申请/专利权人：伊玛提克斯生物技术有限公司

申请日：2017-03-16

公开（公告）日：2023-03-17

公开（公告）号：CN108884136B

主分类号：C07K14/435

分类号：C07K14/435;C12N5/10;A61K35/17;A61P35/00

优先权：["20160316 GB 1604492.7","20160316 US 62/308,975"]

专利状态码：有效-授权

法律状态：2023.03.17#授权;2018.12.18#实质审查的生效;2018.11.23#公开

摘要：本说明书涉及用于靶向癌细胞的结合肿瘤相关抗原TIA的T细胞受体TCR，表达该受体的T细胞，该受体的制备方法，以及使用该受体治疗癌症的方法。特别是，本说明书涉及与含肽的HLAI类或II类分子结合的TCR及其变体，肽为例如MAG‑003，具有KVLEHVVRVSEQIDNO：1的氨基酸序列。本说明书进一步涉及用于免疫治疗方法的肽、蛋白质、核酸和细胞。特别是，本说明书涉及癌症的免疫疗法。本说明书还涉及单独使用或与其他肿瘤相关肽联合使用的肿瘤相关T细胞CTL肽表位，其可以例如作为刺激抗肿瘤免疫反应或体外刺激T细胞并转入患者的疫苗组合物的活性药物成分。与主要组织兼容性复合体MHC分子结合的肽或与此类的肽也可以是抗体、可溶性T细胞受体和其他结合分子的靶标。

主权项：1.一种抗原识别构建体，其特异性地结合至包含在9至14个氨基酸长度的肽中的氨基酸序列SEQIDNO:1，且与人白细胞抗原（HLA）I类分子结合，其中所述抗原识别构建体包含TCRα可变结构域和TCRβ可变结构域，并且其中i所述TCRα可变结构域包含根据SEQIDNO:58的互补决定区（CDR）1、根据SEQIDNO:59的CDR2和根据SEQIDNO:60的CDR3，并且所述TCRβ可变结构域包含根据SEQIDNO:66的互补决定区（CDR）1、根据SEQIDNO:67的CDR2和根据SEQIDNO:68的CDR3；或ii所述TCRα可变结构域包含根据SEQIDNO:42的互补决定区（CDR）1、根据SEQIDNO:43的CDR2和根据SEQIDNO:44的CDR3，并且所述TCRβ可变结构域包含根据SEQIDNO:50的互补决定区（CDR）1、根据SEQIDNO:51的CDR2和根据SEQIDNO:52的CDR3；或所述TCRα可变结构域包含根据SEQIDNO:74的互补决定区（CDR）1、根据SEQIDNO:75的CDR2和根据SEQIDNO:76的CDR3，并且所述TCRβ可变结构域包含根据SEQIDNO:82的互补决定区（CDR）1、根据SEQIDNO:83的CDR2和根据SEQIDNO:84的CDR3。

全文数据：用于癌症免疫治疗的转染T细胞和T细胞受体背景技术[0001]基于T细胞的免疫治疗靶向作用于主要组织兼容性复合体MHC分子提呈的来源于肿瘤相关蛋白或肿瘤特异性蛋白的肽表位。这些肿瘤相关抗原（TAA可以是源自所有蛋白类型的肽，如酶、受体、转录因子等，它们在相应肿瘤的细胞中被表达，并且与同源未变的细胞相比，其表达通常上调。[0002]细胞免疫反应的特定元素能特异性地识别和破坏肿瘤细胞。从肿瘤浸润细胞群或外周血中分离出的T细胞表明，这些细胞在癌症的天然免疫防御中发挥了重要作用。特别是⑶8阳性T细胞在这种反应中发挥重要作用，T⑶8+能识别通常8至10个源自蛋白或位于细胞质的缺陷型核糖体产物DRIP的氨基酸残基的主要组织兼容性复合体MHC所载的肽中所含的I类分子。人MHC分子也称为人白细胞抗原HLA。[0003]MAGEA4是MAGEA基因家族的一员。