申请/专利权人：福州迈新生物技术开发有限公司

申请日：2019-06-19

公开（公告）日：2022-10-25

公开（公告）号：CN110218251B

主分类号：C07K16/18

分类号：C07K16/18;C12N5/20;G01N33/577;G01N33/68

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2022.10.25#授权;2019.10.08#实质审查的生效;2019.09.10#公开

摘要：本发明涉及生物检测领域，提供了一种抗MSH2蛋白单克隆抗体,其重链和轻链可变区的氨基酸序列分别是SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示的氨基酸序列。发明人还提供了抗MSH2蛋白单克隆抗体的制备方法，选取人MSH2氨基酸第411‑424位蛋白并与KLH偶联，作为免疫原。发明人还提供了一株分泌抗MSH2蛋白的杂交瘤细胞系，所述细胞系为小鼠杂交瘤细胞系1B11‑14‑16，保藏号为：CGMCCNO.17405。抗MSH2蛋白单克隆抗体,具有高特异性、敏感性，可以特异性识别表达MSH2蛋白的细胞，适用于免疫学检测，特别是免疫组化检测。

主权项：1.一种抗MSH2蛋白单克隆抗体，其特征在于,所述单克隆抗体重链和轻链可变区的氨基酸序列分别是SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示的氨基酸序列。

