申请/专利权人：中国水产科学研究院黑龙江水产研究所

申请日：2019-05-31

公开（公告）日：2022-11-18

公开（公告）号：CN110042169B

主分类号：C12Q1/6888

分类号：C12Q1/6888;C12N15/11

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2022.11.18#授权;2019.08.16#实质审查的生效;2019.07.23#公开

摘要：本发明公开了一种黑龙江茴鱼群体特异性分子标记引物、试剂盒及鉴定方法，引物为ThtC1010、ThtC1029、ThtC1034；其中，ThtC1010引物序列如SEQIDNO.1‑2所示，ThtC1029引物序列如SEQIDNO.3‑4所示，ThtC1034引物序列如SEQIDNO.5‑6所示。本发明是国内外首次基于分子生物学技术原理建立的区分黑龙江茴鱼群体的新方法，是在黑龙江茴鱼EST数据的基础上，成功开发了EST‑SSR标记，并用部分标记对黑龙江茴鱼的群体的遗传背景进行分析，找到了能够区分3个群体的特异性标记，其中THC1010位点和THC1029位点能够准确区分根河群体与其他两个群体，THC1034位点能将三个群体区分开，具有准确性高，技术重现性好，性价比高的优势。

主权项：1.一种黑龙江茴鱼群体特异性分子标记引物，其特征在于，引物为ThtC1010、ThtC1029、ThtC1034；其中，ThtC1010的上游引物序列如SEQIDNO.1所示，下游引物序列如SEQIDNO.2所示，ThtC1029的上游引物序列如SEQIDNO.3所示，下游引物序列如SEQIDNO.4所示，ThtC1034的上游引物序列如SEQIDNO.5所示，下游引物序列如SEQIDNO.6所示。