MAGEA4蛋白和mRNA的表达与各种癌症的发展和预后有关。MAG-003肽，S卩KVLEHVVRVSEQIDN0:1是MAGEA4氨基酸286-294的一种HLA-A*0201限制性细胞毒性T淋巴细胞CTL表位。（Jiaetal.2010;Wuetal.2011中的内容通过引用整体并入本文。MAG-003在体外从HLA-A*0201阳性PBMC和在HLA-A*0201Kb转基因小鼠中引发特异性CTL。MAG-003诱导的CTL以HLA-A*0201限制性方式裂解靶细胞，证明MAG-003是HLA-A*0201限制性CTL表位。[0004]MHC分子有两类:MHCI类和MHCII类。肽和MHCI类的复合体由负载相应T细胞受体TCI?的CD8阳性T细胞进行识别，而肽和MHCII类分子的复合体由负载相应TCR的CD4阳性辅助T细胞进行识别。由于CD8依赖型和CD4依赖型这两种反应共同并协同地促进抗肿瘤作用，因此，确定和表征肿瘤相关抗原和相应T细胞受体在开发癌症免疫治疗如:疫苗和细胞治疗）中非常重要。[0005]在MHCI类依赖性免疫反应中，肽不仅能与肿瘤细胞表达的某些MHC-I类分子结合，而且它们之后还必须能被T细胞负载的特异性T细胞受体T⑽识别。因此，TAA是基于T细胞疗法包括但不限于肿瘤疫苗和细胞疗法研发的起点。[0006]虽然在开发用于癌症治疗的分子靶向药物方面取得了进展，但是，本领域仍然需要开发专门靶向作用于癌细胞高度特异性分子的抗癌新药。本说明书通过提供特异性结合至IGF2BP3的表位，例如肽KIQEILTQVIGF2BP3-001;SEQIDNO:1及其变体的新型TCR、核酸、载体和宿主细胞来满足需要；以及使用这些分子治疗癌症的方法。发明内容[0007]本说明书涉及包含α链和β链的T细胞受体TCR“αβΤα〇。在另一项实施方案中，本说明书涉及包含γ链和δ链的TCR“γSTCR“。[0008]本说明书还涉及TCR、单个TCR亚基（单独或组合）及其亚结构域、可溶性TCRsTCR，例如可溶性αβ二聚体TCR，其在恒定结构域残基之间至少有一个二硫键二硫键在天然TCR中不存在），和克隆TCR，这些TCR加工为自体或异体T细胞或T细胞祖细胞，还涉及制造这些TCR的方法以及载有所述TCR的其他细胞。[0009]本说明书进一步涉及一种特异性结合于MAG-003肽-HLA分子复合体的TCR，其中MAG-003肽选自KVLEHVVRVSEQIDN0:1及其变体，例如在SEQIDN0:2至SEQIDN0:24中所示的那些。在一项实施方案中，HLA分子为HLA-A*02。[0010]本说明书进一步涉及一种TCR，包含TCRa可变结构域，该TCRa可变结构域与表2所示的TCRa可变结构域具有至少75%、80%、90%、95%、98%或99%序列同一性，优选为90%序列同一性；以及包含TCRP可变结构域，该TCRP可变结构域与表2所示的TCRP可变结构域具有至少75%、80%、90%、95%、98%或99%序列同一性，优选为90%序列同一性。[0011]在实施方案中，该TCRa可变结构域相对于表2所示TCRa结构域具有至少一个突变；和或该TCRP可变结构域相对于表2所示TCRP结构域具有至少一个的突变。在实施方案中，TCRa可变结构域和或TCRP可变结构域中包含至少一个突变的TCR，对于MAG-003肽-HLA分子复合体的结合亲和力和或结合半衰期至少是包含未突变TCRa结构域和或未突变TCRP可变结构域的TCR的两倍。[0012]本说明书的TCRa链还可以包含与表2所示的TCRa恒定结构域具有至少70%、75%、80%、90%、95%、98%或99%序列同一性的TCRa恒定结构域。