全文数据：抗MSH2蛋白单克隆抗体、细胞系及其制备方法和应用技术领域本发明涉及生物检测领域，特别涉及抗MSH2蛋白单克隆抗体、细胞系及其制备方法和应用。背景技术DNA错配修复系统MMR是由特异修复DNA碱基错配的酶分子组成。研究显示，MMR基因的突变和或功能缺失与多种肿瘤的发生相关，如结直肠癌、皮肤癌、卵巢癌、子宫内膜癌等。MSH2MutShomolog2基因是最早发现、也是学者们研究MMR基因时聚焦的焦点之一，是MMR系统中的“管家基因”，其具有识别错配的功能，长3111bp的cDNA含有2802bp的开放阅读框，编码的蛋白中含有934个氨基酸。MSH6是错配修复家族的重要成员之一，DNA全长23806bp，cDNA长4200bp，主要作用是纠正碱基错配以及小片段插入和缺失。当DNA发生错配时，MSH6蛋白与MSH2蛋白结合生成能对错配位点进行识别的MutS-α异二聚体，该二聚体与错配位点结合后启动错配修复过程，从而保证微卫星稳定性，将细胞内基因的自发突变率控制在较低水平，使基因组遗传的稳定性和真实性得到保障。MSH2蛋白几乎出现于所有结肠正常粘膜，阳性率达94％。阳性产物定位于核内，部分细胞同时出现胞浆染色。阳性细胞分布于粘膜全层，以腺窝下13-23中排列更为密集。杯装细胞中偶见MSH2蛋白的表达。MSH2蛋白也表达在间质纤维母细胞、血管内皮细胞以及淋巴细胞上，呈核型或核浆型，但浆细胞内表达较少。MSH2基因的突变与微卫星不稳定性和一些癌症有关，研究发现MSH2基因蛋白阳性表达率从正常组织、腺瘤不典型增生、腺瘤癌变到腺癌逐渐降低，提示在腺瘤阶段已经有MMR的基因的突变或功能异常，并随其恶性程度的增加，MMR基因的突变频率也逐渐升高。表明MMR基因的突变，尤其是MSH2的突变可能是结直肠癌发生的早期事件之一。其中遗传性非息肉病性结直肠癌HNPCC一种特殊类型的结直肠癌。遗传性非息肉病性结直肠癌HNPCC，有时称为Lynch综合征，以常染色体显性遗传方式遗传，其中仅突变错配修复基因的一个拷贝的遗传就足以引起疾病表型，约占结直肠癌总数的15％～18％，占家族性结直肠癌的50％。MSH2基因的突变占该疾病相关基因改变的40％，与HNPCC相关的突变广泛分布在MSH2的所有结构域中，并且是MLH1突变的主要原因。另外MSH2和其他错配修复基因的突变也会导致DNA损伤未修复，导致突变频率增加。发明内容发明人提供了一种抗MSH2蛋白单克隆抗体，所述单克隆抗体重链和轻链可变区的氨基酸序列分别是SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示的氨基酸序列。进一步地，所述单克隆抗体重链和轻链可变区氨基酸序列分别是SEQIDNO.4和SEQIDNO.5所示的核苷酸序列所编码。进一步地，所述单克隆抗体特异性识别MSH2蛋白。进一步地，所述单克隆抗体特异性识别中SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。进一步地，所述单克隆抗体由保藏号为CGMCCNO.17405的杂交瘤细胞系产生。所述细胞株为小鼠杂交瘤细胞系1B11-14-16，分类命名为：小鼠杂交瘤细胞系，该细胞系已于2019年03月21日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。进一步地，所述抗MSH2蛋白为小鼠IgG2b亚型单克隆抗体。发明人还提供了一种抗MSH2蛋白单克隆抗体的制备方法，选取MSH2蛋白氨基酸序列第919位至第934位氨基酸在其N端添加巯基修饰并与载体蛋白KLH进行偶联作为免疫原。发明人还提供了一株分泌抗MSH2蛋白的杂交瘤细胞系，所述细胞株为小鼠杂交瘤细胞系1B11-14-16，所述细胞系保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCCNO.17405。发明人还提供上述任一所述的抗MSH2蛋白单克隆抗体，在MSH2蛋白免疫检测中的用途。进一步地，所述免疫检测包括免疫组织化学法，免疫印迹法和酶联免疫法。区别于现有技术，上述技术方案依据MSH2蛋白与DNA结合的结构、抗原性、组成氨基酸的亲疏水性以及二级结构，选择具有区别于其他类似蛋白、长度适宜且具有特殊抗原性的氨基酸序列第919-934位蛋白SEQIDNo.1，区域作为抗原肽。在N端添加巯基修饰并偶联KLH，作为免疫源CKLH-NSFVNEIISRIKVTT-Cys。对小鼠进行免疫，经细胞融合、筛选和亚克隆，获得高效分泌抗MSH2蛋白单克隆抗体的单克隆细胞系1B11-14-16,以及由该细胞系所分泌的抗MSH2蛋白单克隆抗体。本方案得到的抗体具有高特异性、敏感性，可以特异性识别表达MSH2蛋白的细胞，适用于免疫学检测，特别是免疫组化检测。附图说明图1：MSH2纯化后单抗的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。图2：MSH2单抗检测人PD-1蛋白的免疫印迹图。图3：为结直肠癌组织免疫组化染色结果图左为1B11-14-16的MSH2，右为市售MSH2。图4：为膀胱癌组织免疫组化染色结果图左为1B11-14-16的MSH2，右为市售MSH2。图5：为扁桃体组织免疫组化染色结果图左为1B11-14-16的MSH2，右为市售MSH2。