全文数据：一种黑龙江茴鱼群体特异性分子标记引物、试剂盒及鉴定方法技术领域本发明涉及一种黑龙江茴鱼群体特异性分子标记引物、试剂盒及鉴定方法，属于分子生物学技术领域。背景技术黑龙江茴鱼ThymallusarcticusgrubeiDybowski属鲑形目Salmoniformes、茴鱼科Thymallidae、茴鱼属Thymallus，俗称：斑鳟子、红鳞鱼，分布于欧亚大陆，在我国自然分布于黑龙江流域的支流中，肉质细嫩、味道鲜美为黑龙江水系特有的名贵冷水性鱼类。该鱼对环境条件要求苛刻，在自然状态下很难形成大规模群体，更不能形成一定的捕捞量。同时由于环境条件的变化，栖息地渔民在洄游期进行捕捞及兴修水库和水利设施，改变了黑龙江茴鱼的产卵、摄食、越冬环境，对其繁殖和生存造成了极大影响，导致野生资源枯竭。目前黑龙江茴鱼人工繁殖已经取得成功，人工增殖放流正在逐步开展。鱼类种群划分对于鱼类种质资源保护及管理意义重大，只有深入了解黑龙江茴鱼种群的遗传背景及资源状况，弄清群体来源，才能更好地保护黑龙江茴鱼，做好黑龙江茴鱼育种和资源修复工作。分子标记在种质资源多样性研究中有着广泛的应用。DNA水平的多态性主要表现在核苷酸序列的差异，对于任何类型的核苷酸序列的差异都可以用分子标记技术对其进行检测。其中简单重复序列SimpleSequenceRepeats，SSR也称为微卫星DNA，一般是由1～6个核苷酸为重复单位的串联重复DNA序列，具有数量多，揭示多态性高，呈共显性遗传等特点已经被广泛应用在基因定位、指纹图谱构建、遗传图谱构建及种质资源鉴定等研究。本发明通过高通量测序获得黑龙江茴鱼的表达序列标签Expresssequencetag，EST库，挖掘黑龙江茴鱼的EST-SSR标记，分析不同群体黑龙江茴鱼的遗传背景，找到不同群体特有的EST-SSR标记，为进一步分析、种质鉴定和分子标记辅助选择育种等方面提供基础资料。发明内容针对缺少黑龙江茴鱼群体的鉴别方法，本发明的目的是提供一种黑龙江茴鱼群体特异性分子标记引物、试剂盒及鉴定方法，能够准确区分不同流域的黑龙江茴鱼群体。为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种黑龙江茴鱼群体特异性分子标记引物，引物为ThtC1010、ThtC1029、ThtC1034；其中，ThtC1010的上游引物序列如SEQIDNO.1所示，下游引物序列如SEQIDNO.2所示，ThtC1029的上游引物序列如SEQIDNO.3所示，下游引物序列如SEQIDNO.4所示，ThtC1034的上游引物序列如SEQIDNO.5所示，下游引物序列如SEQIDNO.6所示。一种黑龙江茴鱼群体鉴定的试剂盒，包括引物ThtC1010、ThtC1029、ThtC1034。上述试剂盒，还包括2×TaqPCRMix和超纯水。一种用于黑龙江茴鱼群体的鉴定方法，包括以下步骤：1样本采集：采集黑龙江不同流域的茴鱼样本；2基因组DNA提取：采用酚氯仿法提取茴鱼样本DNA；3PCR扩增：以提取的基因组DNA为模板，利用权利要求1的引物进行PCR扩增；4电泳染色对比图谱：PCR反应结束后，取PCR产物电泳检测，根据电泳结果与提供的标准图谱对比，进行鉴定。PCR扩增的反应体系为20μl，各成分为：2×TaqPCRMix10μl、50ngμl基因组DNA2μl、10μM上下游引物各0.5μl，用超纯水补足20μl。PCR扩增的反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，25个循环；72℃最后延伸5min。不同流域为根河、洮儿河和乌苏里江。标准图谱中，引物ThtC1010的PCR扩增产物为A条带的是根河群体；PCR扩增产物为B条带的是洮儿河群体和或乌苏里江群体；引物ThtC1029的PCR扩增产物为C条带的是根河群体；PCR扩增产物为D条带的是洮儿河群体和或乌苏里江群体；引物ThtC1034的PCR扩增产物为E、F和G条带中1个或2个的是根河群体；PCR扩增产物为H条带的是洮儿河群体；PCR扩增产物为I条带或I和H条带的是乌苏里江群体。一种上述引物在黑龙江茴鱼群体种质鉴定中的应用。一种上述引物在黑龙江茴鱼群体分子标记辅助选择育种中的应用。本发明有益效果：本发明是国内外首次基于分子生物学技术原理建立的区分黑龙江茴鱼群体的新方法，是在黑龙江茴鱼EST数据的基础上，成功开发了EST-SSR标记，并用部分标记对黑龙江茴鱼的群体的遗传背景进行分析，找到了能够区分3个群体的特异性标记，其中THC1010位点和THC1029位点能够准确区分根河群体与其他两个群体，具有A109bp、C198bp条带的个体为根河群体，具有B114bp、D184bp条带的个体为洮儿河群体和乌苏里江群体；THC1034位点能将三个群体区分开，具有任意E174bp、F168bp和G164bp条带中1个或2个的个体为根河群体，仅具有H152bp条带的为洮儿河群体，乌苏里江群体除了具有I156bp条带外，部分群体也具有H条带。其中，THC1034一对引物就能将根河群体、洮儿河群体和乌苏里江群体区分开，具有准确性高，技术重现性好，性价比高的优势，可以同时对大量样本进行检测，减少了黑龙江茴鱼种质资源及群体评判的复杂性。附图说明图1为THC1010引物扩增图谱。图2为THC1029引物扩增图谱。图3为THC1034引物扩增图谱。具体实施方式以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。实施例11、引物设计对黑龙江茴鱼RNA进行测序，获得黑龙江茴鱼的EST库，在EST库中查找具有2、3、4、5重复序列的微卫星位点。随机选取50个序列，用Primer3设计引物，引物长度19–25bp，GC含量50–60％。对50对引物筛选发现ThtC1010、ThtC1029和ThtC1034标记具有群体特异性。黑龙江茴鱼群体特异性分子标记引物序列：ThtC1010上游引物：5’-TCAGGTTGTGCAAAATCTCGA-3’SEQIDNO.1下游引物：5’-GGCCAGCAGAACCAGAATCA-3’SEQIDNO.2ThtC1029上游引物：5’-GTGTTTCTTCCTGGCAGGGA-3’SEQIDNO.3下游引物：5’-TGGTGGTTAAGACTCAGAGACC-3’SEQIDNO.4ThtC1034上游引物：5’-TGGTGACACTGAAGAGGGGA-3’SEQIDNO.5下游引物：5’-AGCGTGTTATTACCAGTGCT-3’SEQIDNO.62、样本采集分别采集黑龙江水系松花江西源嫩江右岸最大支流洮儿河野生黑龙江茴鱼、黑龙江额尔古纳河最大的支流之一根河野生黑龙江茴鱼和中国黑龙江支流乌苏里江的野生黑龙江茴鱼鳍条样本，用95％vv乙醇保存。3、基因组DNA提取采用酚氯仿法提取上述不同群体的黑龙江茴鱼DNA，稀释50ngμl备用。4、PCR扩增反应反应体系为20μl，各成分为：2×TaqPCRMix10μl、50ngμl基因组DNA2μl、10μM上下游引物各0.5μl，用超纯水补足20μl。反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，25个循环；72℃最后延伸5min。5、电泳染色对比图谱PCR反应结束后，取1.5μlPCR产物用8％的非变性聚丙烯凝胶电泳检测，220V，电泳3h，银染、拍照记录。根据电泳结果与提供的标准图谱对比，进行鉴定。标准图谱中，引物ThtC1010的PCR扩增产物为A条带109bp的是根河群体；PCR扩增产物为B条带114bp的是洮儿河群体和或乌苏里江群体图1；引物ThtC1029的PCR扩增产物为C条带198bp的是根河群体；PCR扩增产物为D条带184bp的是洮儿河群体和或乌苏里江群体图2；引物ThtC1034的PCR扩增产物为E174bp、F168bp和G164bp条带中1个或2个的是根河群体；PCR扩增产物为H条带152bp的是洮儿河群体；PCR扩增产物为I条带156bp或I和H条带的是乌苏里江群体图3。实施例2采集根河茴鱼20尾、洮儿河茴鱼20尾和乌苏里江茴鱼26尾的鳍条样本，利用实施例1的鉴定方法，进行鉴定。根据电泳结果与提供的标准图谱对比，发现引物ThtC1010根河群体20尾茴鱼的扩增条带大小与A相同109bp，洮儿河群体20尾茴鱼和乌苏里江群体26尾茴鱼的扩增条带大小与B相同114bp；引物ThtC1029根河群体20尾茴鱼的扩增条带大小与C相同198bp，洮儿河群体20尾茴鱼和乌苏里江群体26尾茴鱼的扩增条带大小与D相同184bp；引物ThtC1034根河群体扩增条带大小与E、F和G相同分别为174bp、168bp和164bp，其中5尾具有E条带，4尾具有E和F条带，5尾具有F条带，剩余6尾具有F和G条带，洮儿河群体20尾茴鱼的扩增条带大小与H相同152bp，乌苏里江群体26尾茴鱼均具有I条带156bp，其中10尾茴鱼同时存在H条带152bp。引物ThtC1010和引物ThtC1029能将根河群体与其他两个群体，正确率达100％；引物ThtC1034能将三个群体区分开，正确率为100％。序列表中国水产科学研究院黑龙江水产研究所一种黑龙江茴鱼群体特异性分子标记引物、试剂盒及鉴定方法6SIPOSequenceListing1.0121DNA人工序列1tcaggttgtgcaaaatctcga21220DNA人工序列2ggccagcagaaccagaatca20320DNA人工序列3gtgtttcttcctggcaggga20422DNA人工序列4tggtggttaagactcagagacc22520DNA人工序列5tggtgacactgaagagggga20620DNA人工序列6agcgtgttattaccagtgct20

