案中，根据本公开内容的突变蛋白包含在位置111处的天然精氨酸残基被脯氨酸残基的氨基酸取代。此外，在一些实施方案中，根据本公开内容的突变蛋白包含在位置114处的天然赖氨酸残基被色氨酸残基或谷氨酸的氨基酸取代。[0152]在一些实施方案中，根据本公开内容的结合CD137的Tlc突变蛋白在对应于成熟人泪脂质运载蛋白（SEQIDN0:1的线性多肽序列的位置5、26-31、33-34、42、46、52、56、58、60-61、65、71、85、94、101、104-106、108、111、114、121、133、148、150和153的一个或多个位置处包含以下突变的氨基酸残基中的一个或多个:Ala5—Val或Thr;Arg26—Glu;Glu27^Gly；Phe28^Cys；Pro29^Arg；Glu30^Pro；Met31^Trp；Leu33^Ile；Glu34^Phe；Thr42^Ser；Gly46^Asp；Lys52^Glu；Leu56^Ala；Ser58^Asp；Arg60^Pro；Cys61—Ala;Lys65—Arg或Asn;Thr71—Ala;Val85—Asp;Lys94—Arg或Glu;Cys101^Ser；Glu104^Val；Leu105^Cys；His106^Asp；Lys108^Ser；Arglll^Pro；Lys114—Trp;Lys121—Glu;Ala133—Thr;Arg148—Ser;Serl50—Ile和Cys153—Ser。在一些实施方案中，根据本公开内容的Tie突变蛋白在成熟人泪脂质运载蛋白的这些序列位置处包含两个或更多个诸如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、甚至更多个诸如13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26个或所有突变的氨基酸残基。[0153]在另外一些实施方案中，与成熟人泪脂质运载蛋白的线性多肽序列相比较，结合⑶137的Tlc突变蛋白包含以下氨基酸取代组之一：[0154]I.Arg26^Glu；Glu27^Gly；Phe28^Cys；Pro29^Arg；Glu30^Pro；Met31^Trp；Leu33^Ile；Glu34^Phe；Leu56^Ala；Ser58^Asp；Arg60^Pro；Cys61^Ala；Cys101^Ser；Glu104^Val；Leu105^Cys；His106^Asp；Lys108^Ser；Arg111-^Pro；LysIH^Trp；Cys153—Ser;[0155]2.Ala5^Thr；Arg26^Glu；Glu27^Gly；Phe28^Cys；Pro29^Arg；Glu30^Pro；Met31^Trp；Leu33^Ile；Glu34^Phe；Leu56^Ala；Ser58^Asp；Arg60^Pro；Cys61^Ala；Lys65^Arg；Val85^Asp；Cys101^Ser；Glu104^Val；Leu105^Cys；His106^Asp；Lys108^Ser；Arglll^Pro；Lys114^Trp；Lys121^Glu；Ala133^Thr；Cys153—Ser;157—Pro;[0156]3.Arg26^Glu；Glu27^Gly；Phe28^Cys；Pro29^Arg；Glu30^Pro；Met31^Trp；Leu33^Ile；Glu34^Phe；Leu56^Ala；Ser58^Asp；Arg60^Pro；Cys61^Ala；Lys65^Asn；Lys94^Arg；Cys101^Ser；Glu104^Val；Leu105^Cys；His106^Asp；Lys108^Ser；Arg11I^Pro；Lys114^Trp；Lys12I^Glu；Ala133^Thr；Cys153^Ser；[0157]4.Ala5^Val；Arg26^Glu；Glu27^Gly；Phe28^Cys；Pro29^Arg；Glu30^Pro；Met31^Trp；Leu33^Ile；Glu34^Phe；Leu56^Ala；Ser58^Asp；Arg60^Pro；Cys61^Ala；Lys65^Arg；Lys94^Glu；Cys101^Ser；Glu104^Val；Leu105^Cys；His106^Asp；Lys108^Ser；Arglll^Pro；Lys114^Trp；Lys121^Glu；Ala133^Thr；Cys153—Ser;157—Pro;[0158]5.Arg26^Glu；Glu27^Gly；Phe28^Cys；Pro29^Arg；Glu30^Pro；Met31^Trp；Leu33^Ile；Glu34^Phe；Thr42^Ser；Leu56^Ala；Ser58^Asp；Arg60^Pro；Cys61^Ala；Cys101^Ser；Glu104^Val；Leu105^Cys；His106^Asp；Lys108^Ser；Arg11I^Pro；Lys114^Trp；Ser150^Ile；Cys153—Ser;157—Pro;[0159]6.Arg26^Glu；Glu27^Gly；Phe28^Cys；Pro29^Arg；Glu30^Pro；Met31^Trp；Leu33^Ile；Glu34^Phe；Lys52^Glu；Leu56^Ala；Ser58^Asp；Arg60^Pro；Cys6WAla；Thr7WAla；Cys10WSer；Glu104^Val；Leu105^Cys；His106^Asp；Lys108^Ser；Arglll^Pro；Lys114^Trp；Ala133^Thr；Arg148^Ser；Ser150—Ile;Cys153—Ser;157—Pro;或[0160]7.Ala5^Thr；Arg26^Glu；Glu27^Gly；Phe28^Cys；Pro29^Arg；Glu30^Pro；Met31^Trp；Leu33^Ile；Glu34^Phe；Gly46^Asp；Leu56^Ala；Ser58^Asp；Arg60^Pro；Cys61^Ala；Thr71^Ala；Cys101^Ser；Glu104^Val；Leu105^Cys；His106^Asp；Lys108^Ser；Arglll^Pro；Lys114^Trp；Ser150^Ile；Cys153^Ser；157^Pro〇[0161]在剩余区域中，即不同于序列位置5、26-31、33-34、42、46、52、56、58、60-61、65、71、85、94、101、104-106、108、111、114、121、133、148、150和153的区域，本公开内容的He突变蛋白可以在突变的氨基酸序列位置之外包含野生型天然氨基酸序列。[0162]在更进一步的实施方案中，根据本公开内容的Tlc突变蛋白与成熟人泪脂质运载蛋白（SEQIDN0:1的序列具有至少70%的序列同一性或至少70%的序列同源性。[0163]根据本公开内容的Hc突变蛋白可以通过诱变人泪脂质运载蛋白的天然存在形式而获得。在诱变的一些实施方案中，取代或替代是保守取代。不过，可以设想任何取代包括非保守取代或来自以下示例性取代中的一个或多个），只要脂质运载蛋白突变蛋白保留其结合CD137的能力，和或其与然后被取代的序列具有序列同一性，即所述序列同一性为与成熟人泪脂质运载蛋白（SWISS-PROT数据库登录号P31025的氨基酸序列至少60%诸如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%或更高的序列同一性即可。[0164]另一方面，本公开内容涉及针对⑶137或对⑶137特异的新型特异性结合的hNGAL关变蛋白。[0165]在这方面，本公开内容提供了一种或多种能够以通过200nM或更低、约HOnM或更低、约50nM或更低和甚至约IOnM或更低的KD量度的亲和力结合CD137的hNGAL突变蛋白。更优选地，所述hNGAL突变蛋白可以具有通过约5nM或更低的KD量度的亲和力。[0166]在一些实施方案中，本公开内容的hNGAL突变蛋白在对应于成熟hNGALSEQIDN0:2的线性多肽序列的位置28、36、40-41、49、52、65、68、70、72-73、77、79、81、83、87、94、96、100、103、106、125、127、132和134的一个或多个位置处包含取代。[0167]在具体实施方案中，本公开内容的脂质运载蛋白突变蛋白在对应于成熟hNGALSWISS-PR0T数据库登录号P80188;SEQIDN0:2的线性多肽序列的序列位置28、36、40_41、49、52、65、68、70、72-73、77、79、81、83、87、94、96、100、103、106、125、127、132和134的序列位置处包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或甚至更多个取代。优选地，设想本公开内容涉及脂质运载蛋白突变蛋白，其（除了在对应于成熟人NGAL的线性多肽序列的位置36、87和或96的位置处的一个或多个取代）在对应于成熟hNGAL的线性多肽序列的位置28、40-41、49、52、65、68、70、72-73、77、79、81、83、94、100、103、106、125、127、132和134的一个或多个位置处包含取代。[0168]在更进一步的实施方案中，本公开内容涉及多肽，其中所述多肽为hNGAL突变蛋白，与成熟hNGALSWISS-PROT数据库登录号P80188;SEQIDN0:2的线性多肽序列相比较，其在序列位置28、36、40-41、49、52、65、68、70、72-73、77、79、81、87、96、100、103、106、125、127、132和134处包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或甚至更多个突变的氨基酸残基，并且其中所述多肽结合CDl37,特别是人CDl37。[0169]在一些实施方案中，本公开内容的结合CD137的hNGAL突变蛋白在成熟hNGALSEQIDN0:2的线性多肽序列的序列位置28、36、40-41、49、52、65、68、70、72-73、77、79、81、83、87、94、96、100、103、106、125、127、132和134中的任一个或多个处包含以下突变的氨基酸残基中的一个或多个:Gln28—His;Leu36—Gln;Ala40—Ile;Ile41—Arg或Lys;Gln49—Val，Ile，His，Se;rSAsn;Tyr524Met;Asn654Asp;Ser684Met，AlaSGly;Leu7〇4Ala,Lys,SergJcThr；Arg72^Asp；Lys73^Asp；Asp77—Met，Arg，Thr或Asn;Trp79^Ala或Asp;Arg81—Met，Trp或Ser;Phe83—Leu;Cys87—Ser;Leu94—Phe;Asn96—Lys;Tyr100^Phe；Leu103^His；Tyr106^Ser；Lys125^Phe；Ser127^Phe；Tyr132^Glu和Lys134—Tyr。[0170]在一些实施方案中，本公开内容的hNGAL突变蛋白在成熟hNGAL的这些序列位置处包含两个或更多个诸如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、甚至更多个诸如13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24个或全部突变的氨基酸残基。[0171]在另外一些实施方案中，本公开内容的结合CD137的hNGAL突变蛋白与所述成熟hNGAL的线性多肽序列相比较，包含以下氨基酸替代：[0172]aGln28^His；Leu36^Gln；Ala40^Ile；Ile41^Lys；Gln49^Asn；Tyr52^Met；Ser68^Gly；Leu70^Thr；Arg72^Asp；Lys73^Asp；Asp77^Thr；Trp79^Ala；Arg81^Ser；Cys87^Ser；Asn96^Lys；Tyr100^Phe；Leu103^His；Tyr106^Ser；Lys125^Phe；Ser127^Phe；Tyr132^Glu；Lys134^Tyr；[0173]bGln28^His；Leu36^Gln；Ala40^Ile；Ile4WArg；Gln49^Ile；Tyr52^Met；Asn65^Asp；Ser68^Met；Leu70^Lys；Arg72^Asp；Lys73^Asp；Asp77^Met；Trp79^Asp；Arg81^Trp；Cys87^Ser；Asn96^Lys；Tyr100^Phe；Leu103^His；Tyr106^Ser；Lys125^Phe；Ser127^Phe；Tyr132^Glu；Lys134^Tyr；[0174]cGln28^His；Leu36^Gln；Ala40^Ile；Ile41^Arg；Gln49^Asn；Tyr52^Met；Asn65^Asp；Ser68^Ala；Leu70^Ala；Arg72^Asp；Lys73^Asp；Asp77^Thr；Trp79^Asp；Arg81^Trp；Cys87^Ser；Asn96^Lys；Tyr100^Phe；Leu103^His；Tyr106^Ser；Lys125^Phe；Ser127^Phe；Tyr132^Glu；Lys134^Tyr；[0175]dGln28^His；Leu36^Gln；Ala40^Ile；Ile41^Lys；Gln49^Asn；Tyr52^Met；Asn65^Asp；Ser68^Ala；Leu70^Ala；Arg72^Asp；Lys73^Asp；Asp77^Thr；Trp79^Asp；Arg81^Trp；Cys87^Ser；Asn96^Lys；TyrlOO^Phe；Leu103^His；Tyr106^Ser；Lys125^Phe；Ser127^Phe；Tyr132^Glu；Lys134^Tyr；[0176]eGln28^His；Leu36^Gln；Ala40^Ile；Ile41^Lys；Gln49^Ser；Tyr52^Met；Asn65^Asp；Ser68^Gly；Leu70^Ser；Arg72^Asp；Lys73^Asp；Asp77^Thr；Trp79^Ala；Arg81^Met；Cys87^Ser；Asn96^Lys；Tyr100^Phe；Leu103^His；Tyr106^Ser；Lys125^Phe；Ser127^Phe；Tyr132^Glu；Lys134^Tyr；[0177]fGln28^His；Leu36^Gln；Ala40^Ile；Ile4WLys；Gln49^Val；Tyr52-^Met；Asn65^Asp；Ser68^Gly；Leu70^Thr；Arg72^Asp；Lys73^Asp；Asp77^Arg；Trp79^Asp；Arg81^Ser；Cys87^Ser；Leu94^Phe；Asn96^Lys；TyrlOO^Phe；Leu103^His；Tyr106^Ser；Lys125^Phe；Ser127^Phe；Tyr132^Glu；Lys134^Tyr；[0178]gGln28^His；Leu36^Gln；Ala40^Ile；Ile4WArg；Gln49^His；Tyr52-^Met；Asn65^Asp；Ser68^Gly；Leu70^Thr；Arg72^Asp；Lys73^Asp；Asp77^Thr；Trp79^Ala；Arg81^Ser；Cys87^Ser；Asn96^Lys；Tyr100^Phe；Leu103^His；Tyr106^Ser；Lys125^Phe；Ser127^Phe；Tyr132^Glu；Lys134^Tyr；[0179]hGln28^His；Leu36^Gln；Ala40^Ile；Ile41^Lys；Gln49^Asn；Tyr52-^Met；Asn65^Asp；Ser68^Gly；Leu70^Thr；Arg72^Asp；Lys73^Asp；Asp77^Thr；Trp79^Ala；Arg81^Ser；Phe83^Leu；Cys87^Ser；Leu94^Phe；Asn96^Lys；Tyr100^Phe；Leu103^His；Tyr106^Ser；Lys125^Phe；Ser127^Phe；Tyr132^Glu;Lys134—Tyr;或[0180]iGln28^His；Leu36^Gln；Ala40^Ile；Ile4WArg；Gln49^Ser；Tyr52^Met；Asn65^Asp；Ser68^Ala；Leu70^Thr；Arg72^Asp；Lys73^Asp；Asp77^Asn；Trp79^Ala；Arg81^Ser；Cys87^Ser；Asn96^Lys；Tyr100^Phe；Leu103^His；Tyr106^Ser；Lys125^Phe；Ser127^Phe；Tyr132^Glu；Lys134^Tyr〇[0181]在剩余区域中，即不同于序列位置28、36、40-41、49、52、65、68、70、72-73、77、79、81、83、87、94、96、100、103、106、125、127、132和134的区域，本公开内容的11如厶1^突变蛋白可以在突变的氨基酸序列位置之外包含野生型天然氨基酸序列。[0182]在另一个实施方案中，所述hNGAL突变蛋白与成熟人脂质运载蛋白2的氨基酸序列SWISS-PR0T数据库登录号P80188具有至少70%或更高的序列同一性。[0183]在进一步的具体实施方案中，根据本公开内容的结合CD137的脂质运载蛋白突变蛋白包含选自SEQIDNOs:18-33的氨基酸序列或其片段或变体。[0184]本公开内容的结合CD137的脂质运载蛋白突变蛋白的氨基酸序列与选自SEQIDNOs:18-33的序列可以具有高序列同一性，诸如至少70%、至少75%、至少80%、至少82%、至少85%、至少87%、至少90%的同一性，包括至少95%的同一性。[0185]本公开内容还包括具有选自SEQIDN0s:18-33的氨基酸序列的脂质运载蛋白突变蛋白的结构同系物，所述结构同系物关于所述突变蛋白具有超过约60%、优选超过65%、超过70%、超过75%、超过80%、超过85%、超过90%、超过92%和最优选超过95%的氨基酸序列同源性或序列同一性。[0186]D.所述融合多肽的示例性用途、应用和生产[0187]在一些实施方案中，本公开内容的融合多肽可以经由双重靶向⑶137和GPC3产生协同效应。[0188]因此，在医学中存在本公开内容的融合多肽的许多可能的应用。[0189]—方面，本公开内容涉及本文所公开的融合多肽用于检测样品中CD137和GPC3的用途以及相应的诊断方法。[0190]另一方面，本公开内容以本文所公开的一种或多种融合多肽用于同时结合CD137和GPC3的用途为特征，或者以一种或多种包含这样的多肽的组合物用于同时结合CD137和GPC3的用途为特征。[0191]本公开内容还涉及一种或多种所述融合多肽用于与CD137和GPC3形成复合物的用途。[0192]因此，在本公开内容的更进一步的方面，所公开的一种或多种融合多肽用于CD137和GPC3的检测。这样的用途可以包括以下步骤:在合适的条件下使一种或多种所述融合多肽与怀疑含有CD137和GPC3的样品接触的步骤，由此允许在融合多肽与CD137和GPC3之间形成复合物；和通过合适的信号检测所述复合物。该可检测的信号可由如上所述的标记或者由于结合本身即复合物形成导致的物理性质的变化所引起。一个实例是表面等离子体共振，表面等离子体共振的值在结合配偶体其中之一固定在例如金箱的表面上的结合期间发生变化。[0193]本文所公开的融合多肽还可用于⑶137和GPC3的分离。这样的用途可以包括以下步骤:在合适的条件下使一种或多种所述融合多肽与料想含有CD137和GPC3的样品接触，由此允许在融合多肽与CD137和GPC3之间形成复合物;和将该复合物从所述样品中分离。[0194]另一方面，本公开内容以包括根据本公开内容的融合多肽的诊断或分析试剂盒为特征。[0195]除了它们在诊断中使用之外，另一方面，本公开内容预期一种包含本公开内容的融合多肽和药学可接受的赋形剂的药物组合物。[0196]此外，本公开内容提供同时结合CD137和GPC3的用作抗癌剂和免疫调节剂的融合多肽。因此，设想本公开内容的融合多肽用于治疗或预防人疾病的方法中，所述疾病例如多种肿瘤，包括肝细胞癌（“HCC”）、黑素瘤、Merkel细胞癌、WiIm’s肿瘤和肝母细胞瘤。因此，还提供了在有此需要的受试者中治疗或预防人疾病（如各种肿瘤，包括肝细胞癌（“HCC”）、黑素瘤、Merkel细胞癌、WiIm’s肿瘤和肝母细胞瘤）的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的本公开内容的一种或多种融合多肽。[0197]通过同时靶向在该处表达GPC3的肿瘤细胞（诸如肝细胞癌（“HCC”）、黑素瘤、Merkel细胞癌、Wilm’s肿瘤和肝母细胞瘤并且活化宿主先天免疫系统中与这样的肿瘤细胞相邻的天然杀伤NK细胞或适应性免疫系统的T细胞，本公开内容的融合多肽可以增加靶向的抗肿瘤淋巴细胞的活性，增强抗肿瘤免疫力，同时对肿瘤生长具有直接的抑制作用，由此产生协同的抗肿瘤结果。此外，通过局部抑制致癌基因的活性，并且诱导通过NK细胞和或T细胞的细胞介导的细胞毒性，本公开内容的融合多肽可以减少效应淋巴细胞对健康细胞的副作用，即减少脱靶毒性。[0198]在T细胞中CD137介导的信号传导引起TRAF家族成员的募集和几种激酶的活化，所述激酶包括六31-1、111、1^?13^^14、？38和见134?1。激酶活化之后为几种转录因子的活化和核移位，所述转录因子包括ATF-2、Jun和NF-κΒ。除了增加次优TCR诱导的增殖，⑶137介导的信号传导保护T细胞、特别是CD8+T细胞免于活化诱导的细胞死亡AICD。[0199]本公开内容涵盖本公开内容的融合多肽或包含这样的融合多肽的组合物用于当接合表达GPC3的肿瘤细胞时共刺激T细胞和或活化CD137的下游信号传导通路的用途，所述肿瘤细胞诸如肝细胞癌（“HCC”）、黑素瘤、Merkel细胞癌、Wilm’s肿瘤和肝母细胞瘤。[0200]本公开内容还以当接合在该处表达GPC3的肿瘤细胞时共刺激T细胞和或活化CD137的下游信号传导通路的方法为特征，所述肿瘤细胞诸如肝细胞癌（“HCC”）、黑素瘤、Merkel细胞癌、WiIm’s肿瘤和肝母细胞瘤，所述方法包括应用本公开内容的一种或多种融合多肽或包含这样的融合多肽的一种或多种组合物。[0201]此外，本公开内容涉及当接合在该处表达GPC3的肿瘤细胞时活化CD137的下游信号传导通路的方法，所述肿瘤细胞诸如肝细胞癌（“HCC”）、黑素瘤、Merkel细胞癌、WiIm’s月中瘤和肝母细胞瘤，所述方法包括应用本公开内容的一种或多种融合多肽或包含这样的融合多肽的一种或多种组合物。[0202]本公开内容还预期当接合在该处表达GPC3的肿瘤细胞时诱导T淋巴细胞增殖的方法，所述肿瘤细胞诸如肝细胞癌（“HCC”）、黑素瘤、Merkel细胞癌、Wilm’s肿瘤和肝母细胞瘤，所述方法包括应用本公开内容的一种或多种融合多肽或包含这样的融合多肽的一种或多种组合物。[0203]本公开内容涵盖本公开内容的融合多肽或包含这样的融合多肽的组合物用于将T细胞上的CD137聚集和活化导向至在该处表达GPC3的肿瘤细胞的用途，所述肿瘤细胞诸如肝细胞癌（“HCC”）、黑素瘤、Merkel细胞癌、WiIm’s肿瘤和肝母细胞瘤。[0204]在另一个实施方案中，本公开内容还涉及包含编码本文所公开的融合多肽的核苷酸序列的核酸分子DNA和RNA。在另外一个实施方案中，本公开内容涵盖含有所述核酸分子的宿主细胞。由于遗传密码的简并性允许某些密码子被指定同一氨基酸的其他密码子取代，本公开内容不限于编码如本文所述融合多肽的特定核酸分子，而是涵盖包含编码功能性多肽的核苷酸序列的所有核酸分子。在这方面，本公开内容还涉及编码本公开内容的融合多肽的核苷酸序列。[0205]在一些实施方案中，编码本申请中所公开的脂质运载蛋白突变蛋白的核酸分子例如DNA可以与编码本公开内容的免疫球蛋白的另一个核酸分子“可操作地连接”，以允许表达本文所公开的融合多肽。在这方面，可操作的连接是这样的连接:在所述连接中，一个核酸分子的序列元件和另一个核酸分子的序列元件以使融合多肽能够表达为单个多肽的方式连接。[0206]本公开内容还涉及用于生产本公开内容的融合多肽的方法，通过基因工程方法从编码多肽或其中任何亚基的核酸开始生产本公开内容的融合多肽。在一些实施方案中，该方法可以在体内进行，所述多肽可以例如在细菌或真核宿主生物体中产生，然后从该宿主生物或其培养物中分离。也可以在体外产生本公开内容的融合多肽，例如通过使用体外翻译系统。[0207]当在体内产生所述融合多肽时，通过重组DNA技术（如上所述将编码这样的多肽的核酸引入到合适的细菌或真核宿主生物体中。为此目的，使用已建立的标准方法，首先用包含编码如本文所述融合多肽的核酸分子的克隆载体转化所述宿主细胞。然后在允许表达异源DNA并且因此合成相应的多肽的条件下培养宿主细胞。随后，从细胞或培养基中回收所述多肽。[0208]在本公开内容的一个实施方案中，该方法包括使至少一个编码hNGAL的核酸分子在核苷酸三联体处经受诱变，该核苷酸三联体编码对应于hNGALSEQIDNO:2的线性多肽序列的序列位置28、40-52、60、68、65、70、71-81、87、89、96、98、100-106、114、118、120、125-137和145的序列位置中的至少一个、有时甚至更多个。[0209]此外，在一些实施方案中，可以在本公开内容的hNGAL突变蛋白中去除在Cys76和Cys175之间的天然存在的二硫键。因此，这样的突变蛋白可在具有减少的氧化还原环境redoxmilieu的细胞区室中产生，例如在革兰氏阴性细菌的细胞质中。[0210]本公开内容还包括编码本公开内容的脂质运载蛋白突变蛋白的核酸分子，其在实验性诱变的指定序列位置之外包含另外的突变。这样的突变通常是可容忍的或甚至被证明是有利的，例如，如果它们有助于提高脂质运载蛋白突变蛋白的折叠效率、血清稳定性、热稳定性或配体结合亲和力。[0211]本申请中所公开的核酸分子可以“可操作地连接”至调节序列（或多个调节序列）以允许表达该核酸分子。[0212]核酸分子，例如DNA，如果它包含含有关于转录和或翻译调节的信息的序列元件，并且这样的序列“可操作地连接”至编码所述多肽的核苷酸序列，则被称为“能够表达核酸分子”或能够“允许表达核苷酸序列”。可操作的连接是这样的连接:在所述连接中，调节序列元件和要表达的序列以能够进行基因表达的方式连接。基因表达所必需的调节区域的确切性质可能因物种而异，但是通常这些区域包括启动子，所述启动子在原核生物中含有启动子本身（即引导转录起始的DNA元件）以及当转录成RNA时将发出翻译起始信号的DNA元件。这样的启动子区域通常包括涉及转录和翻译起始的5'非编码序列，例如原核生物中的-35-10盒和Shine-Dalgarno元件或真核生物中的TATA盒、CAAT序列和5c封端元件。这些区域还可以包括增强子或阻遏子元件以及用于将天然多肽靶向到宿主细胞的特定区室的被翻译信号和前导序列。[0213]此外，所述3'非编码序列可能含有涉及转录终止、聚腺苷酸化等的调节元件。然而，如果这些终止序列在特定宿主细胞中不是令人满意的功能性的，则它们可能被该细胞中功能性的信号取代。[0214]因此，本公开内容的核酸分子可以包含调节序列例如启动子序列。在一些实施方案中，本公开内容的核酸分子包含启动子序列和转录终止序列。合适的原核启动子例如为tet启动子、lacUV5启动子或T7启动子。可用于在真核细胞中表达的启动子的实例是SV40启动子或CMV启动子。[0215]本公开内容的核酸分子还可以是载体或任何其他种类的克隆载体的一部分，所述克隆载体例如质粒、噬菌粒、噬菌体、杆状病毒、粘粒或人造染色体。[0216]在一个实施方案中，核酸分子包含在菌粒中。菌粒载体表不编码温和菌体例如M13或Π的基因间区域的载体，或其融合至感兴趣的cDNA的功能部分。细菌宿主细胞经这样的噬菌粒载体和适当的辅助噬菌体例如M13K07、VCS-M13或R408超感染后，产生完整噬菌体颗粒，由此使所编码的异源cDNA能够与其相应的展示在噬菌体表面上的多肽物理偶联（参见例如Lowman，H.B·1997Annu·Rev·Biophys·Biomol·Struct·26，401-424;或Rodi，D.J.