图6：为阑尾组织免疫组化染色结果图左为1B11-14-16的MSH2，右为市售MSH2。具体实施方式实施例1重组MSH2蛋白片段的制备一、基因克隆从Uniprot数据库http:www.uniprot.org中选择编号P43246的MSH2蛋白序列作为标准序列。依据其与DNA结合的结构、抗原性、组成氨基酸的亲疏水性以及二级结构，选择具有区别于其他类似蛋白、长度适宜且具有特殊抗原性的区域作为抗原肽。选定MSH2氨基酸序列第919位至第934位序列，其对应的核苷酸序列为SEQIDNo.1。合成以上MSH2蛋白，在其N端添加巯基修饰并与载体蛋白KLH偶联，提高其免疫原性，作为免疫原备用。实施例21B11-14-16杂交瘤细胞系的建立一、免疫将实施例1中获得的MSH2蛋白-KLH偶联物稀释至1mgmL，然后与等体积的完全弗氏佐剂CFA,Sigma公司混合乳化，对18-20g的Balbc小鼠购自福州吴氏实验动物进行腹部注射免疫，注射剂量为50μg只。此后每14天加强免疫一次，抗原使用弗氏非完全佐剂IFA,Sigma公司乳化，剂量为25μg只。第2次加强免疫后14天以间接ELISA波长450nm检测小鼠血清中抗免疫原的多抗效价，效价最高的小鼠以尾静脉注射冲击免疫，抗原用PBS溶液混匀，剂量为50μg只。二、细胞融合无菌制备免疫达标的小鼠脾细胞悬液，与小鼠骨髓瘤细胞sp20ATCC以5:1比例混合，1000rpm离心10min，弃上清后，在1分钟内由慢到快加入1mL预热至37℃的PEGSigma公司溶液，加入过程中需轻轻转动离心管，使细胞与PEG充分接触。室温静置90s后，2min内由慢到快加入4mL预热至37℃的无血清DMEMHyclone公司培养基，随后的2min内再加入10mL预热无血清DMEM培养基，最后2min内加完剩余的预热无血清DMEM培养基，定容至50mL，整个加入过程需要缓慢摇动离心管，确保混合均匀，减轻对细胞的伤害。室温静置10min后离心1000rpm，5min，弃上清，用10-20mLHATSigma公司培养基重悬细胞，并用HAT培养基稀释至终浓度为0.5×106cellsmL，所有溶液转移至96孔板中，200μL孔，并做好标记。将96孔培养板小心转移至37℃，5％CO2培养箱中培养。定期检查细胞的生长状态及潜在的污染，注意尽量少开合培养箱，确保培养环境稳定。融合后第5天，向培养板中补加HAT培养基，50μL孔。三、ELISA筛选阳性杂交瘤细胞当融合细胞直径长至大概为1-2mm时，吸取50-200μL培养液上清进行首次细胞筛选ELISA、IHC-P及其他方法检测，同时往培养孔中补加HAT培养基至200μL。ELISA检测该培养液上清，将检测得到阳性结果的培养孔内细胞培养液全部转移至24孔培养板，补加HT培养基，2mL孔，培养3天。重复筛选24孔板中各细胞株，剔除不是阳性结果的培养孔细胞，获得阳性结果较好的培养孔细胞。将这些24孔培养板得到的阳性孔细胞采用有限稀释法进行亚克隆筛选，即将有限稀释法得到细胞液加入96孔培养板中转移至CO2培养箱培养11天，待克隆细胞直径为1-2mm时，重复进行细胞筛选。根据检测结果，每个亚克隆细胞株，选取4个生长良好的单克隆阳性培养孔，并转移至24孔板中继续培养。一段时间后再次筛选24孔板中克隆得到的阳性克隆细胞株，即为分泌特定单克隆抗体的杂交瘤细胞株1B11-14-16。将此细胞株转入T-75培养瓶中扩增至对数生长期保种或进行后续实验。实施例3腹水诱生法制备单克隆抗体一、腹水制备将细胞株培养至对数生长期后用无血清培养基洗涤并重悬，计数2×106个mL。悬浮的细胞溶液腹腔注射事先用石蜡油致敏10天的BALBC小鼠，每只小鼠注射0.5mL。饲养小鼠7天后开始采集腹水。收集的腹水于4℃、8000rpm离心10min，吸取上清溶液收集于离心管中，即为腹水，4℃或-20℃保存。二、单克隆抗体的纯化用rProteinAsepharoseFastFlowGE公司亲和层析柱从腹水中纯化抗体主要分为：①装柱，将购买的ProteinA填料适量装于重力层析柱中用平衡缓冲液0.1MTris溶液，pH7.0冲洗至平衡；②上样，将经过0.22μm滤膜过滤的腹水加入装好的层析柱中，控制流速1滴秒；③平衡，上完样液后使用平衡缓冲液冲洗至平衡；④洗脱，加入洗脱缓冲液0.1M柠檬酸溶液，pH4.5冲洗柱子并收集洗脱液；⑤再生，洗脱完成后加入平衡缓冲液冲洗柱子至平衡，2倍柱体积的20％乙醇冲洗后置于4℃保存。最后采用SDS-PAGE法鉴定抗体纯度,如图1MSH2单克隆抗体的聚丙烯酰胺凝胶电泳图所示，抗体纯度达到95％以上。紫外微量分光光度计法测定抗体浓度,浓度达到2.7mgmL以上。实施例4单克隆抗体特性鉴定一、亚型鉴定将细胞上清稀释成1μgmL包被酶标板,每孔加100μL，4℃包被过夜，倾空液体，用含0.05％Tween的PBSPBS-T洗板3次，每孔加入200μL封闭液含2％BSA的PBS-T溶液，37℃孵育1h。倾空液体，用PBS-T清洗3次。每孔加入稀释5倍的0.1mL杂交瘤细胞株培养液上清，37℃孵育1h。倾空液体，用PBS-T清洗3次。用封闭液1：400稀释HRP标记的羊抗鼠κ,λ，IgM，IgG1，IgG2b，IgG2b，IgG3，IgA抗体SouthernBiotech公司，每孔分别加入0.1mL，37℃孵育1h。倾空液体，用PBS-T清洗3次。