本说明书的TCRP链还可以包含与表2所示的TCRP恒定结构域具有至少70%、75%、80%、90%、95%、98%或99%序列同一"性的TCRP恒定结构域。[0013]本说明书的TCRa链还可以包含TCRa跨膜结构域和或TCRa细胞内结构域。本说明书的TCRP链还可以包含TCRP跨膜结构域和或TCR辟田胞内结构域。[0014]说明书进一步涉及包含表2中披露的一个或多个a链互补决定区（CDR的TCRa链以及相对于表2所示CDR具有一个、两个、三个或四个取代基的变体。进一步的说明为包含选自表2所示的⑶Rl、CDR2和⑶R3中至少一个⑶R的TCRa链。进一步的说明为包含表2所示的a链CDR3的TCRa链。[0015]说明书进一步涉及包含表2中披露的一个或多个β链互补决定区（CDR的TCRP链以及相对于表2所示CDR具有一个、两个、三个或四个取代基的变体。进一步的说明为包含选自表2所示的TCRP链⑶Rl、CDR2和⑶R3中至少一个⑶R的TCRP链。进一步的说明为包含表2所示的β链CDR3的TCRP链。[0016]说明书进一步涉及包含编码本说明书中TCR的核苷酸序列的分离或重组核酸。在一实施方案中，说明书中的核酸编码如表2所示的TCRa链和或TCRP链。[0017]说明书进一步涉及如本文所述的包含编码TCRa链、β链或两者的核酸的重组表达载体。[0018]说明书进一步涉及包含表达编码TCRa链、β链或两者的核酸的重组表达载体的分离宿主细胞。[0019]说明书进一步涉及包含根据本说明书的重组表达载体的分离宿主细胞，优选为其中细胞是人细胞，优选为外周血淋巴细胞PBL，更优选为CD4或CD8阳性T淋巴细胞。[0020]说明书进一步涉及包含该说明书的重组表达载体的分离I3BU其中所述I3BL为⑶8+T细胞或⑶4+T细胞。[0021]该说明书进一步涉及包含本文所述的至少一种宿主细胞的细胞群。[0022]说明书进一步涉及本说明书的TCR和宿主细胞在治疗增殖性疾病中的用途，增殖性疾病为例如非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肾细胞癌、脑癌、胃癌、结直肠癌、肝细胞癌、胰腺癌、前列腺癌、白血病、乳腺癌、梅克尔细胞癌、黑色素瘤、卵巢癌、膀胱癌、子宫癌、胆囊癌、胆管癌和食管癌。[0023]在一方面，宿主细胞是用编码说明书至少一种TCR的核酸转染的⑶8+T细胞或⑶4+T细胞，其中TCR包含表2中披露的至少一个氨基酸序列。另一方面，此类宿主细胞用于免疫治疗小细胞肺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肾细胞癌、脑癌、胃癌、结直肠癌、肝细胞癌、胰腺癌、前列腺癌、白血病、乳腺癌、梅克尔细胞癌、黑色素瘤、卵巢癌、膀胱癌、子宫癌、胆囊癌、胆管癌和食管癌、优选为非小细胞肺癌。[0024]说明书进一步涉及杀死或减少癌细胞数量的方法，其包括使癌细胞与本文所述的TCR、核酸、载体或宿主细胞接触。还提供的是治疗癌症的方法，包括向有需要的受试者施用本文所述的TCR、核酸、载体或宿主细胞。[0025]另一方面，本说明书涉及MAG-003肽或其药学上可接受的盐，例如分离的肽，其包含根据以下通式I的氨基酸序列：[0026]X1X2LEHWRX3SEQIDNO:25[0027]通式I[0028]其中X1选自氨基酸K和Y，X2选自氨基酸V、L和A，X3选自V、L、A和I，其中所述肽与HLAI类或II类分子结合和或诱导T细胞与所述肽交叉反应。一方面，所述肽不是基础的全长多肽。[0029]优选序列或其药学上可接受的盐选自SEQIDNO:1或其与SEQIDNO:1为至少66%、优选至少77%、更优选至少88%同源优选为至少77%或至少88%相同）的变体序列，其中所述变体与HLAI类或II类分子结合和或诱导T细胞与所述肽交叉反应，其中所述肽不是基础的全长多肽。