和Makowski，L.1999Curr.Opin.Biotechnol.lO,87-93〇[0217]除了上述调节序列以及编码如本文所述的融合多肽的核酸序列之外，这样的克隆载体可以包含来源于与用于表达的宿主细胞相容的物种的复制和控制序列，以及在转化或转染的细胞上赋予可选表型的选择标记物。大量的合适的克隆载体是本领域已知的，并且是可商购的。[0218]编码如本文所述的融合多肽的DNA分子例如，SEQIDN0s:20和31，特别是含有这样的多肽的编码序列的克隆载体可转化到能够表达该基因的宿主细胞中。可使用标准技术进行转化。因此，本公开内容还涉及含有如本文所述的核酸分子的宿主细胞。[0219]所述转化的宿主细胞在适用于表达编码本公开内容的融合多肽的核苷酸序列的条件下培养。合适的宿主细胞能够是原核的诸如大肠杆菌E.coli或枯草芽孢杆菌，或真核的诸如酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母、SF9或High5昆虫细胞、永生化哺乳动物细胞系（例如HeLa细胞或CHO细胞或原代哺乳动物细胞。[0220]在一些实施方案其中本公开内容的脂质运载蛋白突变蛋白（包括包含在本文所公开的融合多肽中的包括分子内二硫键）中，可以优选使用适当的信号序列将新生多肽引导至具有氧化还原环境的细胞区室。这样的氧化环境可以由革兰氏阴性细菌诸如大肠杆菌的周质，在革兰氏阳性细菌的细胞外环境中，或在真核细胞的内质网的内腔中提供，通常有利于结构二硫键的形成。[0221]在一些实施方案中，还可以在宿主细胞优选大肠杆菌的胞质溶胶中产生本公开内容的融合多肽。在这种情况下，所述多肽能够以可溶性的和折叠的状态直接获得，或者以包涵体的形式被回收，然后在体外复性。另一个选择是使用特定宿主菌株，所述菌株具有氧化细胞内环境，这因此可允许在胞质溶胶中形成二硫键（Venturi等人（2002J.Mol.Biol.315,卜8。[0222]在一些实施方案中，如本文所述的本公开内容的融合多肽可能不一定是通过使用遗传工程生成或产生的。而是，这样的多肽还能通过化学合成诸如Merrifield固相多肽合成或通过体外转录和翻译获得。例如有可能的是，使用分子建模鉴定出有前途的突变，然后在体外合成所需设计的）突变蛋白或多肽，并且研究对感兴趣的靶标的结合活性。用于蛋白质的固相和或溶液相合成的方法是本领域熟知的（参见例如Bruckdorfer，T.等人2004Curr.Pharm.Biotechnol·5,29-43〇[0223]在另一个实施方案中，本公开内容的融合多肽可以通过使用本领域技术人员已知的已充分建立的方法的体外转录翻译产生。[0224]本领域技术人员将领会可用于制备本公开内容所预期的、但其蛋白质或核酸序列未在本文中明确公开的融合多肽的方法。作为概述，氨基酸序列的这种修饰包括例如单个氨基酸位置的定向诱变，以便通过引入某些限制酶的切割位点来简化多肽基因或其部分的亚克隆。此外，还能够引入这些突变以进一步提高融合多肽对其靶标例如⑶137和GPC3的亲和力。此外，能够引入突变以调节所述多肽的某些特征，例如如果需要，以改善折叠稳定性、血清稳定性、蛋白质抗性或水溶性或降低聚集倾向。例如，天然存在的半胱氨酸残基可以突变成其它氨基酸以防止二硫键的形成。[0225]对于本领域技术人员来说，在审查以下实施例及其附图后，本公开内容的另外的目标、优点和特征将变得显而易见，而这些实施例和附图并不旨在是限制性的。因此应该理解的是，尽管通过示例性实施方案和可选特征具体公开了本公开内容，本领域技术人员可以对本文公开的在其中实施的公开内容进行修改和改变，并且这样的修改和改变被认为是在本公开内容的范围内。[0226]实施例[0227]实施例1:抗体-脂质运载蛋白突变蛋白融合多肽的表达与分析[0228]我们使用三种方案来生成能够同时结合靶标GPC3和CD137的双特异性构建体。[0229]在第一种方案中，我们基于⑶137特异性抗体例如具有由SEQIDN0s:34和35提供的重链和轻链和例如SEQIDNO:10的GPC3脂质运载蛋白突变蛋白生成抗体-脂质运载蛋白突变蛋白融合多肽。在所有情况下，使用非结构化的对蛋白酶不敏感的G4S3连接子SEQIDN0:49使所述蛋白质彼此融合。所设计的不同形式如图IA所示。所产生的变体是脂质运载蛋白突变蛋白与抗体的四个末端中的任一个的融合物，所述抗体包含被突变以最小化半抗体交换的IgG4主链（S228P突变，参见SEQIDN0:34:SEQIDN0s:36和37，SEQIDNOs:38和39,SEQIDNOs:40和41，SEQIDNOs:42和43。[0230]在第二种方案中，我们生成了两种脂质运载蛋白突变蛋白（结合GPC3的SEQIDN0:10和结合CD137的SEQIDN0:26与工程化的IgG4-Fc片段（SEQIDN0:73的融合物，所述IgG4-Fc片段包含S228P突变以在体外和体内最小化IgG4半抗体交换（参见Silva2015以及包含F234A和L235A突变以降低Fc-γ受体相互作用Alegre1992。所得到的融合多肽SEQIDNO:44和SEQIDNO:45如图IB的结构性描述所示。[0231]第一种和第二种方案的构建体通过基因合成而产生并被克隆到哺乳动物表达载体中。然后将它们在CHO细胞中瞬时表达。细胞培养基中的抗体-脂质运载蛋白突变蛋白融合多肽和IgG4Fc-脂质运载蛋白突变蛋白融合多肽的浓度使用ForteBio蛋白A传感器PaliCorp.进行测量，并使用人IgGl标准物进行定量数据未显示）。[0232]在第三种方案中，我们生成两种脂质运载蛋白突变蛋白（SEQIDNO:10和SEQIDN0:26通过一个或多个G4S2连接子SEQIDN0:48连接的融合物，并使用了两种个不同的设计，如图IC所示。在第一种设计中，SEQIDN0:26C末端融合至SEQIDNO:10,得到SEQIDN0:46的融合多肽;在第二种设计中，SEQIDN0:26的两个拷贝C末端融合至SEQIDNO:10,得到SEQIDNO:47的融合多肽。所述构建体包含用于亲和层析纯化的Strep标签（SEQIDN0:50。使用标准方法克隆所述构建体，并利用周质分泌在大肠杆菌中表达。[0233]使用蛋白A色谱法、然后通过在IOmM的组氨酸pH5.5，150mM的NaCl或PBS，pH7.4中的尺寸排阻色谱法SEC纯化所述抗体-脂质运载蛋白突变蛋白融合多肽和IgG4Fc片段-月旨质运载蛋白突变蛋白融合多肽。经SEC纯化后，汇集含有单体蛋白的级分，并再次使用分析型SEC进行分析。根据这一分析，所述融合多肽完全是单体的，没有可检测的多聚物种类或聚合物数据未显示）。[0234]实施例2:融合多肽对于GPC3的特异性[0235]我们采用ELISA试验来测定SEQIDNOs:36和37、SEQIDNOs:38和39、SEQIDN0s:40和41以及SEQIDN0s:42和43的融合多肽对重组人GPC3RDSystems#2119-GP-050CF的特异性。将所述靶标溶解于PBSlygmL中，并在4°C下涂覆于微量滴定板上过夜。在每个孵育步骤后，用补充有〇.1%vv吐温20的IOOyL的PBSPBS-T洗涤板5次。将板用在PBS-T中的2%BSAwv在室温下封闭1小时，随后洗涤。将不同浓度的脂质运载蛋白突变蛋白（SEQIDN0:10或融合多肽加入到孔中并在室温下孵育1小时，随后进行洗涤步骤。用在补充有2%wvBSA的PBS-TPBS-TB中1:1000稀释的与HRP缀合的抗人NGAL抗体孵育后，检测到结合的融合蛋白或脂质运载蛋白突变蛋白。在另外的洗涤步骤之后，向每个孔中加入荧光HRP底物QuantaBlu，Thermo，并使用荧光酶标仪检测荧光强度。[0236]实验结果如图2所示，连同由1:1结合S形拟合所产生的拟合曲线，其中EC50值和最大信号为自由参数，斜率固定为1。所得到的EC50值在表1中提供，包括数据的S形拟合的误差，这是本文表中总结的所有数据的情况。观察到的所有抗体-脂质运载蛋白突变蛋白融合多肽的EC50值处于相似的范围（0.25-0.28nM内，全部稍好于脂质运载蛋白突变蛋白（SEQIDN0:10其为0.55nM。实验表明，当包含于上述融合多肽中时，所述脂质运载蛋白突变蛋白可以与抗体的四个末端中的任一个融合，而不丧失对于GPC3的活性。[0237]表1-GPC3结合的ELISA数据[0238][0239]实施例3:融合多肽对于人⑶137的特异性[0240]我们采用ELISA试验来测定SEQIDNOs:36和37、SEQIDNOs:38和39、SEQIDN0s:40和41以及SEQIDN0s:42和43的融合多肽对重组CD137-Fc融合蛋白（#838-4B-100，RDSystems的特异性。SEQIDNOs:34和35的抗体作为阳性对照。将靶标溶解于PBSlygmL中，并在4°C下在微量滴定板上涂覆过夜。在每个孵育步骤后，用IOOyL的PBS-T洗涤板5次。将板用在PBS-T中的2%BSAwv在室温下封闭1小时，随后洗涤。将不同浓度的⑶137特异性抗体或所述融合多肽加入到孔中并在室温下孵育1小时，随后进行洗涤步骤。在室温下用在PBS-TB中1:5000稀释的与HRPJacksonLaboratories缀合的小鼠抗人IgGFab抗体孵育1小时后检测所结合的融合蛋白。在另外的洗涤步骤之后，向每个孔中加入荧光HRP底物QuantaBlu，Thermo，并使用焚光酶标仪检测焚光强度。[0241]实验结果如图3所示，连同由1:1结合S形拟合所产生的拟合曲线，其中EC50值和最大信号为自由参数，斜率固定为1。所得到的EC50值在表2中提供。对于所有测试的分子所观察到的EC50值非常相似，范围为1.5nM至2.3nM。实验表明，当包含于所述融合多肽中时，所述抗体可与所述脂质运载蛋白突变蛋白在抗体的四个末端中的任一个处融合，而不丧失对于⑶137的活性。[0242]表2:CD137结合的ELISA数据[0243][0244]^实施例4:在基于ELISA的设置中融合多肽的同时靶标结合的证明[0245]为了证明SEQIDN0s:36和37、SEQIDN0s:38和39、SEQIDN0s:40和41以及SEQIDNOs:42和43的融合多肽同时结合到GPC3和CD137两者，使用双重结合的ELISA形式。将PBS中的重组人CD137-FC融合蛋白（RDSystemslygmL在4°C下在微量滴定板上涂覆过夜。在每个孵育步骤后，用IOOyLPBS-T洗涤板5次。将板用在PBS-T中的2%BSAwv在室温下封闭1小时，然后再次洗涤。将不同浓度的融合多肽加入到孔中并在室温下孵育1小时，随后进行洗涤步骤。随后，将生物素化的人GPC3以在I3BS-TB中lygmL的恒定浓度加入1小时。洗涤后，向孔中加入Extravidin-HRPSigma-Aldrich，PBS-TB中1:50001小时。在另外的洗涤步骤之后，向每个孔中加入荧光HRP底物QuantaBlu，Thermo，并使用荧光酶标仪检测荧光强度。[0246]实验结果如图4所示，连同由1:1结合S形拟合所产生的拟合曲线，其中EC50值和最大信号为自由参数，斜率固定为1。所得到的EC50值在表3中提供。所有的融合多肽均显示出清晰的结合信号，其EC50值范围为1.7-2.InM，证明所述融合多肽能够同时接合GPC3和CD137〇[0247]表3:同时靶标结合的ELISA数据[0248][0249][0250]实施例5:抗体和融合多肽对人GPC3的亲和力[0251]使用BiacoreT200仪器GEHealthcare，通过表面等离子体共振（SPR测定SEQIDN0:10的脂质运载蛋白突变蛋白与SEQIDN0s:36和37、SEQIDN0s:38和39、SEQIDN0s:40和41以及SEQIDN0s:42和43的融合多肽与重组人GPC3RDSystems#2119-GP-050CF的结合亲和力。在SPR亲和力试验中，使用BiotinCAPture试剂盒GEHealthcare将生物素化的GPC3捕获在传感器芯片（“CAP芯片”）上:传感器芯片CAP使用ssDNA寡核苷酸预固定。以2yLmiη的流速施加未稀释的生物素CAPture试剂（与互补的ss-DNA寡核苷酸缀合的链霉亲和素300秒。使用浓度为lygmL的生物素化的GPC3分析所述脂质运载蛋白突变蛋白，使用浓度为〇.25ygmL的生物素化的GPC3分析所述融合蛋白。以5yLmin的流速施加所述生物素化的GPC3300秒。通过在室温下用EZ-Link®NHS-PEG4-生物素5倍摩尔过量ThermoScientific孵育2小时来生物素化GPC3。通过将反应混合物装载到ZebaTM旋转脱盐板ThermoScientific上，除去未反应的过量生物素试剂。参照通道仅装载BiotinCAPture试剂。[0252]为了测定亲和力，将GCP3固定在芯片表面上，在运行缓冲液（IOmMHEPES，150mMNaCl，0.05%vv表面活性剂P20,3mMEDTA，pH7.4GEHealthcare中制备四种不同浓度11.1、3.7、1.2和0.41^的每种测试的试剂融合多肽或脂质运载蛋白突变蛋白），并施加于所述芯片表面。应用30yLmin的流速，样品接触时间为180秒，解离时间为1200秒。所有的测量在25°C下进行。通过注射含有0.25MNaOH的6M盐酸胍，然后用运行缓冲液进行额外洗涤并且进行120秒的稳定期来实现传感器芯片CAP表面的再生。在蛋白质测量之前，进行三个再生循环用于调节目的。使用BiacoreT200评估软件V2.0评估数据。使用双重参照，并使用1:1结合模型来拟合原始数据。[0253]数据如图5所示，表4中总结了拟合结果。从数据可以得出结论，所述融合多肽结合GPC3的亲和力与SEQIDNO:10的脂质运载蛋白突变蛋白非常相似。所述融合多肽的表观结合亲和力在17-30pM的范围内，SEQIDN0:10的脂质运载蛋白突变蛋白的表观结合亲和力为12pM。