每孔加100μLTMB湖州英创生物科技有限公司底物A、B等体积混合溶液进行显色,室温反应15min，每孔加入50μL1NHCl溶液终止显色反应，然后酶标仪测定450nm波长下的OD值。结果显示，本发明单克隆抗体为IgG2b型鼠源单克隆抗体。二、亲和常数测定包被MSH2蛋白，包被浓度为100μgml,100μl孔，4℃包被过夜，PBS-T洗3次。每孔加200μl封闭液37℃封闭1h，PBS-T洗3次。实施例4中纯化的单克隆抗体，稀释成以下浓度单位：ngmL：2000、500、125、62.5、31.25、15.625、3.125、0.625，37℃孵育1h，PBS-T洗3次。HRP标记的羊抗鼠二抗1：5000稀释，每孔100μl，37℃孵育1h，PBS-T洗3次。每孔加入100μlTMB湖州英创生物科技有限公司显色液，显色13min，加100μl1.0N盐溶液终止反应。用酶标仪测定波长450nm的吸光值。画出OD值对应抗体稀释倍数的曲线，找出12“平台OD值”对应的抗体浓度A。利用下列公式计算出亲和常数为2.16L×mol-1。三、单抗反应特异性和应用效果选择免疫原溶液，用免疫印迹的方法检测本发明的单克隆抗体的识别特异性，对MSH2蛋白-KLH偶联物进行12.5％的聚丙烯酰胺凝胶电泳。然后用常规湿转法将凝胶蛋白转移到PVDF膜。将膜置于5％BSA-TBST溶液中蛋白面朝下，于37℃摇床封闭1h，以消除非特异性背景。封闭结束后用TBST洗掉5％BSA-TBST，加入本发明制备的MSH2的单克隆抗体，于脱色摇床摇荡孵育1h。用TBST洗膜后，加入二抗，于脱色摇床孵育1h，使二抗与一抗充分结合。再次用TBST洗膜，加入ECL显色试剂盒，实验结果如图2所示。MSH2免疫原在MSH21B11-14-16单克隆抗体、HCT8细胞裂解液及Biu-87细胞裂解液上显示明确阳性条带，条带单一且颜色较深，说明抗体与抗原的特异性反应明显。而在MSH2阴性表达的SP2-0细胞裂解液上无目的条带。实施例6组织芯片染色和鉴定一、组织蜡块制备过程对样本组织进行HE切片染色，以确定肿瘤病变部位。对病变位点画圈，预备打孔。制作受体蜡块时，将塑料架置于模具上，将融化的石蜡熔点在56～58℃倒入模具，将组织块放入模具中的蜡液中后再加入适量蜡液使组织块完全包埋在蜡液中，冷却至室温后将模具放入-20℃冰箱6min，将蜡块从模具中取出，切片或放入4℃冰箱内保存备用。修片后进行连续切片，厚度定为4μm，将连续切片漂40％酒精中,让其自然展开，再将分开的切片转移到45℃的温水中展片30秒，用经2％APES丙酮液处理过的载玻片裱贴切片，将制成的组织芯片放入60℃烤箱内烤片2小时，取出室温冷却，放入-4℃冰箱保存。二、IHC染色及分析常规二甲苯脱蜡3次，每次6分钟，100％、100％、95％、95％、85％梯度乙醇中水化，每次3分钟，最后自来水冲洗。进行抗原修复，然后将切片放入湿盒中，PBS冲洗3×3分钟。滴加3％H2O2孵育10分钟，PBS冲洗3×3分钟。甩去PBS，滴加过氧化物酶阻断剂室温孵育10分钟。甩干切片，滴加适当比例稀释的一抗首次稀释根据抗体浓度来设计抗体的稀释比例室温25℃孵育1小时，PBS冲洗3×3分钟，滴加二抗室温孵育30分钟，PBS冲洗3×3分钟，甩去PBS，用新鲜配置的DAB显色液显色3-10分钟。苏木素复染20秒，PBS返蓝。按照85％3分钟、95％3分钟、95％3分钟、100％3分钟、100％3分钟的酒精梯度依次脱水，最后两次二甲苯透明10分钟，中性树胶封片。免疫组化染色结果分为：阳性和阴性。阳性表达必须在细胞和组织特定的抗原部位才能视为阳性。在组织染色分布清晰及细胞定位准确的情况下，染色结果根据染色强度的差异进行进一步划分，具体如下：1、样本为弱阳性；标记为“+”；2、样本为中度阳性；标记为“++”；3、样本为高度阳性；标记为“+++”。4、样本为阴性，标记为“-”。三、样本检测结果：用抗MSH2蛋白单克隆抗体1B11-14-16和对照抗体-市售抗MSH2蛋白单克隆抗体鼠单抗G219-1129在52例结直肠癌、34例前列腺癌、29例膀胱癌、47例胃癌上进行同步检测，结果如下表所示。结果显示:抗MSH2蛋白单克隆抗体1B11-14-16的染色定位准确，染色清晰且无非特异性染色，背景干净，说明抗MSH2蛋白单克隆抗体1B11-14-16特异性强。而部分病例中，使用抗MSH2蛋白单克隆抗体1B11-14-16的阳性细胞数和阳性强度高于使用对照试剂，说明抗MSH2蛋白单克隆抗体1B11-14-16的敏感性和亲和力高于市售抗体。而用抗MSH2蛋白单克隆抗体1B11-14-16和对照抗体-市售抗MSH2蛋白单克隆抗体鼠单抗G219-1129，在包括30种正常组织的组织芯片上进行同步检测，样本阳性和阴性结果一致，说明本抗体在正常组织的特异性同市售抗体相当。30种正常组织包括：大脑、心脏、小脑、食管、肾上腺、胃、卵巢、小肠、胰腺、结直肠、甲状旁腺、肝脏、垂体、唾液腺、睾丸、肾、甲状腺、前列腺、乳腺、子宫、脾、膀胱、扁桃体、骨骼肌、胸腺幼儿、皮肤、骨髓、外周神经、肺、间皮细胞。图3为结直肠癌组织免疫组化染色结果图左为1B11-14-16的MSH2，右为市售MSH2。其中，1B11-14-16的MSH2的染色的阳性细胞数和阳性强度明显高于市售MSH2的染色强度，说明其敏感度更高。