申请/专利权人：山西大学

申请日：2019-05-07

公开（公告）日：2023-03-10

公开（公告）号：CN110101850B

主分类号：A61K38/44

分类号：A61K38/44;A61P9/10;A23L33/185

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2023.03.10#授权;2019.09.03#实质审查的生效;2019.08.09#公开

摘要：本发明公开了谷糠过氧化物酶在制备预防和治疗动脉粥样硬化产品中的应用。实验证明，谷糠过氧化物酶可以有效调控人主动脉平滑肌细胞的表型由合成型向收缩型转变；可以显著抑制人主动脉平滑肌细胞迁移；可以显著抑制人主动脉平滑肌细胞吞噬脂质；可以显著抑制人单核巨噬细胞吞噬脂质；可以减少主动脉病变和升高高密度脂蛋白胆固醇，来抑制小鼠体内动脉粥样硬化的发生；进而预防和治疗动脉粥样硬化。以谷糠过氧化物酶为主要成分可以用来制备预防和或治疗动脉粥样硬化的功能食品或药品等产品。

主权项：1.谷糠过氧化物酶在制备预防和或治疗动脉粥样硬化药品中的应用；所述的谷糠过氧化物酶通过包括以下步骤的方法制备得到：第一步：取谷糠，粉碎后，加入预冷的蛋白提取液，4℃下浸泡并搅拌12-16小时，离心后取上清液，即为谷糠蛋白粗提液；所述的蛋白提取液为20mmolLTris-HCl溶液，含0.85%NaCl，1mmolLPMSF，pH8.0；所述的谷糠和蛋白提取液的重量体积比为1︰4-6，其中重量的单位为g，体积的单位为mL；第二步：在谷糠蛋白粗提液中加入2-3倍体积的-20℃预冷的丙酮，沉淀蛋白1-2小时，离心，收集沉淀，在-20℃下放置，使丙酮完全挥发，冷冻干燥，得到谷糠粗蛋白；第三步：将谷糠粗蛋白用pH8.0、20mmolLTris-HCl缓冲液溶解，离心后取上清液，按0℃下硫酸铵溶液饱和度计算表，先加入硫酸铵粉末，达到30%饱和度，充分搅拌溶解后，静置，离心，收集上清液，再向上清液中加入硫酸铵粉末，达到85%饱和度，充分搅拌溶解后，静置，离心，收集沉淀，用pH8.0、20mmolLTris-HCl缓冲液溶解、透析、浓缩即得到谷糠过氧化物酶粗蛋白；第四步：将谷糠过氧化物酶粗蛋白用pH8.0、20mmolLTris-HCl缓冲液溶解，过Q阴离子交换层析柱，紫外检测仪于280nm波长处检测，收集穿透峰；第五步：将上述穿透液过SP-阳离子柱交换层析柱，用含0.1molLNaCl的pH8.0、20mmolLTris-HCl缓冲液洗脱，紫外检测仪于280nm波长处检测，收集洗脱峰得到谷糠过氧化物酶。