[0254]表4:对GPC3的结合亲和力[0255][0256]实施例6:抗体和融合多肽对人⑶137的亲和力[0257]类似于实施例5,通过表面等离子体共振SPR测定SEQIDNOs:34和35的抗体与SEQIDN0s:36和37、SEQIDN0s:38和39、SEQIDN0s:40和41以及SEQIDN0s:42和43的融合多肽与重组人CD137-Fc融合蛋白（#838-4B-100，RDSystems的结合亲和力。简言之，将生物素化的CD137-FC捕获在传感器芯片CAP上，在运行缓冲液中制备每种测试的试剂融合蛋白或SEQIDNOs:34和35的四种稀释液20、5、1.3和0.3nM，并施加于所述芯片表面。应用30yLmin的流速，样品接触时间为180秒，解离时间为600秒。如实施例5所述，另外实施和分析所有的测量。[0258]表5中总结了结果，数据显示了所述融合多肽结合CD137的亲和力与所述抗体非常相似。所述融合蛋白的表观结合亲和力在71_179pM范围内，所述抗体20H4.9SEQIDNOs:34和35的表观结合亲和力为92pM。[0259]表5:对CD137的结合亲和力[0260][0261]实施例7:脂质运载蛋白突变蛋白Fc-融合多肽对于GPC3的特异性[0262]我们采用如实施例2所述的ELISA试验来测定融合多肽SEQIDN0:44和SEQIDNO:45对重组人GPC3的特异性。[0263]实验结果如图7所示，连同由1:1结合S形拟合所产生的拟合曲线，其中EC50值和最大信号为自由参数，斜率固定为1。所得到的EC50值在表6中提供。观察到的脂质运载蛋白突变蛋白Fc-融合多肽的EC50值均优于观察到的结合GPC3的脂质运载蛋白突变蛋白（SEQIDN0:10的EC50值。[0264]表6:GPC3结合的ELISA数据[0265][0266]实施例8:脂质运载蛋白突变蛋白Fc-融合多肽对于人CD137的特异性[0267]我们采用ELISA试验来测定SEQIDN0:44和SEQIDN0:45的脂质运载蛋白突变蛋白Fc-融合多肽对重组⑶137-Fc融合多肽的特异性，如实施例3所述。[0268]实验结果如图8所示，连同由1:1结合S形拟合所产生的拟合曲线，其中EC50值和最大信号为自由参数，斜率固定为1。所得到的EC50值在表7中提供。观察到的脂质运载蛋白突变蛋白Fc-融合多肽的EC50值均优于观察到的结合GPC3的脂质运载蛋白突变蛋白（SEQIDN0:26的EC50值。[0269]表7:CD137结合的ELISA数据[0270]实施例9:在基于ELISA的设置中脂质运载蛋白突变蛋白Fe-融合多肽的同时靶标结合的证明[0271]为了证明SEQIDN0:44和SEQIDN0:45的融合多肽同时结合到GPC3和CD137两者，类似于实施例4使用双重结合的ELISA形式。[0272]实验结果如图9所示，连同由1:1结合S形拟合所产生的拟合曲线，其中EC50值和最大信号为自由参数，斜率固定为1。所得到的EC50值在表8中提供。两种融合多肽显示出清晰的的结合信号，其EC50值接近1.7nM，证明所述融合多肽能够同时接合GPC3和⑶137。[0273]表8:同时靶标结合的ELISA数据[0274][0275]实施例10:抗体和融合多肽对人GPC3的亲和力[0276]通过如实施例5所述的表面等离子体共振测定SEQIDNO:10的结合GPC3的脂质运载蛋白突变蛋白与SEQIDNO:44和SEQIDNO:45的融合多肽与重组人GPC3的结合亲和力。[0277]数据如图10所示，表9中总结了拟合的Kd值。数据显示所述融合多肽结合GPC3的亲和力与所述脂质运载蛋白突变蛋白非常相似。相比于所述脂质运载蛋白突变蛋白的33pM的表观结合亲和力，所述融合多肽的表观结合亲和力分别为23pM和29pM。[0278]表9:对GPC3的结合亲和力[0279][0280]实施例11:抗体和融合多肽对人⑶137的亲和力[0281]类似于实施例6,测定SEQIDNO:26的结合⑶137的脂质运载蛋白突变蛋白以及SEQIDNO:44和SEQIDNO:45的融合多肽与重组人CD137-FC融合蛋白的结合亲和力。[0282]图11中显示了SEQIDN0:44和SEQIDN0:45的融合多肽的数据，表10中是所有测试的分子的拟合的Kd值。数据显示所述融合多肽结合CD137的亲和力分别为InM或l.lnM，优于所述脂质运载蛋白突变蛋白的Kd值，其值为2.3nM。[0283]表10:对CD137的结合亲和力[0284][0285]实施例12:融合多肽对于GPC3的特异性[0286]我们基于SEQIDN0s:51和52的CD137结合抗体和SEQID^:10的结合6?03的脂质运载蛋白突变蛋白，生成另外的融合多肽。使用G4S3连接子将脂质运载蛋白突变蛋白C末端融合至重链而得到SEQIDNOs:53和54的融合多肽。[0287]我们采用如实施例2所述的ELISA试验来测定SEQIDNOs:53和54的融合多肽对重组人GPC3的特异性。[0288]实验结果如图12所示，连同由1:1结合S形拟合所产生的拟合曲线，其中EC50值和最大信号为自由参数，斜率固定为1。所得到的EC50值在表11中提供。所述融合多肽和所述脂质运载蛋白突变蛋白的对于GPC3的EC50是相当的。数据显示，当包含于所述融合多肽中时，所述脂质运载蛋白突变蛋白能够被融合至所述抗体，而不丧失对于GPC3的活性。[0289]表11:GPC3结合的ELISA数据[0290][0291]实施例13:在基于ELISA的设置中融合多肽的同时靶标结合的证明[0292]类似于实施例4,为了证明SEQIDN0s:53和54的融合多肽同时结合到GPC3和⑶137两者，使用双重结合的ELISA形式。[0293]实验结果如图13所示，连同由1:1结合S形拟合所产生的拟合曲线，其中EC50值和最大信号为自由参数，斜率固定为1。所述融合多肽显示出清晰的结合信号，其EC50值为4·66±0·65nM，证明所述多肽能够同时接合GPC3和CDl37。[0294]实施例14:融合多肽对于GPC3的特异性[0295]我们采用如实施例2所述的ELISA试验来测定SEQIDN0:46和SEQIDN0:47的双特异性融合多肽以及所述SEQIDN0:8的脂质运载蛋白突变蛋白对重组人GPC3的特异性。[0296]实验结果如图14所示，连同由1:1结合S形拟合所产生的拟合曲线，其中EC50值和最大信号为自由参数，斜率固定为1。所得到的EC50值在表12中提供。所述融合多肽的EC50值与所述脂质运载蛋白突变蛋白的EC50值至少一样好或甚至更优。数据表明，当包含于两种融合多肽中时，所述脂质运载蛋白突变蛋白能够被融合至所述抗体，而不丧失对于GPC3的活性。[0297]表12:GPC3结合的ELISA数据[0298][0299]实施例15:融合多肽对于人⑶137的特异性[0300]我们采用ELISA试验来测定SEQIDNO:46和SEQIDNO:47的双特异性多肽以及SEQIDN0:26的脂质运载蛋白突变蛋白对重组⑶137-Fc融合蛋白的特异性，如实施例3所述。[0301]实验结果如图15所示，连同由1:1结合S形拟合所产生的拟合曲线，其中EC50值和最大信号为自由参数，斜率固定为1。所得到的EC50值在表13中提供。所述融合多肽的EC50值与所述脂质运载蛋白突变蛋白的EC50值至少一样好或甚至更优。数据表明，当包含于两种融合多肽中时，所述抗体能够被融合至所述脂质运载蛋白突变蛋白，而不丧失对于CD137的活性。[0302]表13:CD137结合的ELISA数据[0303][0304]实施例16:基于ELISA的设置中融合多肽的同时靶标结合的证明[0305]类似于实施例4,为了证明SEQIDN0:46和SEQIDN0:47的双特异性多肽同时结合到GPC3和CD137，使用双重结合的ELISA形式。[0306]实验结果如图16所示，连同由1:1结合S形拟合所产生的拟合曲线，其中EC50值和最大信号为自由参数，斜率固定为1。两种融合多肽均显示出清晰的结合信号，其EC50值为7.3-7.5nM，证明所述两种融合多肽能够同时接合GPC3和⑶137。[0307]表14:同时靶标结合的ELISA数据[0308][0309]实施例17:融合多肽对人GPC3的亲和力[0310]类似于实施例5中描述的程序，使用HBS-EP+Ix;BR-1006-69;GEHealthcare作为运行缓冲液，通过在BiacoreT200仪器GEHealthcare上的表面等离子体共振来测定结合GPC3的脂质运载蛋白突变蛋白以及SEQIDN0:46和SEQIDN0:47的双特异性多肽与重组人GPC3和重组人⑶137的结合亲和力。[0311]使用BiotinCAPture试剂盒GEHealthcare将生物素化的双特异性多肽固定在芯片表面上。使用标准NHS化学生物素化所述双特异性多肽。未稀释的BiotinCAPture试剂与ss-DNA寡核苷酸缀合的链霉亲和素被捕获在具有预固定的互补的ss-DNA寡核苷酸的传感器芯片CAP上。之后，以5yLmin的流速施加lygml的生物素化的突变蛋白300秒。[0312]以3^17111丨11的流速、以4种浓度（30011]\1、10011]\1、3311]\1和1111]\1施加6?03。注射所述GPC3180秒，随后的解离时间设定为1200秒。通过以lOyLmin的流速注射6M盐酸胍+0.25MNaOH120秒）来实现芯片表面的再生。注射再生溶液之后，用HBS-EP+lx;BR-1006-69;GEHealthcare运行缓冲液进行额外的洗涤并且进行120秒的稳定期。[0313]通过从结合应答中减去对照通道仅装载BiotinCAPture试剂）测量的相应信号和减去缓冲液注射测量的相应信号，双重参照所述数据。使用BiacoreT200评估软件V2.0进行数据处理和动力学拟合，测定结合反应的结合速率常数k4P解离速率常数kd。[0314]各自的传感图如图17所示。表15中总结了结果。数据显示所述双特异性多肽分别以4·3nMSEQIDN0:46和3·5nMSEQIDN0:47的亲和力结合GPC3。[0315]表15:对GPC3的结合亲和力[0316][0317]实施例18:融合多肽对人⑶137的亲和力[0318]类似于实施例6,通过使用BiacoreT200仪器GEHealthcare的表面等离子体共振测定所述结合⑶137的脂质运载蛋白突变蛋白以及SEQIDNO:46和SEQIDNO:47的双特异性多肽与重组人CD137-Fc融合蛋白（#838-4B-100，RDSystems的结合亲和力。在SPR亲和力试验之前，根据制造商的说明书，使用人抗体捕获试剂盒GEHealthCare#BR-1008-39，用抗人Fe抗体衍生化CM5传感器芯片。[0319]为了测定亲和力，将人CD137-FC融合蛋白以0.25mglm的浓度、lOyLmin的流速和180的接触时间固定在芯片上。在运行缓冲液（IOmMHEPES，150mMNaCl，0.05%vv表面活性剂P20,3mMEDTA，pH7.4GEHealthcare中制备四种不同浓度（1000nM、200nM、40nM和8nM的双特异性多肽，并施加于芯片表面。应用30yLmin的流速，样品接触时间为180秒，解离时间为600秒。所有的测量在25°C下进行。通过注射IOmM的甘氨酸pH1.7，然后用运行缓冲液进行额外洗涤并且进行120秒的稳定期来实现传感器芯片表面的再生。在蛋白质测量之前，进行三个再生循环用于调节目的。使用BiacoreT200评估软件V2.0评估数据。使用双重参照，并使用1:1结合模型来拟合原始数据。[0320]结果如图18所示，表16中进行了总结。数据显示所述双特异性多肽结合CD137的亲和力与所述脂质运载蛋白突变蛋白对于CD137的亲和力至少一样好。[0321]表16:对⑶137的结合亲和力[0322]~实施例19:使用涂覆的融合多肽进行功能性T细胞活化试验[0324]我们使用T细胞活化试验来评估SEQIDNOs:36和37、SEQIDNOs:38和39、SEQIDN0s:40和41以及SEQIDN0s:42和43的融合多肽共刺激T细胞应答的能力。为此目的，将不同浓度的融合多肽与抗人⑶3抗体0KT3，eBioscience—起涂覆在塑料皿上，然后在可溶性抗人CD28抗体Clone28.2;eBioscience的存在下，将纯化的T细胞在涂覆的表面上孵育。作为读出结果，我们测量了上清液白细胞介素2IL-2水平。使用人IgG4同种型作为阴性对照。在下文中，我们提供了实验的详细描述。[0325]遵循Biochrom的方案，通过经聚鹿糖Polysucrose密度梯度^Biocoll1.077gmUBiochrom离心从血沉棕黄层中分离出来自健康志愿者供体的人外周血单核细胞PBMC。使用PanT细胞纯化试剂盒MiltenyiBiotecGmbH和制造商的方案从所得PBMC分离出T淋巴细胞。将纯化的T细胞在由90%FCS和IO%DMSO组成的缓冲液中重新悬浮，立即用液氮冷冻并储存在液氮中直至进一步使用。对于该试验，将T细胞解冻16小时，并在补充有10%FCS和1%青霉素-链霉素（LifeTechnologies的培养基（RPMI1640，LifeTechnologies中培养。[0326]对于每个实验条件使用一式三份样品进行以下程序。将平底组织培养板在4°C下使用200yL的0.5ygmL的抗CD3抗体和SEQIDN0s:36和37、SEQIDN0s:38和39、SEQIDNOs:40和41以及SEQIDNOs:42和43的融合多肽的一系列稀释物（25ygmL、2.5ygmL和0.25ygmL或所述IgG4同种型阴性对照（25ygmL涂覆过夜。在具有相同实验条件的另一个设置中，所述融合多肽与IgGl同种型（作为另外的阴性对照而非抗CD3抗体一起进行涂覆。第二天，用I3BS洗涤孔两次，并向每个孔中加入IOOyL的在补充有2ygmL的抗hCD28抗体的培养基中的T细胞悬液相当于5X104个T细胞）。板用透气密封件4titude覆盖，并在37°：下、加湿的5%C02气氛中孵育3天。随后，评估上清液中的E-2浓度以及细胞增殖。[0327]使用来自RDSystems的IL-2DuoSetDuoSet试剂盒对合并的细胞培养上清液中的人IL-2水平进行定量。