图4为膀胱癌组织免疫组化染色结果图左为1B11-14-16的MSH2，右为市售MSH2。其中，1B11-14-16的MSH2的染色的阳性强度明显高于市售MSH2的染色强度，说明其敏感度更高。图5为扁桃体组织免疫组化染色结果图左为1B11-14-16的MSH2，右为市售MSH2。其中，1B11-14-16的MSH2的染色的阳性强度明显高于市售MSH2的染色强度，说明其敏感度更高。图6为阑尾组织免疫组化染色结果图左为1B11-14-16的MSH2，右为市售MSH2。其中，1B11-14-16的MSH2的染色的阳性细胞数明显高于市售MSH2的染色强度，说明其敏感度更高。序列表福州迈新生物技术开发有限公司抗MSH2蛋白单克隆抗体、细胞系及其制备方法和应用105SIPOSequenceListing1.0115PRT智人Homosp1AsnSerPheValAsnGluIleIleSerArgIleLysValThrThr1510152133PRT人工序列Artificial2MetGluTrpThrTrpValPheLeuPheLeuLeuSerValThrAlaGly151015ValHisSerGlnValGlnLeuGlnGlnSerGlyAlaGluLeuMetLys202530ProGlyAlaSerValArgIleSerCysLysAlaThrGlyTyrThrPhe354045ThrArgTyrTrpIleGluTrpValLysGluArgProGlyHisGlyLeu505560GluTrpIleGlyGluIleLeuProGlySerGlyGlyThrAsnTyrAsn65707580GluLysPheLysGlyLysAlaThrPheThrAlaAspThrSerSerAsn859095ThrValHisMetGlnLeuAsnSerLeuThrSerGluAspSerAlaVal100105110TyrTyrCysValLysArgGluGlyProTyrTrpGlyArgGlyThrLeu115120125ValThrValSerAla1303131PRT人工序列Artificial3MetLysLeuProValArgLeuLeuValLeuMetPheTrpIleProVal151015SerSerSerAspValLeuMetThrGlnThrProLeuSerLeuProVal202530SerLeuGlyAspGlnAlaSerIleSerCysArgSerSerGlnSerIle354045ValTyrArgThrGlySerThrPheLeuGluTrpTyrLeuGlnLysPro505560GlyGlnSerProLysLeuLeuIleTyrLysValSerAsnArgPheSer65707580GlyValProAspArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThr859095LeuLysIleSerArgValGluAlaGluAspLeuGlyValTyrTyrCys100105110PheGlnGlySerHisLeuProTyrThrPheGlyGlyGlyThrLysLeu115120125GluIleLys1304399DNA人工序列Artificial4atggaatggacctgggtctttctcttcctcctgtcagtaactgcaggtgtccactcccag60gttcagctccaacagtctggagctgaactgatgaagcctggggcctcagtgaggatatcc120tgcaaggctactggctacacattcactaggtactggatagagtgggtaaaagagaggcct180ggacatggccttgagtggattggagagattttacctggaagtggtggtactaactacaat240gagaaattcaagggcaaggccacattcactgcagatacatcctccaacacagtccacatg300caactcaacagcctgacatcggaagactctgccgtctattactgtgtaaagagagagggt360ccctactggggccgagggactctggttactgtctctgca3995393DNA人工序列Artificial5atgaagttgcctgttaggctgttggtgctgatgttctggattcctgtttcctccagtgat60gttttgatgacccaaactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatc120tcttgcagatctagtcagagtattgtatataggactggaagcacctttttagaatggtac180ctgcagaaaccaggccagtctccaaagctcctgatctacaaagtttccaaccgattttct240ggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatcagc300agagtggaggctgaggatctgggagtttattactgctttcaaggttcacatcttccgtac360acgttcgggggggggaccaagctggaaataaaa393