[0030]本说明书进一步涉及本说明书的肽，其包含选自由SEQIDNO:1或其与SEQIDNO:1至少66%、优选至少77%、更优选至少88%同源优选为至少77%或至少88%相同）的变体的序列，其中所述肽或其变体的总长度为8至100个、优选为8至30个、最优选为8至14个氨基酸。[0031]下表显示了根据本说明书的实例肽及其各自的SEQIDN0。一方面，表1中的肽可与HLA-A*02结合。另一方面，本文所述的TCR能够结合或特异性结合表1中的一种或多种肽。[0032]表1:本说明书中的肽[0033][0034]本发明还一般涉及本发明的一种或多种肽在治疗增殖性疾病中的用途，增殖性疾病为例如，非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肾细胞癌、脑癌、胃癌、结直肠癌、肝细胞癌、胰腺癌、前列腺癌、白血病、乳腺癌、梅克尔细胞癌、黑色素瘤、卵巢癌、膀胱癌、子宫癌、胆囊癌、胆管癌和食管癌。[0035]特别优选的是本发明的肽单独或组合），其选自SEQIDNO:1至SEQIDN0:24。更优选的是所述肽单独或组合选自SEQIDNO:1至SEQIDNO:24见表1并且用于免疫治疗非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肾细胞癌、脑癌、胃癌、结直肠癌、肝细胞癌、头颈癌、胰腺癌、前列腺癌、白血病、乳腺癌、梅克尔细胞癌、黑色素瘤、卵巢癌、膀胱癌、子宫癌、胆囊癌、胆管癌和食管癌、优选非小细胞肺癌。[0036]—方面，本发明还涉及本发明的肽，其具有与HLAI类分子或（以延长形式的形式例如长度变体与HLA-II类分子结合的能力。[0037]—方面，本发明涉及本发明中的肽，其中所述肽每种肽）由或基本由根据SEQIDNO:1至SEQIDNO:24的氨基酸序列组成。[0038]本发明进一步涉及本发明的肽，其中所述肽被修饰和或包含非肽键。[0039]本发明进一步涉及本发明的肽，其中所述肽为融合蛋白的一部分，特别是与HLA-DR抗原相关不变链Ii的N-端氨基酸融合，或与抗体例如，树突状细胞特定抗体融合，或融合到抗体的序列中。[0040]本说明书进一步涉及一种核酸，其编码本说明书中的肽。本说明书进一步涉及本说明书中的核酸，其为DNA、cDNA、PNA、RNA或其组合。[0041]本发明进一步涉及一种能表达和或表达本发明核酸的表达载体。[0042]本发明进一步涉及本发明的肽、本发明的核酸或本发明的表达载体在疾病治疗和在药物中的用途，特别是用于治疗癌症。[0043]本发明进一步涉及本发明中肽或本发明中所述肽复合体含有MHC的特异性抗体以及制造这些抗体的方法。[0044]本说明书进一步涉及含有本发明核酸或表达载体的宿主细胞。[0045]本发明进一步涉及本发明的宿主细胞，其为抗原提呈细胞，优选为树突细胞。[0046]本发明进一步涉及制备本发明肽的一种方法，所述方法包括培养本发明的宿主细胞，以及从所述宿主细胞或其培养基中分离肽。[0047]本发明进一步涉及本发明中的方法，其中通过使足量的抗原与抗原提呈细胞接触，抗原被载在表达于合适抗原提呈细胞或人工抗原呈递细胞表面的I或II类MHC分子上，或者抗原通过将抗原1类或II类MHC复合物单体四聚化而加载到I或II类MHC四聚体上。[0048]本发明进一步涉及本发明的方法，其中抗原提呈细胞包含能表达或表达含SEQIDN0:1至SEQIDN0:24,优选为SEQIDN0:1至SEQIDNo:24或其变体氨基酸序列的肽的表达载体。