如下描述进行该过程。在第一步中，用在PBS中稀释的lygmL的“人IL-2捕获抗体”（RDSystem在室温下涂覆384孔板2小时。随后，使用BiotekEL405选择CW洗涤器Biotek，用80yL的PBS-T含有0.05%Tween20的I3BS洗涤孔5次。在另外含有1%酪蛋白（ww的PBS-T中封闭1小时后，将合并的上清液和在培养基中稀释的系列浓度的IL-2标准品在384孔板中、4°C下孵育过夜。为了允许检测和定量所捕获的IL-2,将lOOngmL的生物素化的山羊抗hIL-2-Bio检测抗体RDSystem和lygmL的Sulfotag标记的链霉亲和素MesoscaleDiscovery的混合物加入含有0.5%的酪蛋白的PBS-T中，并在室温下孵育1小时。洗涤后，向每个孔中加入25yL读数缓冲液，并使用MesoscaleDiscovery读数器读取每个孔的电化学发光Bcl信号。使用MesoscaleDiscovery软件进行分析和定量。[0328]图19中描述了实验结果。与阴性对照同种型IgG4相比，对于所有的四种融合多肽SEQIDNOs:36和37,SEQIDNOs:38和39,SEQIDNOs:40和41以及SEQIDNOs:42和43，存在通过使用的T细胞的清晰的IL-2产生诱导。数据进一步显示在多肽融合物的更高涂覆浓度下朝向更强的IL-2诱导的趋势。在不存在T细胞的抗CD3刺激的情况下，所述融合多肽不诱导通过T细胞的IL-2产生。这表明了所述融合多肽能够共刺激采用次最佳浓度的抗CD3和抗CD28抗体刺激的T细胞的活化。[0329]实施例20:使用肿瘤细胞结合的融合多肽进行功能性T细胞活化试验[0330]我们采用靶细胞依赖性T细胞活化试验来评估SEQIDNOs:36和37、SEQIDNOs:44和SEQIDN0:45的融合多肽能够同时结合CD137和GPC3当固定在GPC3阳性细胞系上时共刺激T细胞应答的能力。作为阴性对照，我们使用SEQIDNOs:34和35的单特异性⑶137结合抗体。在实验中，将抗人CD3抗体0KT3，eBioscience涂覆在塑料培养皿上，随后将GPC3阳性HepG2细胞在培养皿上孵育过夜。第二天，在lygmL的SEQIDN0s:36和37、SEQIDNO:44和SEQIDNO:45的融合多肽或SEQIDNOs:34和35的对照抗体的存在下，将纯化的T细胞在涂覆的表面上孵育。作为读出结果，我们测量了上清液白细胞介素2IL-2水平。在下文中详细描述该实验。[0331]遵循Biochrom的方案，通过经聚蔗糖密度梯度（Biocoll1.077gmL，来自Biochrom离心从血沉棕黄层中分离出来自健康志愿者供体的人外周血单核细胞PBMC。使用PanT细胞纯化试剂盒MiltenyiBiotecGmbH和制造商的方案从所得PBMC分离出T淋巴细胞。将纯化的T细胞在由90%FCS和10%DMSO组成的缓冲液中重新悬浮，立即用液氮冷冻并储存在液氮中直至进一步使用。对于该试验，将T细胞解冻16小时，并在补充有10%FCS和1%青霉素-链霉素LifeTechnologies的培养基RPMI1640，LifeTechnologies中培养。[0332]对于每个实验条件使用一式三份样品进行以下程序。在37°C下，使用200yL的0.25ygmL抗CD3抗体预先涂覆平底组织培养板1小时或不涂覆。随后用PBS洗涤板两次。每孔涂板接种1.25XIO4个HepG2肿瘤细胞，并在37°C下、加湿的5%CO2气氛中，使其粘附过夜。之前已经在标准条件下使HepG2细胞在培养物中生长，使用Accutase分离，并重新悬浮于培养基中。[0333]在接下来的几天中，在37°C下用浓度为10ygml的丝裂霉素CSigmaAldrich处理肿瘤细胞2小时以便阻断其增殖。用PBS洗涤板两次，并向每个孔中加入IOOyL的T细胞悬浮液（相当于5XIO4个T细胞）和浓度为lygmL的融合多肽或阴性对照。板用透气密封件4titude覆盖，并在37°C下、加湿的5%⑶2气氛中孵育3天。随后，如下所述评估上清液中的IL-2浓度。[0334]使用来自RDSystems的IL_2Du〇Set试剂盒对细胞培养上清液中的人IL-2水平进行定量。以下进行和描述该过程。在第一步中，用在PBS中稀释的lygmL的“人IL-2捕获抗体”（RDSystem在室温下涂覆384孔板2小时。随后，使用BiotekEL405选择CW洗涤器Biotek，用80μ1的I3BS-T含有0.05%Tween20的I3BS洗涤孔5次。在另外含有1%酪蛋白ww的I3BS-T中封闭1小时后，将合并的上清液和在培养基中稀释的系列浓度的IL-2标准品在384孔板中、4°C下孵育过夜。为了允许检测和定量捕获的IL-2,将lOOngmL的生物素化的山羊抗1111^-2-13;[0检测抗体（1?035^七6111和]^88111]^的5111;1；'^38标记的链霉亲和素MesoscaleDiscovery的混合物加入含有0.5%的酪蛋白的PBS-T中，并在室温下孵育1小时。洗涤后，向每个孔中加入25yL读数缓冲液，并使用MesoscaleDiscovery读数器读取每个孔的电化学发光Bcl信号。使用MesoscaleDiscovery软件进行分析和定量。[0335]图20中描述了实验结果。与SEQIDNOs:34和35的对照抗体相比，对于SEQIDNOs:36和37、SEQIDNO:44和SEQIDNO:45的这三种融合多肽，存在通过使用的T细胞的清晰的IL-2产生诱导。正如所述GPC3结合融合多肽表现出比所述对照抗体更高水平的IL-2产生所证明的，这显示本公开内容的融合多肽能够以靶标依赖性方式共刺激T细胞活化。[0336]实施例21:在阻断和不阻断双特异性结合的情况下使用肿瘤细胞结合的融合多肽进行功能性T细胞活化试验[0337]我们采用类似于实施例20中描述的实验的靶细胞依赖性T细胞活化试验来评估SEQIDN0:44和SEQIDN0:45的融合多肽（能够同时结合CD137和GPC3当结合于GPC3阳性细胞系时共刺激T细胞应答的能力。作为对照，实验在过量的SEQIDNO:10的单特异性结合GPC3的Anticalin的存在下进行，以便从结合于所述GPC3阳性细胞中替换出双特异性构建体SEQIDN0:44或SEQIDN0:45。在实验中，将抗人CD3抗体0KT3，eBioscience涂覆在塑料培养皿上，随后将GPC3阳性Hep3B细胞在培养皿上孵育过夜。第二天，在四种浓度的SEQIDN0:44和SEQIDN0:45的融合多肽（lμgmL、0·lμgmL、0·01μgmL、0·001μgmL的存在下，将纯化的T细胞在涂覆的表面上孵育。同时，通过加入过量的SEQIDNO:10lmgmL进行实验。作为读出结果，我们测量了上清液白细胞介素2IL-2水平。在下文中详细描述该实验。[0338]遵循Biochrom的方案，通过经聚蔗糖密度梯度（Biocoll1.077gmL，来自Biochrom离心从血沉棕黄层中分离出来自健康志愿者供体的人外周血单核细胞PBMC。使用PanT细胞纯化试剂盒MiltenyiBiotecGmbH和制造商的方案从所得PBMC分离出T淋巴细胞。将纯化的T细胞在补充有10%FCS和1%青霉素-链霉素LifeTechnologies的培养基（RPMI1640，LifeTechnologies中培养。[0339]对于每个实验条件使用一式三份样品进行以下程序。在37°C下，使用200yL的0.25ygmL抗CD3抗体预先涂覆平底组织培养板1小时。随后用PBS洗涤板两次。每孔涂板接种1.25XIO4个Hep3B肿瘤细胞，并在37°C下、加湿的5%CO2气氛中，使其粘附过夜。之前已经在标准条件下使H印3B细胞在培养物中生长，使用Accutase分离，并重新悬浮于培养基中。[0340]在第二天，使用浓度为10ygml的丝裂霉素CSigmaAldrich处理肿瘤细胞2小时以便阻断其增殖。用I3BS洗涤板两次，在存在或不存在过量的SEQIDNO:10lmgmL的情况下，加入IOOyL的T细胞悬液相当于5XIO4个T细胞和浓度为lygmL、0.lygmL、0.OlygmL、0.001ygmL的SEQIDN0:44和SEQIDN0:45的融合多肽。板用透气密封件4titude覆盖，并在37°C下、加湿的5%⑶2气氛中孵育3天。随后，根据制造商的说明书，使用BDBioscience的人IL-2ELISA设置通过ELISA来测定所述上清液中的IL-2浓度。[0341]图21中描述了实验结果。对于SEQIDN0:44图21A和SEQIDN0:45图21C的两种融合多肽，存在通过使用的T细胞的清晰的IL-2产生诱导，其随着浓度升高而增加。相比之下，在过量的SEQIDNO:10的存在下，IL-2产生诱导被消除，所示SEQIDNO:10抑制了双特异性物SEQIDN0:44和SEQIDN0:45与Hep3B细胞的结合。这显示本公开内容的融合多肽能够以靶标依赖性方式共刺激T细胞活化。[0342]值得注意的是，与SEQIDN0:45相比，SEQIDN0:44的IL-2诱导的量更高，这表明双特异性GPC3CD137融合物的几何结构在测定T细胞活化的强度方面起重要作用。[0343]实施例22:使用具有高和低GPC3水平的肿瘤细胞进行功能性T细胞活化试验[0344]我们采用类似于实施例20中描述的实验的靶细胞依赖性T细胞活化试验，来评估SEQIDNO:44和SEQIDNO:45的融合多肽依赖于所用细胞系的GPC3水平共刺激T细胞应答的能力。我们使用HER2结合抗体曲妥珠单抗作为阴性对照。为了比较，我们研究了SEQIDNOs:74和75的参照抗CDl37单克隆抗体的行为。在实验中，将抗人CD3抗体（0KT3，eBioscience涂覆在塑料培养皿上，随后将HepG2、SKBR3或MCF7细胞在培养皿中分别培养过夜。第二天，在各种浓度的SEQIDN0:44、SEQIDN0:45的融合多肽、参照抗体SEQIDN0s:74和75以及阴性对照曲妥珠单抗和溶媒（即不添加测试品）的存在下，将纯化的T细胞在涂覆的表面上孵育。作为读出结果，我们测量了上清液白细胞介素2IL-2水平。在下文中详细描述该实验。[0345]遵循Biochrom的方案，通过经聚蔗糖密度梯度（Biocoll1.077gmL，来自Biochrom离心从血沉棕黄层分离出来自健康志愿者供体的人外周血单核细胞PBMC。使用PanT细胞纯化试剂盒MiltenyiBiotecGmbH和制造商的方案从所得PBMC分离T淋巴细胞。将纯化的T细胞在由90%FCS和10%DMSO组成的缓冲液中重新悬浮，立即用液氮冷冻并储存在液氮中直至进一步使用。对于该试验，将T细胞解冻16小时，并在补充有10%FCS和1%青霉素-链霉素（LifeTechnologies的培养基（RPMI1640，LifeTechnologies中培养。[0346]对于每个实验条件使用一式三份样品进行以下程序。在37°C下，使用200yL的0.25ygmL抗CD3抗体预先涂覆平底组织培养板1小时。随后用PBS洗涤板两次。每孔接种5XIO4个靶肿瘤细胞，并在37°C下、加湿的5%C02气氛中，使其粘附过夜。之前已经在标准条件下使所述靶细胞在培养物中生长，使用Accutase分离，并重新悬浮于培养基中。[0347]第二天，在37°C下使用浓度为30ygml的丝裂霉素CSigmaAldrich处理肿瘤细胞2小时以便阻断其增殖。用PBS洗涤板两次，将IOOytL的T细胞悬液（相当于5XIO4个T细胞连同浓度范围为0.05nM至5nM的测试品SEQIDN0:44和SEQIDN0:45、参照抗体SEQIDNOs:74和75以及阴性对照曲妥珠单抗加入每个孔中。板用透气密封件4titude覆盖，并在37°C下、加湿的5%C02气氛中孵育3天。随后，如下所述评估所述上清液中的IL-2浓度。[0348]使用来自RDSystems的IL-2DuoSet试剂盒对细胞培养上清液中的人IL-2水平进行定量。以下进行和描述该过程。在第一步中，用在PBS中稀释的lygmL的“人IL-2捕获抗体”（RDSystem在室温下涂覆384孔板2小时。随后，使用BiotekEL405选择Cw洗涤器Biotek，用80μ1的I3BS-T含有0.05%Tween20的I3BS洗涤孔5次。在另外含有1%酪蛋白ww的I3BS-T中封闭1小时后，将合并的上清液和在培养基中稀释的系列浓度的IL-2标准品在384孔板中、4°C下孵育过夜。为了允许检测和定量捕获的IL-2,将lOOngmL的生物素化的山羊抗hIL-2-Bio检测抗体（RDSystem和lygmL的Sulf〇tag标记的链霉亲和素MesoscaleDiscovery的混合物加入含有0.5%的酪蛋白的PBS-T中，并在室温下孵育1小时。洗涤后，向每个孔中加入25yL读数缓冲液，并使用MesoscaleDiscovery读数器读取每个孔的电化学发光Bcl信号。使用MesoscaleDiscovery软件进行分析和定量。[0349]图22中绘制了代表性实验的结果。在该图中，在没有测试品的情况下，相对于背景IL-2产生绘制数值，因此该数值代表与背景相比较的倍数变化。虽然阴性对照曲妥珠单抗图22A，三角形）不在三种细胞系中任一种的情况下导致T细胞上的IL-2诱导，双特异性融合多肽SEQIDN0:44图22A，圆圈）和SEQIDN0:45图22A，正方形）的上升浓度在GPC3表达的HepG2细胞的存在下诱导T细胞产生IL-2。然而，对于GPC3阴性SKBR3和MCF7细胞，没有明显的由于SEQIDN0:44和SEQIDN0:45的IL-2增加（图22。这种行为显著不同于抗CD137抗体SEQIDNO:74和75其在所有三种细胞系的存在下在T细胞上诱导IL-2图22B〇[0350]所述实验清楚地表明，SEQIDNO:44和SEQIDNO:45以依赖于靶细胞上GPC3的存在的方式活化T细胞。虽然GPC3阳性HepG2细胞系如通过IL-2产生测量的显示了清晰的T细胞活化，但是这种效应不在SKBR3和MCF7细胞的情况下发生，所述SKBR3和MCF7细胞不表达可检测的GPC3水平。