权利要求：1.一种抗MSH2蛋白单克隆抗体，其特征在于,所述单克隆抗体重链和轻链可变区的氨基酸序列分别是SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于,所述单克隆抗体重链和轻链可变区氨基酸序列分别是SEQIDNO.4和SEQIDNO.5所示的核苷酸序列所编码。3.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体特异性识别MSH2蛋白。4.根据权利要求3所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体特异性识别MSH2蛋白中SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。5.一种抗MSH2蛋白单克隆抗体，由保藏号为CGMCCNO.17405的杂交瘤细胞系产生。6.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于,所述抗MSH2蛋白为小鼠IgG2b亚型单克隆抗体。7.一种抗MSH2蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，选取MSH2蛋白氨基酸序列第919位至第934位氨基酸,在其N端添加巯基修饰并与载体蛋白KLH进行偶联作为免疫原。8.一株分泌抗MSH2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系，所述细胞系为小鼠杂交瘤细胞系1B11-14-16，所述细胞系保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCCNO.17405。9.权利要求1-6任一所述的抗MSH2蛋白单克隆抗体，在MSH2蛋白免疫检测中的用途。10.根据权利要求9所述的免疫检测，其特征在于，所述免疫检测包括免疫组织化学法，免疫印迹法和酶联免疫法。

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