[0049]本发明进一步涉及以本发明方法制造的激活的T细胞，其中所述T细胞有选择性地识别一种细胞，该细胞表达含本发明氨基酸序列的多肽。[0050]本发明进一步涉及一种在癌细胞异常表达含本发明任意氨基酸序列的多肽的患者中杀灭癌症细胞和或抑制细胞的方法，该方法包括对患者施用本发明方法制造的有效量T细胞。[0051]本发明进一步涉及任何所述肽、本发明的核酸、本发明的表达载体、本发明的细胞、本发明的激活的T淋巴细胞、本发明的T细胞受体、抗体或其他肽结合分子和或肽-MHC结合分子作为药物或在药物制备中的用途。所述药物优选为具有抗癌活性。[0052]优选情况为，所述药物为基于TCR、可溶性TCR或抗体的细胞治疗药物、疫苗或蛋白。[0053]本发明进一步涉及本发明中的用途，其中所述癌细胞为非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肾细胞癌、脑癌、胃癌、结直肠癌、肝细胞癌、胰腺癌、前列腺癌、白血病、乳腺癌、梅克尔细胞癌、黑色素瘤、卵巢癌、膀胱癌、子宫癌、胆囊癌、胆管癌和食管癌，优选为小细胞肺癌细胞。[0054]本说明书进一步涉及一种基于本说明书中肽的生物标志物，在此称为“靶标“，其可用于诊断癌症，优选为非小细胞肺癌。所述标志物可以肽本身过度提呈或相应基因过度表达。标志物也可以用于预测治疗成功的可能性，优选为免疫疗法，最优选为靶向作用于该生物标志物识别的相同靶目标免疫疗法。例如，抗体或可溶性TCR可用于染色肿瘤切片以检测是否存在相关肽与MHC复合。或者，抗体或可溶性TCR具有进一步的效应子功能，如免疫刺激域或毒素。[0055]本说明书进一步涉及这些新靶标在确定可识别至少一种所述靶标的TCR中的用途，优选在确定激活T细胞的TCR中的用途。[0056]本说明书还涉及这些新靶标在癌症治疗中的用途。附图说明[0057]图1显不了健康组织和癌症中MAG-003妝的提呈。[0058]图2-4显示了癌症和健康组织中MAG-003的表达。[0059]图5-7显示了在与载有MAG-003肽（SEQIDN0:1或同源但不相关的肽1^86六？11^-001SEQIDN0:91、AXIN1-001SEQIDN0:92、AN05-001SEQIDN0:93、TPX2-001SEQIDN0:94、SYNE3-001SEQIDN0:95、MIA3-001SEQIDN0:96、HERC4-001SEQIDNO:97、PSME2-001SEQIDN0:98、HEATR5A-001SEQIDNO:99或CN0T1-003SEQIDNO:100或对照肽NYES01-001SEQIDN0:101的靶细胞共孵育后，分别用TCRR7P1D5、R20P1H7和R10P2G12表2的α和β链RNA电穿孔的⑶8+T细胞中的IFNγ释放。用源自两个不同供体右X轴上为供体1，左X轴上为供体2的⑶8+T细胞获得IFNγ释放资料。单独的RNA电穿孔的CD8+T细胞或与未载入靶细胞共孵育的CD8+T细胞作为对照。[0060]图8显示了分别用TCRR7P1D5、R20P1H7和R10P2G12表2的a和β链RNA电穿孔的CD8+T细胞的MHCMAG-003四聚体或MHCNYES01-001四聚体染色。经与MHCNYES01-001复合体特异性结合的IG4TCR的RNA电穿孔的CD8+T细胞和阴性对照电穿孔的CD8+T细胞作为对照。[0061]图9-11显示了与载有MAG-003肽（SEQIDNO:1或在SEQIDNO:1第1-9位上有丙氨酸取代的各种MAG-003变体的靶细胞共孵育后，分别用TCRR7P1D5、R20P1H7和R10P2G12表2的a和β链RNA电穿孔的CD8+T细胞中的IFNy释放。