这种效应可归因于GPC3的存在而不是由于所研究的GPC3阴性细胞系其潜在地使得CD137信号传导失效）导致的，前述情况通过以下事实变得显而易见：抗⑶137抗体SEQIDNOs:74和75能够在所有三种细胞类型的情况下通过⑶137信号传导来活化T细胞。[0351]实施例23:融合多肽的离体T细胞免疫原性评估[0352]为了研究在人体中形成抗药抗体的风险，进行双特异性融合多肽SEQIDNO:44和SEQIDN0:45、对照抗体曲妥珠单抗和阳性对照钥孔血蓝蛋白（KLH的体外T细胞免疫原性评估。为了进行实验，将来自被选择为涵盖反映全球人口分布的HLA同种异型的32个供体的PBMC解冻、洗涤并以每孔3XIO5个细胞的密度接种到96孔板上。将在试验介质中稀释的测试品以30ygmL的浓度加入到细胞中。单独使用试验介质作为空白，并使用钥孔血蓝蛋白KLH作为天然阳性对照。PBMC在37°C下、5%CO2的加湿气氛中孵育7天。在第7天，标记PBMC的表面表型⑶3+和⑶4+标志物和掺入DNA的EdU5-乙炔基-2^脱氧尿苷），用作细胞增殖标记物。使用GuavaeasyCyte8HT流式细胞仪测量CD3+CD4+EdU+增殖细胞的百分比，并使用GuavaSoftInCyte软件进行分析。[0353]图23提供了所有32个供体和所研究的所有测试分子的该试验的结果。在图23A中，绘制刺激指数，其通过在测试品存在下相对于不存在下的增殖比率获得。以虚线指示定义应答供体的阈值刺激指数2。在图23B中，绘制了由该阈值定义的应答供体的数量。显然，应答参照参照曲妥珠单抗的供体的数量是1个，因此是小的，而所有32个供体均以阈值以上的强增殖应答阳性对照KLH。对于双特异性融合多肽SEQIDN0:44和SEQIDN0:45,在两种情况下，应答供体的数目也是1个。[0354]因此实验证明了所述双特异性融合多肽在体外T细胞免疫原性评估中诱导很小的应答，这表明诱导免疫原性应答的风险很低。[0355]实施例24:对Fc-γ受体hFcyRICD64和hFcyRIIIACD16a的亲和力[0356]为了测量具有工程化的基于IgG4的主链的多肽融合物（SEQIDN0:44和SEQIDN0:45与Fc-γ受体hFcyRICD64RDSystems和hFcyRIIIACD16aRDSystems的结合亲和力，采用基于表面等离子体共振SPR的试验。曲妥珠单抗用作具有IgGl主链的单特异性抗体的对照。在SPR亲和力试验中，多肽融合物是生物素化的并使用BiotinCAPture试剂盒GEHealthcare捕获在传感器芯片CAP上。用ssDNA寡核苷酸预固定传感器芯片CAP。以2yLmin的流速施加未稀释的BiotinCAPture试剂（与互补的ss-DNA寡核苷酸缀合的链霉亲和素）300秒。随后，以5yLmin的流速施加lOygmL的生物素化的多肽融合物300秒。曲妥珠单抗和所述多肽融合物通过使用EZ-Link®NHS-PEG4_BiotinThermoScientific在室温下孵育2小时而生物素化。通过将反应混合物装载到ZebaTM旋转脱盐板ThermoScientific上除去过量的未反应的生物素试剂。参照通道仅装载BiotinCAPture试剂。[0357]为了测定亲和力，在运行缓冲液（IOmMHEPES，150mMNaCl，0.05%vv表面活性剂P20,3mMEDTA，pH7.4GEHealthcare中准备hFcyRICD64的四个稀释液（在100、25、6.25和1.611]\〇，或1^〇丫1?111六^0163的四至五个稀释液（在1000、333、111、37、1211]\〇，并将其施加到芯片表面。应用30yLmin的流速，样品接触时间为180秒，hFcγRICD64的解离时间为18002700秒，或者hFcγRIIIACD16a的解离时间为300秒。所有的测量在25°C下进行。通过注射含有0.25MNaOH的6MGua-HCl，然后用运行缓冲液进行额外洗涤并且进行120秒的稳定期来实现传感器芯片CAP表面的再生。在蛋白质测量之前，进行三个再生循环用于调节目的。使用BiacoreT200评估软件V2.0进行数据评估。使用双重参照。对于hFcγ1?1^064，使用1:1结合模型拟合原始数据。对于1^3丫1?1114〇16，采用稳态亲和力模型拟合原始数据。[0358]表17显示hFcyRI⑶64的数据的拟合结果。基于IgGl的测试品曲妥珠单抗显示出0.3nM的亲和力。多肽融合物SEQIDN0:44和SEQIDN0:45未显示与hFcγRICD64的显著结合。这些数据表明，通过将同种型从IgGl转换为工程化的IgG4,与hFcyRI⑶64的结合可降低到不明显水平。[0359]表17:[0362]表18显示hFcyRIIIACD16a的数据的拟合结果。所得到的基于IgGl的测试品曲妥珠单抗与hFcyRIIIACD16a的结合亲和力为约350nM，而多肽融合物SEQIDN0:44和SEQIDN0:45未显示出与hFcyRIIIACD16a的显著结合。这些数据表明，通过将同种型从IgGl转换为工程化的IgG4,与hFcγRI⑶16的结合可降低到不明显水平。[0363]表18:[0364][0365]实施例25:对新生儿Fc受体的亲和力[0366]为了测量具有工程化的基于IgG4的主链的多肽融合物SEQIDN0s:44和45与新生儿Fc受体FcRn，SinoBiologicals，#CT009-H08H的结合亲和力，采用基于表面等离子体共振SPR的试验。曲妥珠单抗用作具有IgGl主链的单特异性抗体的对照。在SPR亲和力试验中，根据制造商的说明书，将FcRn共价固定在CM5传感器芯片GEHealthcare上。简言之，在用1-乙基-3-3-二甲基氨基丙基-碳二亚胺EDC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS活化葡聚糖基质的羧基后，使FcRn蛋白的伯胺与表面上的NHS酯反应，直到达到〜200RU的信号。最后，通过使IM乙醇胺溶液通过表面来阻断未反应的NHS-酯。整个固定程序中的流速为10μ1min〇[0367]为了测定它们的亲和力，在运行缓冲液（IOmMHEPES，150mMNaCl，0.05%vv表面活性剂P20,3mMEDTA，pH6.0中制备所有构建体的六个稀释液（1000nM、333nM、lllnM、37nM、12nM和4nM并施加到芯片表面。应用30yLmin的流速，样品接触时间为180秒，解离时间为30秒。所有的测量在25°C下进行。通过注射IOmM甘氨酸pH3.0来实现传感器芯片CAP表面的再生。在蛋白质测量之前，进行三个再生循环用于调节目的。使用双重参照的BiacoreT200评估软件V2.0进行数据评估。采用稳态亲和力模型拟合原始数据。[0368]在表19中反映出，所得到的所有多肽融合物与FcRn的结合亲和力为约2μΜ，这表明将同种型从IgG1转化为工程化的IgG4主链对FcRn结合没有可检测的影响。[0369]表19:[0370][0371]实施例26:小鼠中融合多肽的药代动力学[0372]在小鼠中进行由SEQIDN0:44和SEQIDN0:45定义的融合多肽的药代动力学分析。约5周龄的雄性CD-I小鼠（每个时间点3只小鼠；CharlesRiverLaboratories，ResearchModelsandServices，GermanyGmbH以10mgkg的剂量在尾部静脉注射融合多肽。测试品以5mLkg的体积作为大剂量bolus施用。在时间点5分钟、1小时、2小时、4小时、8小时、24小时、48小时、4天、8天和14天获得来自小鼠的血浆样品。收集足够的全血在异氟烷麻醉下采集）以获得至少IOOyL的Li-Heparin血浆动物和时间。使用通过靶标GPC3和⑶137检测完整的双特异性构建体的夹心ELISA检测了药物水平。通过使用PrismGraphPad5软件的二室模型拟合数据。[0373]图25显示构建体SEQIDN0:44和SEQIDN0:45的血浆浓度随时间的曲线图，其中插图在半对数图中显示相同的数据。在这两种情况下，药代动力学看起来相似。从约15〇ygmL的血浆浓度开始，血浆水平在约100小时内降至背景水平。二室模型的双指数衰减成功地被应用于准确描述数据，使用该模型的数据拟合（图25得到SEQIDN0:44的终末半衰期为13.7小时以及SEQIDN0:45的终末半衰期为10.0小时。[0374]数据表明所述双特异性融合物具有的半衰期在对于Fc融合蛋白可预期的那种的中间范围内。[0375]实施例27:融合多肽在食蟹猴中的药代动力学[0376]在食蟹猴中进行由SEQIDN0:44和SEQIDN0:45定义的融合多肽的药代动力学分析。雄性食蟹猴在60分钟内接受静脉输注剂量为3mgkg的测试品。在时间点15分钟、2小时、4小时、8小时、24小时、48小时、3天、4天、5天、6天、7天、9天、11天、14天、18天和24天获得来自食蟹猴的血浆样品。使用通过靶标HER2和CD137检测完整的双特异性构建体的夹心ELISA检测了药物水平。使用采用靶标HER2和人Fc的夹心ELISA测定了曲妥珠单抗血浆水平。通过使用PrismGraphPad5软件的二室模型拟合数据。[0377]图26显示构建体SEQIDN0:44和SEQIDN0:45的血浆浓度随时间的曲线图，其中插图在半对数图中显示相同的数据。在两种情况下，药代动力学看起来相似，其中SEQIDNO:44显示出明显更长的半衰期。从约70ygmL的血浆浓度开始，血浆水平在200h的时间内下降到接近零。二室模型的双指数衰减成功地被应用于准确描述数据，使用该模型的数据拟合（图26得到分别为39小时的终末半衰期（SEQIDN0:44和24.1小时的终末半衰期SEQIDN0:45。[0378]因此，数据表明所述双特异性融合体在食蟹猴中具有的终末半衰期与在小鼠中的半衰期相比增加，并且在生物治疗剂的合理范围内。[0379]本文中说明性描述的实施方式可以适当地在没有本文中未具体公开的任何一个或多个元素、一个或多个限制的情况下实施。因此，例如，术语“包括”、“包含”、“含有”等应作扩大而不限制的理解。此外，本文使用的术语和表达被用作说明性而非限制性的术语，并且不旨在这样的术语和表达的使用排除所示和所述特征的任何等同物或其部分，而是应理解，在本发明所要求保护的的范围内可以进行各种修改。因此，应当理解的是，虽然本发明实施方案已经通过优选实施方案和可选特征进行了具体公开，但是本领域技术人员可以采用对其的修改和变化，并且这样的修改和变化被认为在本发明的范围内。本文所描述的所有专利、专利申请、教科书和同行评议的出版物的全部内容均通过引用并入本文。此外，如果在通过引用并入本文的参考文献中的术语的定义或用途与本文中提供的该术语的定义不一致或相矛盾，则应用本文中提供的该术语的定义而不应用在参考文献中的该术语的定义。落入一般公开内容内的较窄种类和亚属分组中的每一个也构成了本发明的一部分。这包括具有从属类中去除任何主题的附带条件或负面限制的本发明的一般描述，而不管所删除的材料是否在本文中具体叙述。另外，当按照马库什组的方式描述特征时，本领域技术人员将认识到，本公开内容也由此根据该马库什组的任何个别成员或成员亚组来描述。其他实施方案将由以下权利要求变得显而易见。[0380]等同物:本领域技术人员将认识到或能够使用不超过常规实验来确定本文描述的本发明的具体实施方案的许多等同物。这样的等同物旨在被所附权利要求涵盖。本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本说明书中，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体和单独地指明通过引用并入本文。

权利要求：1.一种能够结合CD137和GPC3的融合多肽，其中所述融合多肽包含至少两个任意顺序的亚基，其中第一亚基对⑶137是特异性的，而第二亚基对GPC3是特异性的。2.根据权利要求1所述的融合多肽，其中所述第一亚基包含对CD137具有结合特异性的全长免疫球蛋白或其抗原结合结构域，并且其中所述第二亚基包含对GPC3具有结合特异性的脂质运载蛋白突变蛋白。3.根据权利要求1所述的融合多肽，其中所述第一亚基包含对CD137具有结合特异性的脂质运载蛋白突变蛋白，并且其中所述第二亚基包含对GPC3具有结合特异性的脂质运载蛋白突变蛋白。4.根据权利要求3所述的融合多肽，其中所述融合多肽还包含免疫球蛋白-Fc片段。5.根据权利要求3所述的融合多肽，其中所述融合多肽还包含对CD137特异性的第三亚基。6.根据权利要求5所述的融合多肽，其中所述第三亚基包含对CD137具有结合特异性的脂质运载蛋白突变蛋白。7.根据权利要求1所述的融合多肽，其中当在基本如实施例3、实施例8或实施例15中描述的ELISA试验中测量时，所述融合多肽能够以至少约5nM的EC50值结合CD137。8.根据权利要求1所述的融合多肽，其中当在基本如实施例8或实施例15中描述的ELISA试验中测量时，所述融合多肽能够以与包含于所述融合多肽中的对CDl37特异的所述脂质运载蛋白突变蛋白或所述抗体的EC50值至少一样好或更优的EC50值结合CDl37。9.根据权利要求1所述的融合多肽，其中当通过基本如实施例6、实施例11或实施例18中描述的表面等离子体共振SPR分析测量时，所述融合多肽能够以至少约5nM的Kd的亲和力结合CD137。10.根据权利要求1所述的融合多肽，其中当在基本如实施例2、实施例7、实施例12或实施例14中描述的ELISA试验中测量时，所述融合多肽能够以至少约5nM的EC50值结合GPC3。11.根据权利要求1所述的融合多肽，其中当在基本如实施例7、实施例12或实施例14中描述的ELISA试验中测量时，所述融合多肽能够以与包含于所述融合多肽中的对GPC3特异的所述脂质运载蛋白突变蛋白的EC50值相当的EC50值结合GPC3。12.根据权利要求1所述的融合多肽，其中当通过基本如实施例5、实施例10或实施例17中描述的表面等离子体共振SPR分析测量时，所述融合多肽能够以至少约5nM的Kd的亲和力结合GPC3。13.