全文数据：谷糠过氧化物酶在制备预防和治疗动脉粥样硬化产品中的应用技术领域本发明涉及谷糠过氧化物酶的新用途，具体涉及谷糠过氧化物酶在制备预防和或治疗动脉粥样硬化功能食品或药品中的应用。背景技术动脉粥样硬化Atherosclerosis,AS是引起心脑血管疾病最主要的原因，而全球每年死于心脑血管疾病人数居于各种死因首位。胆固醇代谢异常、主动脉平滑肌细胞HASMC形态转变，迁移以及吞噬脂质；单核巨噬细胞THP-1吞噬脂质等是动脉粥样硬化形成过程中重要因素。目前临床上对于动脉粥样硬化的治疗主要以他汀类药品为主，该类药品副作用较多，因此，从天然产物中开发预防和或治疗动脉粥样硬化功能食品或药品等产品尤为重要。谷子学名：Setariaitalica属一年禾本科黍族狗尾草属，起源于我国的黄河流域，是华北地区的主要特产之一。谷子脱壳后即为小米，其脱下的壳就是谷糠。中国专利ZL201210084160.X公开了一种谷糠抗肿瘤活性蛋白即谷糠过氧化物酶，命名为：FMBP及其制备方法，以及该蛋白在制备抗肿瘤药物和保健食品中的应用。但将该蛋白用于预防和或治疗动脉粥样硬化没有研究和报道。发明内容本发明的目的在于提供谷糠过氧化物酶的新用途，具体提供谷糠过氧化物酶在制备预防和或治疗动脉粥样硬化功能食品或药品中的应用。本发明提供的谷糠过氧化物酶在制备预防和或治疗动脉粥样硬化的功能食品或药品中的应用，所述谷糠过氧化物酶可按照中国专利ZL201210084160.X公开的方法制备得到。谷糠过氧化物酶的制备步骤：第一步：取谷糠，粉碎后，加入预冷的蛋白提取液，4℃下浸泡并搅拌12-16小时，离心后取上清液，即为谷糠蛋白粗提液；所述的蛋白提取液为20mmolLTris-HCl溶液，含0.85％NaCl，1mmolLPMSF，pH8.0；所述的谷糠和蛋白提取液的重量体积比为1︰4-6，其中重量的单位为g，体积的单位为mL；第二步：在谷糠蛋白粗提液中加入2-3倍体积的-20℃预冷的丙酮，沉淀蛋白1-2小时，离心，收集沉淀，在-20℃下放置，使丙酮完全挥发，冷冻干燥，得到谷糠粗蛋白；第三步：将谷糠粗蛋白用pH8.0、20mmolLTris-HCl缓冲液溶解，离心后取上清液，按0℃下硫酸铵溶液饱和度计算表，先加入硫酸铵粉末，达到30％饱和度，充分搅拌溶解后，静置，离心，收集上清液，再向上清液中加入硫酸铵粉末，达到85％饱和度，充分搅拌溶解后，静置，离心，收集沉淀，用pH8.0、20mmolLTris-HCl缓冲液溶解、透析、浓缩即得到谷糠过氧化物酶粗蛋白；第四步：将谷糠过氧化物酶粗蛋白用pH8.0、20mmolLTris-HCl缓冲液溶解，过Q阴离子交换层析柱，紫外检测仪于280nm波长处检测，收集穿透峰；第五步：将上述穿透液过SP-阳离子柱交换层析柱，用含0.1molLNaCl的pH8.0、20mmolLTris-HCl缓冲液洗脱，紫外检测仪于280nm波长处检测，收集洗脱峰得到谷糠过氧化物酶。本发明通过细胞实验和小鼠体内实验证明：谷糠过氧化物酶可以有效调控人主动脉平滑肌细胞的表型由合成型向收缩型转变；可以显著抑制人主动脉平滑肌细胞迁移；可以显著抑制人主动脉平滑肌细胞吞噬脂质；可以显著抑制人单核巨噬细胞吞噬脂质；可以减少主动脉病变和升高高密度脂蛋白胆固醇来抑制小鼠体内动脉粥样硬化的发生；进而说明谷糠过氧化物酶可在制备具有预防和或治疗动脉粥样硬化作用的功能食品或药品中应用。附图说明图1谷糠过氧化物酶调控主动脉平滑肌细胞表型由合成型向收缩型转化的荧光染色图；图2谷糠过氧化物酶抑制主动脉平滑肌细胞迁移的划痕实验图；图3谷糠过氧化物酶抑制主动脉平滑肌细胞吞噬脂质的油红O染色实验图；图4谷糠过氧化物酶抑制单核巨噬细胞吞噬脂质的油红O染色实验图；图5谷糠过氧化物酶抑制小鼠体内主动脉病变面积的油红O染色实验图；图6谷糠过氧化物酶提高小鼠血液中HDL-C含量的统计柱状图。具体实施方式以下实施例中使用的谷糠过氧化物酶，按照中国专利ZL201210084160.X说明书实施例1的方法制备得到。实施例1：谷糠过氧化物酶对人主动脉平滑肌细胞表型转化的影响将盖玻片酸泡过夜，蒸馏水冲洗干净，浸泡于70％酒精中，使用时将盖玻片上酒精烧干，铺于12孔板中，将用无血清培养基稀释好的浓度为20000mL的主动脉平滑肌细胞铺于12孔板中，饥饿处理24h。待处理完成后弃掉无血清培养基，分别加入1mL含10-6molL血管紧张素ⅡAngⅡ的完全培养基，然后加入FMBP，终浓度为11.38μmolL和17.07μmolL，处理48h。吸掉培养基，用37℃预热的PBSPH＝7.4清洗2次，每孔加入600μL免疫荧光固定液固定10min，用PBS清洗3次，每次轻摇5min。每孔加入500μL0.5％TritionX-100溶液透化处理5min，用PBS清洗3次，每次轻摇5min。