单独的RNA电穿孔的CD8+T细胞或与载有对照肽NYES01-001的靶细胞或未加载的靶细胞共孵育的⑶8+T细胞作为对照。用源自两个不同供体右X轴上为供体1，左X轴上为供体2的⑶8+T细胞获得IFNγ释放资料。[0062]图12为在分别与Α-375黑素瘤细胞系、T98G胶质母细胞瘤细胞系和SK-BR-3乳腺癌细胞系共孵育后，用TCRAR7P1D5、⑻R20P1H7和（CR10P2G12的a和β链RNA电穿孔的CD8+T细胞中的IFNy释放。单独的RNA电穿孔的⑶8+T细胞作为对照。[0063]图13.用编码TCRR7P1D5、R10P2G12、R20P1H7、阴性对照或对照TCR1G4SEQIDΝ0:Χ的RNA转染的T细胞与不同的原代人健康组织细胞参见表13的缩写词）、靶向阴性肿瘤细胞系MCF-7以及MAGEA4-和NY-ESOl-阳性细胞系Α-375和NCI-H1755共同培养。TCRR7P1D5、R10P2G12、R20P1H7和1G4在T细胞中的表达通过使用RNA载体的电穿孔实现。人健康组织细胞培养不会导致对于TCRR7P1D5、R10P2G12或R20P1H7的显著TCR介导的识别和T细胞活化。示出通过ELISA测量的E:T比1:1，每次20，000个细胞，经复制20小时后IFN-γ释放的平均值。误差柱表示标准差。通过扣减单单TCR转染T细胞的IFN-γ释放量以及由于靶细胞和不表达相关TCR的T细胞共培养而带来的IFN-γ释放量而使结果标准化。[0064]图14图14.来自4个于六个不同慢病毒构建体R71-R78转导后接受R7P1D5TCR转基因表达筛选的供体的累积数据。CD3+CD8+T细胞经流式细胞仪分析在转导96h后的MHCMAG-003四聚体结合细胞的比例。MHCMAG-003四聚体染色的未转导T细胞NT染色和MHCNYES01-001四聚体染色的1G4NY-ESOlTCR转导的T细胞分别用作阴性和阳性对照。细胞在活⑶3+⑶8+群体上进行电波传送。[0065]图15A.R7P1D5TCR转导的T细胞与MAGEA4表达肿瘤细胞系A375和MAGEA4阴性肿瘤细胞系MCF-7共培养时经IFNy产生的方式测量的效应子反应。用编码R7P1D5TCR的R73慢病毒的浓缩上清液转导的T细胞与得自4个健康供体PBMC的未转导细胞NT进行比较。结果以三组重复的平均值±SEM呈现。B.源自2名健康供体供体6和供体7的R7P1D5TCR转导的T细胞在与经降低浓度的MAG-003肽进行脉冲的T2靶细胞共孵育时的IFNy反应。结果以转导96小时后测量的三次重复的平均值土SEM表示。[0066]图16A，B4hCr51释放测定中，R7P1D5TCRR73慢病毒转导的和未转导的T细胞NT在不同的E:T比下针对MAGEA4表达肿瘤细胞系A375测量的细胞毒性反应。结果以3-4次重复的平均值土SEM表示。⑹5名供体生成的7种R7P1D5TCRR73慢病毒转导T细胞产物的组合数据，其显示出E:T为40:1时对MAGEA4表达A375和MAGEA4-阴性MCF-7肿瘤靶标的特异性杀灭。具体实施方式[0067]本说明书涉及包含α链和或β链的T细胞受体TCR“αβΤ〇η。还提供了由MHC分子提呈时可与TCR和抗体结合的MAG-003肽。本说明书还涉及用于表达本发明TCR和肽的核酸、载体和宿主细胞；以及使用它们的方法。[0068]因此，在第一方面，本发明的目的通过抗原识别构建体来解决，所述抗原识别构建体包含至少一个互补决定区（CDR3，其与选自SEQIDN044、52、60、68、76和84的氨基酸序列至少具有50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或优选为100%序列同一性。