权利要求：1.一种黑龙江茴鱼群体特异性分子标记引物，其特征在于，引物为ThtC1010、ThtC1029、ThtC1034；其中，ThtC1010的上游引物序列如SEQIDNO.1所示，下游引物序列如SEQIDNO.2所示，ThtC1029的上游引物序列如SEQIDNO.3所示，下游引物序列如SEQIDNO.4所示，ThtC1034的上游引物序列如SEQIDNO.5所示，下游引物序列如SEQIDNO.6所示。2.一种黑龙江茴鱼群体鉴定的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括2×TaqPCRMix和超纯水。4.一种用于黑龙江茴鱼群体的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：1样本采集：采集黑龙江不同流域的茴鱼样本；2基因组DNA提取：采用酚氯仿法提取茴鱼样本DNA；3PCR扩增：以提取的基因组DNA为模板，利用权利要求1的引物进行PCR扩增；4电泳染色对比图谱：PCR反应结束后，取PCR产物电泳检测，根据电泳结果与提供的标准图谱对比，进行鉴定。5.根据权利要求4所述的鉴定方法，其特征在于，PCR扩增的反应体系为20μl，各成分为：2×TaqPCRMix10μl、50ngμl基因组DNA2μl、10μM上下游引物各0.5μl，用超纯水补足20μl。6.根据权利要求4所述的鉴定方法，其特征在于，PCR扩增的反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，25个循环；72℃最后延伸5min。7.根据权利要求4所述的鉴定方法，其特征在于，不同流域为根河、洮儿河和乌苏里江。8.根据权利要求7所述的鉴定方法，其特征在于，标准图谱中，引物ThtC1010的PCR扩增产物为A条带的是根河群体；PCR扩增产物为B条带的是洮儿河群体和或乌苏里江群体；引物ThtC1029的PCR扩增产物为C条带的是根河群体；PCR扩增产物为D条带的是洮儿河群体和或乌苏里江群体；引物ThtC1034的PCR扩增产物为E、F和G条带中1个或2个的是根河群体；PCR扩增产物为H条带的是洮儿河群体；PCR扩增产物为I条带或I和H条带的是乌苏里江群体。9.一种如权利要求1所述的引物在黑龙江茴鱼群体种质鉴定中的应用。10.一种如权利要求1所述的引物在黑龙江茴鱼群体分子标记辅助选择育种中的应用。

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