每孔加200μL浓度为100nMFITC标记的鬼笔环肽工作液，室温避光孵育30min，用PBS清洗3次，每次轻摇5min。每孔加200μL浓度为100nMDAPI溶液，室温避光孵育30min，用PBS清洗3次，每次轻摇5min。在载玻片中央滴加适量抗荧光猝灭剂，将盖玻片从12孔板中取出倒置在载玻片上，封片剂封片后用DeLtaVisionELite系统观察主动脉平滑肌细胞表型转化情况，并对主动脉平滑肌细胞长度进行了测量统计。结果表明：与造模组和对照组相比，谷糠过氧化物酶可以有效促进主动脉平滑肌细胞由合成型向收缩型转变。如图1所示，图1A为主动脉平滑肌细胞荧光染色图；图1B为主动脉平滑肌细胞长度统计图。实施例2：谷糠过氧化物酶对主动脉平滑肌细胞迁移的影响取对数生长期的主动脉平滑肌细胞调整细胞密度接种于24孔铺有灭菌枪头圈的细胞培养板中，枪头圈中细胞密度达90％以上的单层细胞后，用无菌镊子将培养板内枪头圈取走，用已灭菌的20μL枪头在单层细胞圈中均匀划痕，吸去旧培养基，PBS洗三次，每孔加入500μL含2％血清的新培养基，分别加入终浓度为5.70μmolL、11.38μmolL和17.07μmolL的谷糠过氧化物酶处理24h，用倒置显微镜分别于0h、24h对划痕距离拍照，观察细胞迁移情况。细胞迁移率＝0h加药组划痕距离-24h加药组划痕距离0h对照组划痕距离-24h对照组划痕距离结果表明：上述不同浓度的谷糠过氧化物酶处理主动脉平滑肌细胞后，与对照组相比，谷糠过氧化物酶可以明显抑制主动脉平滑肌细胞的迁移，且呈现浓度依赖性如图2所示。实施例3：谷糠过氧化物酶对主动脉平滑肌细胞和单核巨噬细胞吞噬脂质的影响将盖玻片酸泡过夜，蒸馏水冲洗干净，浸泡于70％酒精中，使用时将盖玻片上酒精烧干，铺于24孔板中，将用无血清培养基稀释好的浓度为20000mL的主动脉平滑肌细胞和用含100μMPMA的终浓度为20000mL的单核巨噬细胞分别铺于24孔板中，培养24h。待处理完成后主动脉平滑肌细胞弃掉无血清培养基，分别加入1mL含10-6moLLAngⅡ完全培养基，单核巨噬细胞换为正常完全培养基。然后加入谷糠过氧化物酶，终浓度为11.38μmolL和17.07μmolL，处理48h。吸掉培养基，用37℃预热的PBSPH＝7.4清洗2次，每孔加入500μLOROFixative固定液固定30min，弃去固定液，用蒸馏水清洗2次，加入60％异丙醇浸洗5min，然后弃去60％异丙醇后加入新配制好的OROStain，浸染20min，弃去染色液，水洗5次，直至无多余染液后，加入Mayer苏木素染色液，复染核2min。弃去染液后水洗5次，加入OROBuffer1min后弃去，封片后于倒置显微镜下观察主动脉平滑肌细胞和单核巨噬细胞的吞噬脂质情况，并对染色面积进行了定量分析。结果表明：和对照组相比，谷糠过氧化物酶可以有效抑制主动脉平滑肌细胞和单核巨噬细胞吞噬脂质的能力如图3、图4所示，图3A为主动脉平滑肌细胞油红O染色图；图3B为主动脉平滑肌细胞油红O染色面积统计图；图4A为单核巨噬细胞油红O染色图；图4B为单核巨噬细胞油红O染色面积统计图。实施例4：谷糠过氧化物酶可以有效抑制小鼠体内动脉粥样硬化斑块形成1、小鼠名称：ApoE--小鼠载脂蛋白E基因敲除小鼠；2、级别：SPF级；3、性别：雄性；4、年龄：5周龄；5、喂养时间：17周；6、饲养条件：温度：20-25℃，相对湿度：50-55％，室内灯光模拟昼夜，12小时明暗循环，7、饲料：除正常对照组外均为高脂饲料喂养，正常对照组为普通维持饲料喂养。8、实验动物分组及给药见表1：表19、每周对小鼠进行称重并记录，处死前24小时断饲料并停止给药，只供应水，然后检测小鼠体脂率和自由水含量。10、麻醉处死小鼠后，检测小鼠脏器指数变化。11、麻醉处死小鼠后，先用生理盐水冲洗血液，然后PBS灌注，找到小鼠主动脉，剥离干净周围组织，而后从主动脉弓分离至髂动脉。在体视显微镜下纵向剖开动脉，4％甲醛固定48h，油红O染色60min，75％酒精分化至官腔内脂肪斑块呈橘红色或鲜红色，其他部位近无色，然后蒸馏水洗两次，拍照，并对病变面积进行了定量分析。12、定期通过断尾取血的方式检测小鼠血液中高密度脂蛋白胆固醇HDL-C,低密度脂蛋白胆固醇LDL-C,甘油三酯TG,总胆固醇T-CHO含量。结果表明：模型组和对照组相比，造模成功；与模型组相比，谷糠过氧化物酶对小鼠体重和脏器无显著影响如表2所示。而且谷糠过氧化物酶可以有效抑制小鼠体内主动脉病变面积如图5所示，图5A为主动脉油红O染色图；图5B为主动脉油红O染色后病变面积统计图，显著升高小鼠血液中HDL-C含量如图6A所示,对LDL-C，T-CHO和TG无显著影响如图6B-D所示。表2FMBP对ApoE--小鼠体重，体脂率和脏器的影响