[0069]根据本发明的抗原识别构建体优选选自抗体或其衍生物或片段、或T细胞受体TCR或其衍生物或片段。本发明的抗体或TCR的衍生物或片段应优选为可保留母体分子的抗原结合识别能力，特别是其如上所述的特异性和或选择性。此类结合功能可以通过如本文所定义的CDR3区的存在来保留。[0070]在本发明的一实施方案中，本发明的TCR能够以主要组织兼容性复合体MHCI类依赖性方式识别TAA抗原。本文使用的“MHCI类依赖性方式”是指TCR在结合MHCI类分子背景中的TAA抗原时引起免疫应答。MHCI类分子可以是本领域已知的任何MHCI类分子，例如HLA-A分子。在本发明的一项优先实施方案中，MHCI类分子为HLA-A*02分子。[0071]本发明提供单链抗原识别构建体和双链识别构建体。[0072]在一实施方案中，该TCRa可变结构域相对于表2所示的TCRa结构域具有至少一个突变;和或该TCRP可变结构域相对于表2所示的TCRP结构域具有至少一个突变。在一实施方案中，TCRa可变结构域和或TCRP可变结构域中包含至少一个突变的TCR对于TAA肽HLA分子复合体的结合亲和力和或结合半衰期至少是包含未突变TCRa结构域和或未突变TCRP可变结构域的TCR的两倍。[0073]本说明书的TCRa链可以进一步包含TCRa跨膜结构域和或TCRa细胞内结构域。本说明书的TCRf3链可能进一步包含TCRf3跨膜结构域和或TCR辟田胞内结构域。[0074]本发明特别提供一种作为抗原识别构建体或其片段或衍生物的TCR13TCR优选为人TCR，其被理解为由人TCR基因座产生，因此包含人TCR序列。此外，本发明的TCR的特征在于它源自人，并且特异性地识别如表1所述的本发明的TAA抗原。[0075]本发明的另一项实施方案另外提供上述抗原识别构建体，其诱导免疫应答，优选为其中免疫应答的特征在于干扰素IFNγ水平增加。[0076]本发明的TCR可以为单链a或β，或γ和δ分子，或为由a和β链或γ和δ链两者组成的双链构建体。[0077]最优选地，在一些另外的实施方案中，其中本披露是指包含本文公开TCR链的任一个、两个或全部CDRl至CDR3区的抗原识别构建体参见表1，此类抗原识别构建体可能为优选的，其包含本发明的氨基酸残基修饰不超过三个、两个、优选为仅一个的相应CDR序列。修饰的氨基酸残基可以选自氨基酸插入、缺失或取代。最为优选的是三个、两个、优选为仅一个修饰的氨基酸残基为相应CDR序列的第一个或最后一个氨基酸残基。如果修饰是取代，则在一些实施方案中优选取代为保守的氨基酸取代。[0078]本发明的TCR可以进一步包含源自任何合适物种的恒定区，如任何哺乳动物，例如:人、大鼠、猴、兔、驴或小鼠。在本发明的一项实施方案中，本发明的TCR进一步包含人恒定区。在一些优选实施方案中，本发明TCR的恒定区可例如通过引入异源序列、优选为小鼠序列来稍加修饰，这可能增加TCR的表达和稳定性。[0079]在本发明的一项实施方案中，提供了嵌合TCR，其中所述TCR链包含来自多物种的序列。优选情况为，本发明的TCR可包含α链，其包含α链的人可变区和例如鼠TCRa链的鼠恒定区。[0080]在一项实施方案中，本发明的TCR是由根据上述实施方案的人可变区和人恒定区组成的人TCR。[0081]在一些实施方案中，抗原识别构建体被鼠源化或人源化。当将来自外来物种的氨基酸序列引入本发明的构建体时，使用这些术语。[0082]本发明的TCR可以为单链TCRscTCR。本发明的scTCR应在一个多肽链中包含全部或部分α链序列以及全部或部分β链序列，优选为通过肽接头连接。