根据权利要求1所述的融合多肽，其中当在基本如实施例4、实施例9、实施例13或实施例16中描述的ELISA试验中测量时，所述融合多肽能够同时结合CDl37和GPC3。14.根据权利要求1所述的融合多肽，其中当在基本如实施例4、实施例9、实施例13或实施例16中描述的ELISA试验中测量时，所述融合多肽能够以至少约IOnM的EC50值同时结合CD137*GPC3〇15.根据权利要求1所述的融合多肽，其中所述融合多肽能够在基本如实施例19中描述的功能性T细胞活化试验中共刺激T细胞应答。16.根据权利要求1所述的融合多肽，其中所述融合多肽能够在基本如实施例19中描述的功能性T细胞活化试验中，在存在T细胞的刺激的情况下诱导IL-2产生。17.根据权利要求1所述的融合多肽，其中所述融合多肽在基本如实施例19中描述的功能性T细胞活化试验中，在不存在T细胞的抗CD3刺激的情况下不诱导IL-2产生。18.根据权利要求1的融合多肽，其中所述融合多肽能够在基本如实施例19中描述的功能性T细胞活化试验中，共刺激采用次最佳浓度的抗CD3和抗CD28抗体刺激的T细胞的活化。19.根据权利要求1所述的融合多肽，其中所述融合多肽能够在基本如实施例20中描述的功能性T细胞活化试验中共刺激T细胞应答。20.根据权利要求1所述的融合多肽，其中所述融合多肽能够在基本如实施例20中描述的功能性T细胞活化试验中诱导IL-2产生。21.根据权利要求1所述的融合多肽，其中所述融合多肽能够在基本如实施例20中描述的功能性T细胞活化试验中以GPC3靶标依赖性方式共刺激T细胞活化。22.根据权利要求1-21中任一项所述的融合多肽，其中所述GPC3特异性脂质运载蛋白突变蛋白在成熟hNGALSEQIDNO:2的线性多肽序列的序列位置36、40、41、49、52、65、68、70、72、73、77、79、81、87、96、100、103、105、106、125、127、132、134、136和或175处包含至少20个突变的氨基酸残基。23.根据权利要求1-21中任一项所述的融合多肽，其中所述GPC3特异性脂质运载蛋白突变蛋白的氨基酸序列包含以下与所述成熟hNGALSEQIDNO:2的线性多肽序列相比较的突变的氨基酸残基中的至少一f:Leu36—ValSArg;Ala40—Leu，ValSGly;Ile4l4Leu，Arg，Met，Gly或Ala;Gln49—Pro或Leu;Tyr52—Arg或Trp;Asn65^Asp；Ser68^Val，Gly，Asn或Ala;Leu70—Arg，Ser，Ala或Val;Arg72—Asp，Trp，Ala或Gly;Lys73^Gly，Arg，Asn，GluSSer;Cys764ValSlle;Asp774His，Met，Val，Leu，ThrSLys;Trp79—Lys，Ser或Thr;Arg81—Gly;Cys87—Ser;Asn96—Arg，Asp，Gln或Pro;Tyr100—Gly，Glu，Pro或Gln;Leu103—Glu，Gln，Asn，Gly，Se;rSTy;r;Serl054Ala;Tyrl064Asn，Ser或Thr;Lys125—Glu;Ser127—Arg或Tyr;Tyr132—Trp或Ile;Lys134—Ala或Phe;Thr136—Ile;和Cys175—Ala。24.根据权利要求1-23中任一项所述的融合多肽，其中所述GPC3特异性脂质运载蛋白突变蛋白的氨基酸序列在对应于所述成熟hNGALSEQIDNO:2的线性多肽序列的序列位置28的序列位置处不包含突变。25.根据权利要求1-24中任一项所述的融合多肽，其中关于所述GPC3特异性脂质运载蛋白突变蛋白的氨基酸序列，在所述成熟hNGALSEQIDN0:2的线性多肽序列的位置65处的天然N-糖基化位点Asn在所述突变蛋白的相应序列位置处被去除。26.根据权利要求1-25中任一项所述的融合多肽，其中所述GPC3特异性脂质运载蛋白突变蛋白的氨基酸序列包含以下氨基酸取代组之一：aLeu36^Val；Ile41^Leu；Gln49^Leu；Tyr52^Arg；Asn65^Asp；Ser68^Val；Leu70^Ser；Arg72^Trp；Lys73^Arg；Asp77^His；Trp79^Lys；Arg81^Gly；Cys87^Ser；Asn96^Asp；Tyr100^Gly；Leu103^Gln；Tyr106^Asn；Lys125^Glu；Ser127^Arg；Tyr132^Trp；Lys134^Ala；⑹Leu36—Val;Ala40—Val;Ile41—Arg;Gln49—Pro;Tyr52—Arg;Asn65—Asp；Ser68^Gly；Leu70^Ser；Lys73^Gly；Asp77^His；Trp79^Lys；Arg81^Gly；Cys87^Ser；Asn96^Asp；Tyr100^Gly；Leu103^Glu；Tyr106^Asn；Lys125^Glu；Ser127^Arg；Tyr132^Trp；Lys134^Phe；cLeu36^Val；Ala40^Gly；Ile41^Met；Gln49^Leu；Tyr52^Arg；Asn65^Asp；Leu70^Ala；Lys73^Asn；Asp77^His；Trp79^Lys；Arg81^Gly；Cys87^Ser；Asn96^Gln；Tyr100^Gly；Leu103^Glu；Tyr106^Asn；Lys125^Glu；Ser127^Arg；Tyr132^Trp；Lys134^Phe；dLeu36^Arg；Ala40^Val；Ile41^Gly；Gln49^Pro；Tyr52^Trp；Asn65^Asp；Ser68^Asn；Leu70^Arg；Arg72^Ala；Lys73^Arg；Asp77^Leu；Trp79^Ser；Arg81^Gly；Cys87^Ser；Asn96^Gln；Tyr100^Glu；Leu103^Asn；Ser105^Ala；Tyr106^Asn；Lys125^Glu；Ser127^Tyr；Tyr132^Ile；Lys134^Phe；Thr136^lie；eLeu36^Arg；Ala40^Val；Ile41^Gly；Gln49^Pro；Tyr52^Trp；Asn65^Asp；Ser68^Asn；Leu70^Arg；Arg72^Ala；Lys73^Arg；Asp77^Thr；Trp79^Ser；Arg81^Gly；Cys87^Ser；Asn96^Gln；Tyr100^Glu；Leu103^Gly；Ser105^Ala；Tyr106^Asn；Lys125^Glu；Ser127^Tyr；Tyr132^Ile；Lys134^Phe；Thr136^lie；fLeu36^Arg；Ala40^Gly；Ile41^Ala；Gln49^Pro；Tyr52^Trp；Asn65^Asp；Ser68^Asn；Leu70^Arg；Arg72^Ala；Lys73^Arg；Asp77^Val；Trp79^Ser；Arg81^Gly；Cys87^Ser；Asn96^Pro；Tyr100^Glu；Leu103^Asn；Ser105^Ala；Tyr106^Ser；Lys125^Glu；Ser127^Tyr；Tyr132^Ile；Lys134^Phe；Thr136^lie；gLeu36^Arg；Ala40^Val；Ile41^Ala；Gln49^Pro；Tyr52^Arg；Asn65^Asp；Ser68^Ala；Leu70^Arg；Arg72^Ala；Lys73^Arg；Asp77^Leu；Trp79^Ser；Arg81^Gly；Cys87^Ser；Asn96^Arg；Tyr100^Glu；Leu103^Tyr；Ser105^Ala；Tyr106^Asn；Lys125^Glu；Ser127^Tyr；Tyr132^Ile；Lys134^Phe；Thr136^lie；hLeu36^Arg；Ala40^Val；Ile41^Ala；Gln49^Pro；Tyr52^Arg；Asn65^Asp；Ser68^Asn；Leu70^Val；Arg72^Ala；Lys73^Gly；Asp77^Lys；Trp79^Ser；Arg81^Gly；Cys87^Ser；Asn96^Arg；Tyr100^Pro；Leu103^Asn；Ser105^Ala；Tyr106^Asn；Lys125^Glu；Ser127^Tyr；Tyr132^Ile；Lys134^Phe；Thr136^lie；iLeu36^Arg；Ala40^Leu；Ile41^Gly；Gln49^Pro；Tyr52^Trp；Asn65^Asp；Ser68^Asn；Leu70^Arg；Arg72^Ala；Lys73^Arg；Asp77^Met；Trp79^Ser；Arg81^Gly；Cys87^Ser；Asn96^Gln；Tyr100^Glu；Leu103^Ser；Ser105^Ala；Tyr106^Asn；Lys125^Glu；Ser127^Tyr；Tyr132^Ile；Lys134^Phe；jLeu36^Arg；Ala40^Val；Ile41^Gly；Gln49^Pro；Tyr52^Trp；Asn65^Asp；Ser68^Asn；Leu70^Arg；Arg72^Ala；Lys73^Gly；Cys76^Val；Asp77^Lys；Trp79^Thr；Arg81^Gly；Cys87^Ser；Asn96^Gln；Tyr100^Glu；Leu103^Asn；Ser105^Ala；Tyr106^Thr；Lys125^Glu；Ser127^Tyr；Tyr132^Ile；Lys134^Phe；Cys175—Ala;kLeu36^Arg；Ala40^Val；Ile41^Gly；Gln49^Pro；Tyr52^Arg；Asn65^Asp；Ser68^Gly；Leu70^Arg；Arg72^Gly；Lys73^Glu；Cys76^Ile；Asp77^Lys；Trp79^Ser；Arg81^Gly；Cys87^Ser；Asn96^Gln；Tyr100^Gln；Leu103^Asp；Ser105^Ala；Tyr106^Thr；Lys125^Glu；Ser127^Tyr；Tyr132^Ile；Lys134^Phe；Thr136—Ile;Cys175—Ala;和ILeu36^Arg；Ala40^Val；Ile41^Gly；Gln49^Pro；Tyr52^Arg；Asn65^Asp；Ser68^Gly；Leu70^Arg；Arg72^Asp；Lys73^Ser；Cys76^Val；Asp77^Thr；Trp79^Ser；Arg81^Gly；Cys87^Ser；Asn96^Gln；Tyr100^Glu；Leu103^Asn；Ser105^Ala；Tyr106^Thr；Lys125^Glu；Ser127^Tyr；Tyr132^Ile；Lys134^Phe；Thr136^Ile；Cys175^Ala〇27.根据权利要求1-26中任一项所述的融合多肽，其中所述GPC3特异性脂质运载蛋白突变蛋白不具有N-糖基化位点。28.根据权利要求1-27中任一项所述的融合多肽，其中所述GPC3特异性脂质运载蛋白突变蛋白包含选自SEQIDNOs:4-17或其片段或变体的氨基酸序列，所述片段或变体包含如权利要求22至28中任一项所定义的氨基酸残基。29.根据权利要求1-27中任一项所述的融合多肽，其中所述GPC3特异性脂质运载蛋白突变蛋白与选自SEQIDN0s:4-17的氨基酸序列具有至少85%的序列同一性。30.根据权利要求1-21中任一项所述的融合多肽，其中所述CD137特异性脂质运载蛋白突变蛋白在成熟人泪脂质运载蛋白（SEQIDN0:1的线性多肽序列的序列位置5、26-31、33-34、42、46、52、56、58、60-61、65、71、85、94、101、104-106、108、111、114、121、133、148、150和153处包含至少一个突变的氨基酸残基。31.根据权利要求30所述的融合多肽，其中所述CD137特异性脂质运载蛋白突变蛋白的氨基酸序列包含以下与所述成熟人泪脂质运载蛋白（SEQIDNO:1的线性多肽序列相比较的突变的氨基酸残基中的至少一个:Ala5—Val或Thr;Arg26—Glu;Glu27—Gly;Phe28—Cys;Pro29—Arg;Glu30—Pro;Met31—Trp;Leu33—Ile;Glu34—Phe;Thr42—Ser；Gly46^Asp；Lys52^Glu；Leu56^Ala；Ser58^Asp；Arg60^Pro；Cys61^Ala；Lys65—Arg或Asn;Thr71—Ala;Val85—Asp;Lys94—Arg或Glu;Cys101—Ser;Glu104^Val；Leu105^Cys；His106^Asp；Lys108^Ser；Arglll^Pro；Lys114^Trp；Lys121—Glu;Ala133—Thr;Arg148—Ser;Ser150—lie和Cys153—Ser。32.