权利要求：1.谷糠过氧化物酶在制备预防和或治疗动脉粥样硬化功能食品或药品中的应用。2.如权利要求1所述的谷糠过氧化物酶在制备预防和或治疗动脉粥样硬化功能食品或药品中的应用，所述的谷糠过氧化物酶通过包括以下步骤的方法制备得到：第一步：取谷糠，粉碎后，加入预冷的蛋白提取液，4℃下浸泡并搅拌12-16小时，离心后取上清液，即为谷糠蛋白粗提液；所述的蛋白提取液为20mmolLTris-HCl溶液，含0.85％NaCl，1mmolLPMSF，pH8.0；所述的谷糠和蛋白提取液的重量体积比为1︰4-6，其中重量的单位为g，体积的单位为mL；第二步：在谷糠蛋白粗提液中加入2-3倍体积的-20℃预冷的丙酮，沉淀蛋白1-2小时，离心，收集沉淀，在-20℃下放置，使丙酮完全挥发，冷冻干燥，得到谷糠粗蛋白；第三步：将谷糠粗蛋白用pH8.0、20mmolLTris-HCl缓冲液溶解，离心后取上清液，按0℃下硫酸铵溶液饱和度计算表，先加入硫酸铵粉末，达到30％饱和度，充分搅拌溶解后，静置，离心，收集上清液，再向上清液中加入硫酸铵粉末，达到85％饱和度，充分搅拌溶解后，静置，离心，收集沉淀，用pH8.0、20mmolLTris-HCl缓冲液溶解、透析、浓缩即得到谷糠过氧化物酶粗蛋白；第四步：将谷糠过氧化物酶粗蛋白用pH8.0、20mmolLTris-HCl缓冲液溶解，过Q阴离子交换层析柱，紫外检测仪于280nm波长处检测，收集穿透峰；第五步：将上述穿透液过SP-阳离子柱交换层析柱，用含0.1molLNaCl的pH8.0、20mmolLTris-HCl缓冲液洗脱，紫外检测仪于280nm波长处检测，收集洗脱峰得到谷糠过氧化物酶。3.如权利要求1或2所述的谷糠过氧化物酶在制备预防和或治疗动脉粥样硬化功能食品或药品中的应用，其特征在于，所述的功能食品是将谷糠过氧化物酶添加一种或多种食品学上可接受的辅料制成。4.如权利要求1或2所述的谷糠过氧化物酶在制备预防和或治疗动脉粥样硬化功能食品或药品中的应用，其特征在于，所述的药品是将谷糠过氧化物酶添加一种或多种药学上可接受的辅料制成。

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