申请/专利权人：南方医科大学皮肤病医院(广东省皮肤病医院、广东省皮肤性病防治中心、中国麻风防治研究中心)

申请日：2020-12-16

公开（公告）日：2022-12-02

公开（公告）号：CN112746074B

主分类号：C12N15/113

分类号：C12N15/113;C12N15/85;C12N15/65;C12N5/10;C12N15/90;C12N5/071

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2022.12.02#授权;2021.05.21#实质审查的生效;2021.05.04#公开

摘要：本发明公开了Keratin5‑IRES‑eGFP敲入的hESCs细胞系的构建及诱导分化方法。具体方法为：构建sgRNA质粒，根据sgRNA切割位点构建打靶Doner载体，将cas9质粒，sgRNA质粒，打靶Doner载体共电转至hESCs细胞，得到初步阳性单克隆细胞系后电转表达cre酶的质粒，通过PCR跑胶和测序得到最终Keratin5‑IRES‑eGFP敲入的hESCs细胞系。诱导分化hESCs细胞为角质形成细胞从而得到Keratin5阳性的基底层角质形成细胞。该细胞系的建立有利于筛选出Keratin5阳性的基底层角质形成细胞，从而为临床上表皮基底角质形成细胞异常的皮肤病研究提供细胞模型。

主权项：1.一种诱导Keratin5-IRES-eGFP敲入的hESCs细胞分化为基底层角质形成细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）构建sgRNA质粒，针对目的基因Keratin5的终止密码子下游设计并合成相应的sgRNA，室温退火后连入经BsmbI单酶切的pU6-EFsgRNA2.1scaffold载体，筛选后获得sgRNA质粒，确定最高切割活性的sgRNA质粒，sgRNA的DNA序列如SEQIDNO.1所示；（2）构建靶向Keratin5基因的打靶Donor载体Keratin5-IRES-eGFP-LoxP-neo，将Keratin5Arm1和Keratin5Arm2克隆至Donor载体中，得到带有同源臂的Donor质粒，再将IRE-eGFP连至带有同源臂的Donor质粒中，得到打靶Donor载体，为Keratin5-IRES-eGFP-LoxP-neo；上游同源臂Keratin5Arm1的DNA序列如SEQIDNO.2所示，下游同源臂的Keratin5Arm2的DNA序列如SEQIDNO.3所示，IRES-eGFP的DNA序列如SEQIDNO.4所示；（3）将sgRNA质粒,cas9质粒，打靶Donor载体共电转至hESCs细胞，待细胞系稳定后，用1μgml的嘌呤霉素筛选2天，培养至细胞系稳定，通过有限稀释法将80个克隆铺于96孔板中，培养半个月后，将挑取的单克隆细胞至24孔板进行培养后，收取细胞提取基因组DNA，随后进行PCR测序初步筛出阳性单克隆并命名为Keratin5-IRES-eGFP#3；（4）将初步鉴定为阳性单克隆细胞Keratin5-IRES-eGFP#3培养至稳定后，电转的方法转入表达Cre酶的质粒，即是pCMV-cre质粒，培养至细胞系稳定，通过有限稀释法将80个克隆铺于96孔板中，培养半个月后，将挑取的单克隆细胞至24孔板进行培养后，收取细胞提取基因组DNA，随后进行PCR测序筛出阳性克隆，将阳性单克隆细胞命名为Keratin5-IRES-eGFP#3-16；（5）在分化前3天，将得到的Keratin5-IRES-eGFP#3-16细胞系铺在Matrigel包被的六孔板中培养，其中加入的培养液为ES培养基，在第0天时，将hESCs细胞移至I型胶原蛋白包被的12孔板上培养，用含有RA和BMP4的DMEMF12的培养基维持培养，在第8-15天，用含有RA和BMP4的KSFM培养基培养，第15天后，采用含BMP4的KSFM的培养基，持续培养至第30天，此时将hESCs诱导成为表达绿色荧光蛋白的基底层角质形成细胞。

全文数据：

权利要求：

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