根据权利要求30或31中任一项所述的融合多肽，其中所述CD137特异性脂质运载蛋白突变蛋白的氨基酸序列包含以下与所述成熟人泪脂质运载蛋白（SEQIDN0:1的线性多肽序列相比较的氨基酸取代组之一：aArg26^Glu；Glu27^Gly；Phe28^Cys；Pro29^Arg；Glu30^Pro；Met31^Trp;Leu33—Ile;Glu34—Phe;Leu56—Ala;Ser58—Asp;Arg60—Pro;Cys61—Ala;Cys101^Ser；Glu104^Val；Leu105^Cys；His106^Asp；Lys108^Ser；ArgIll^Pro；Lys114^Trp；Cys153—Ser;bAla5^Thr；Arg26^Glu；Glu27^Gly；Phe28^Cys；Pro29^Arg；Glu30^Pro；Met31^Trp；Leu33^Ile；Glu34^Phe；Leu56^Ala；Ser58^Asp；Arg60^Pro；Cys61^Ala；Lys65^Arg；Val85^Asp；Cys101^Ser；Glu104^Val；Leu105^Cys；His106^Asp；Lys108^Ser；Arglll^Pro；Lys114^Trp；Lys121^Glu；Ala133^Thr；Cys153—Ser;157—Pro;cArg26^Glu；Glu27^Gly；Phe28^Cys；Pro29^Arg；Glu30^Pro；Met31^Trp；Leu33^Ile；Glu34^Phe；Leu56^Ala；Ser58^Asp；Arg60^Pro；Cys61^Ala；Lys65^Asn；Lys94^Arg；Cys101^Ser；Glu104^Val；Leu105^Cys；His106^Asp；Lys108^Ser；Arglll^Pro；Lys114^Trp；Lys121^Glu；Ala133^Thr；Cys153^Ser；dAla5^Val；Arg26^Glu；Glu27^Gly；Phe28^Cys；Pro29^Arg；Glu30^Pro；Met31^Trp；Leu33^Ile；Glu34^Phe；Leu56^Ala；Ser58^Asp；Arg60^Pro；Cys61^Ala；Lys65^Arg；Lys94^Glu；Cys101^Ser；Glu104^Val；Leu105^Cys；His106^Asp；Lys108^Ser；Arglll^Pro；Lys114^Trp；Lys121^Glu；Ala133^Thr；Cys153—Ser;157—Pro;eArg26^Glu；Glu27^Gly；Phe28^Cys；Pro29^Arg；Glu30^Pro；Met31^Trp；Leu33^Ile；Glu34^Phe；Thr42^Ser；Leu56^Ala；Ser58^Asp；Arg60^Pro；Cys61^Ala；Cys101^Ser；Glu104^Val；Leu105^Cys；His106^Asp；Lys108^Ser；Arglll^Pro；Lys114^Trp；Ser150^Ile；Cys153^Ser；157^Pro；fArg26^Glu；Glu27^Gly；Phe28^Cys；Pro29^Arg；Glu30^Pro；Met3WTrp；Leu33^Ile；Glu34^Phe；Lys52^Glu；Leu56^Ala；Ser58^Asp；Arg60^Pro；Cys61^Ala；Thr71^Ala；Cys101^Ser；Glu104^Val；Leu105^Cys；His106^Asp；Lys108^Ser；Arglll^Pro；Lys114^Trp；Ala133^Thr；Arg148^Ser；Ser150^Ile;Cys153—Ser;157—Pro;或gAla5^Thr；Arg26^Glu；Glu27^Gly；Phe28^Cys；Pro29^Arg；Glu30^Pro；Met31^Trp；Leu33^Ile；Glu34^Phe；Gly46^Asp；Leu56^Ala；Ser58^Asp；Arg60^Pro；Cys61^Ala；Thr71^Ala；Cys101^Ser；Glu104^Val；Leu105^Cys；His106^Asp；Lys108^Ser；Arglll^Pro；Lys114^Trp；Ser150^Ile；Cys153^Ser；157^Pro〇33.根据权利要求1-21中任一项所述的融合多肽，其中所述CD137特异性脂质运载蛋白突变蛋白在所述成熟hNGALSEQIDNO:2的线性多肽序列的序列位置28、36、40-41、49、52、65、68、70、72-73、77、79、81、83、87、94、96、100、103、106、125、127、132和134处包含至少一个突变的氨基酸残基。34.根据权利要求33所述的融合多肽，其中所述CD137特异性脂质运载蛋白突变蛋白的氨基酸序列包含以下与所述成熟hNGALSEQIDNO:2的线性多肽序列相比较的突变的氨基酸残基中的至少一个:Gln28—His;Leu36—Gln;Ala40—Ile;Ile41—Arg或Lys;Gln49—Val，Ile，His，Se;rSAsn;Tyr524Met;Asn654Asp;Ser684Met，AlaSGly;Leu70-^Ala,Lys,SergJcThr；Arg72^Asp；Lys73^Asp；Asp77^Met,Arg,ThrgJcAsn；Trp79^Ala或Asp;Arg81—Met，Trp或Ser;Phe83—Leu;Cys87—Ser;Leu94—Phe;Asn96—Lys；Tyr100^Phe；Leu103^His；Tyr106^Ser；Lys125^Phe；Ser127^Phe；Tyr132—Glu和Lys134—Tyr。35.根据权利要求33或34中任一项所述的融合多肽，其中所述CD137特异性脂质运载蛋白突变蛋白的氨基酸序列包含以下氨基酸取代组之一：aGln28^His；Leu36^Gln；Ala40^Ile；Ile41^Lys；Gln49^Asn；Tyr52^Met；Ser68^Gly；Leu70^Thr；Arg72^Asp；Lys73^Asp；Asp77^Thr；Trp79^Ala；Arg81^Ser；Cys87^Ser；Asn96^Lys；Tyr100^Phe；Leu103^His；Tyr106^Ser；Lys125^Phe；Ser127^Phe；Tyr132^Glu；Lys134^Tyr；bGln28^His；Leu36^Gln；Ala40^Ile；Ile4WArg；Gln49^Ile；Tyr52^Met；Asn65^Asp；Ser68^Met；Leu70^Lys；Arg72^Asp；Lys73^Asp；Asp77^Met；Trp79^Asp；Arg81^Trp；Cys87^Ser；Asn96^Lys；Tyr100^Phe；Leu103^His；Tyr106^Ser；Lys125^Phe；Ser127^Phe；Tyr132^Glu；Lys134^Tyr；cGln28^His；Leu36^Gln；Ala40^Ile；Ile41^Arg；Gln49^Asn；Tyr52^Met；Asn65^Asp；Ser68^Ala；Leu70^Ala；Arg72^Asp；Lys73^Asp；Asp77^Thr；Trp79^Asp；Arg81^Trp；Cys87^Ser；Asn96^Lys；Tyr100^Phe；Leu103^His；Tyr106^Ser；Lys125^Phe；Ser127^Phe；Tyr132^Glu；Lys134^Tyr；dGln28^His；Leu36^Gln；Ala40^Ile；Ile41^Lys；Gln49^Asn；Tyr52^Met；Asn65^Asp；Ser68^Ala；Leu70^Ala；Arg72^Asp；Lys73^Asp；Asp77^Thr；Trp79^Asp；Arg81^Trp；Cys87^Ser；Asn96^Lys；Tyr100^Phe；Leu103^His；Tyr106^Ser；Lys125^Phe；Ser127^Phe；Tyr132^Glu；Lys134^Tyr；eGln28^His；Leu36^Gln；Ala40^Ile；Ile4WLys；Gln49^Ser；Tyr52^Met；Asn65^Asp；Ser68^Gly；Leu70^Ser；Arg72^Asp；Lys73^Asp；Asp77^Thr；Trp79^Ala；Arg81^Met；Cys87^Ser；Asn96^Lys；Tyr100^Phe；Leu103^His；Tyr106^Ser；Lys125^Phe；Ser127^Phe；Tyr132^Glu；Lys134^Tyr；fGln28^His；Leu36^Gln；Ala40^Ile；Ile4WLys；Gln49^Val；Tyr52^Met；Asn65^Asp；Ser68^Gly；Leu70^Thr；Arg72^Asp；Lys73^Asp；Asp77^Arg；Trp79^Asp；Arg81^Ser；Cys87^Ser；Leu94^Phe；Asn96^Lys；Tyr100^Phe；Leu103^His；Tyr106^Ser；Lys125^Phe；Ser127^Phe；Tyr132^Glu；Lys134^Tyr；gGln28^His；Leu36^Gln；Ala40^Ile；Ile4WArg；Gln49^His；Tyr52^Met；Asn65^Asp；Ser68^Gly；Leu70^Thr；Arg72^Asp；Lys73^Asp；Asp77^Thr；Trp79^Ala；Arg81^Ser；Cys87^Ser；Asn96^Lys；Tyr100^Phe；Leu103^His；Tyr106^Ser；Lys125^Phe；Ser127^Phe；Tyr132^Glu；Lys134^Tyr；hGln28^His；Leu36^Gln；Ala40^Ile；Ile41^Lys；Gln49^Asn；Tyr52^Met；Asn65^Asp；Ser68^Gly；Leu70^Thr；Arg72^Asp；Lys73^Asp；Asp77^Thr；Trp79^Ala；Arg81^Ser；Phe83^Leu；Cys87^Ser；Leu94^Phe；Asn96^Lys；Tyr100^Phe；Leu103^His；Tyr106^Ser；Lys125^Phe；Ser127^Phe；Tyr132^Glu；Lys134—Tyr;或iGln28^His；Leu36^Gln；Ala40^Ile；Ile4WArg；Gln49^Ser；Tyr52^Met；Asn65^Asp；Ser68^Ala；Leu70^Thr；Arg72^Asp；Lys73^Asp；Asp77^Asn；Trp79^Ala；Arg81^Ser；Cys87^Ser；Asn96^Lys；Tyr100^Phe；Leu103^His；Tyr106^Ser；Lys125^Phe；Ser127^Phe；Tyr132^Glu；Lys134^Tyr〇36.根据权利要求30-35中任一项所述的融合多肽，其中所述CD137特异性脂质运载蛋白突变蛋白的氨基酸序列包含选自SEQIDNOs:18-33或其片段或变体的氨基酸序列，所述片段或变体包含如权利要求30至35中任一项所定义的氨基酸残基。37.根据权利要求30-35中任一项所述的融合多肽，其中所述突变蛋白的氨基酸序列与选自SEQIDNOs:18-33的氨基酸序列具有至少85%的序列同一性。38.根据权利要求1-37中任一项所述的融合多肽，其中一个亚基能够基本如图1中描述通过连接子连接至另一个亚基。39.根据权利要求38所述的融合多肽，其中所述连接子是肽键。40.根据权利要求39所述的融合多肽，其中所述肽键是非结构化的G4S3连接子。41.根据权利要求1-40中任一项所述的融合多肽，其中所述融合多肽包含如SEQIDNO:48所示的氨基酸或SEQIDNO:49所示的氨基酸。42.根据权利要求1-41中任一项所述的融合多肽，其中所述免疫球蛋白是单克隆抗体。43.根据权利要求1-42中任一项所述的融合多肽，其中所述单克隆抗体是BMS-663513或PF-05082566。44.根据权利要求1-42中任一项所述的融合多肽，其中所述单克隆抗体具有由SEQIDNOs:34和35提供的重链和轻链。45.根据权利要求1-42中任一项所述的融合多肽，其中所述单克隆抗体具有由SEQIDNOs:51和52提供的重链和轻链。46.根据权利要求1-45中任一项所述的融合多肽，其中所述单克隆抗体具有IgG4主链。47.根据权利要求46所述的融合多肽，其中所述IgG4主链具有以下选自S228P、N297A、F234A和L235A的突变中的任一个。48.根据权利要求1-45中任一项所述的融合多肽，其中所述单克隆抗体具有IgG2主链。49.根据权利要求46所述的融合多肽，其中所述IgG2主链具有以下选自N297A、F234A和L235A的突变中的任一个。50.根据权利要求1至45中任一项所述的融合多肽，其中所述融合多肽包含SEQIDN0s:36和37所示的氨基酸，或SEQIDN0s:38和39所示的氨基酸，或SEQIDN0s:40和41所示的氨基酸，SEQIDNOs:42和43所示的氨基酸，SEQIDNO:44所示的氨基酸，SEQIDNO:45所示的氨基酸，SEQIDNO:46所示的氨基酸，SEQIDNO:47所示的氨基酸，或SEQIDNOs:53和54所示的氨基酸。51.—种核酸分子，其包含编码权利要求1至50中任一项所述的多肽的核苷酸序列。52.根据权利要求51所述的核酸分子，其中所述核酸分子可操作地连接至调节序列以允许所述核酸分子的表达。53.根据权利要求51或52所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含在载体中或菌粒载体中。54.—种宿主细胞，其含有权利要求51至53中任一项所述的核酸分子。55.—种生产根据权利要求1至50中任一项所述的融合多肽的方法，其中通过基因工程方法从编码所述突变蛋白的核酸开始生产所述融合多肽。56.根据权利要求55所述的方法，其中所述融合多肽在细菌或真核宿主生物体中产生，并从该宿主生物体或其培养物中分离。57.根据权利要求1至50中任一项所述的融合多肽或包含这种融合多肽的组合物用于同时活化CD137的下游信号传导通路和接合GPC3阳性肿瘤细胞的用途。58.根据权利要求1至50中任一项所述的融合多肽或包含这种融合多肽的组合物用于同时活化CD137的下游信号传导通路和接合GPC3阳性肿瘤细胞的用途。59.—种同时活化CD137的下游信号传导通路和接合GPC3阳性肿瘤细胞的方法，所述方法包括应用根据权利要求1至50中任一项所述的融合多肽或包含所述融合多肽的组合物。60.—种同时共刺激T细胞和接合GPC3阳性肿瘤细胞的方法，所述方法包括应用根据权利要求1至50中任一项所述的融合多肽或包含所述融合多肽的组合物。61.—种同时诱导T淋巴细胞增殖和接合GPC3阳性肿瘤细胞的方法，所述方法包括应用根据权利要求1至50中任一项所述的融合多肽或包含所述融合多肽的组合物。62.—种将T细胞上的⑶137聚集和活化导向至GPC3阳性肿瘤细胞的方法，所述方法包括应用根据权利要求1至50中任一项所述的融合多肽或包含所述融合多肽的组合物。

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