scTCR可包含第一TCR链例如，α链的可变区的多肽和整个全长第二TCR链例如，β链）的多肽，反之亦然。此外，scTCR可以任选地包含一个或多个将两个或多个多肽连接在一起的接头。例如，接头可以是肽，其将两个单链连接在一起，如本文所述。还提供了本发明的scTCR，其与人细胞因子如IL-2、IL-7或IL-15融合。[0083]本发明的抗原识别构建体还可以以包含至少两个scTCR分子的多聚复合体形式提供，其中所述scTCR分子各自与至少一种生物素基团或其他相互连接的分子接头融合，并且其中所述scTCR通过生物素-链霉亲和素相互作用相互连接，以形成所述多聚体复合体。本领域已知的用于产生多聚体TCR的类似方法也是可能的并且包括在本披露中。还提供了更高级的多聚体复合体，其包含本发明两种以上的scTCR。[0084]为了本发明的目的，TCR是具有至少一个TCRa或γ和或TCRP或δ可变结构域的基团。通常，它们包括TCRa可变结构域和TCRf3可变结构域，或者TCRγ可变结构域和TCRS可变结构域两者。它们可以为αβγS异源二聚体，也可以为单链形式。为了用于过继疗法，αβ或γδ异二聚体TCR可以例如作为具有细胞质和跨膜结构域的全长链进行转染。如果需要，相应恒定结构域残基之间可以存在引入的二硫键。[0085]在一项优选的实施方案中，抗原识别构建体为人TCR或其片段或衍生物。人TCR或其片段或衍生物是包含超过50%的相应人TCR序列的TCR。优选情况为，只有少部分TCR序列为人工来源或源自其他物种。然而，众所周知，例如，人源的嵌合TCR在恒定区含有鼠源序列是有利的。因此，特别优选的是根据本发明的TCR，其在其恒定区的细胞外部分含有鼠序列。[0086]因此，又为优选的是本发明的抗原识别构建体能够以人白细胞抗原HLA依赖性方式、优选以HLA-A02依赖性方式识别其抗原。在本发明的上下文中，术语“HLA依赖性方式”是指抗原识别构建体仅在抗原肽由所述HLA提呈的情况下才与抗原结合。[0087]在一项实施方案中，本发明的抗原识别构建体优选为诱导免疫应答，优选为其中免疫应答的特征在于干扰素IFNγ水平增加。[0088]本发明还提供了包含本文所述的任何TCR或其功能变体）的功能部分的多肽，例如，选自实施例部分和表1中所述Α、Β和C中的任何一种TCR。本文所用的术语“多肽”包括寡肽，并且系指通过一个或多个肽键连接的氨基酸的单链。关于本发明的多肽，功能部分可以是包含TCR或其功能变体连续氨基酸的任何部分，其是一个部分，只要功能部分与TAA抗原特异性结合，优选为如表1中所公开的那些。当用于指代TCR或其功能变体时，术语“功能部分”是指本发明TCR或其功能变体的任何部分或片段，其中该部分或片段保留TCR或其功能变体）的生物活性，其为母体TCR或其亲代功能变体的一部分。功能部分包括，例如，保留与TAA抗原特异性结合的能力（以HLA依赖性方式或以与母体TCR或其功能变体相似的程度、相同的程度或更高的程度检测、治疗或预防癌症的TCR或其功能变体）的那些部分。关于母体TCR或其功能变体），功能部分可以包括，例如，约10%、25%、30%、50%、68%、80%、90%、95%或更多母体TCR可变序列或其功能变体）。[0089]功能部分可以在该部分的氨基或羧基末端或两个末端包含额外的氨基酸，其中在母体TCR或其功能变体的氨基酸序列中未发现额外的氨基酸。理想的情况是，额外的氨基酸不干扰功能部分的生物学功能，例如，特异性结合TAA抗原；和或具有检测癌症、治疗或预防癌症等能力。更理想的是，与母体TCR或其功能变体的生物学活性相比，额外的氨基酸增强了生物学活性。[0090]在一些情况下，本发明的构建体可以包含一个或两个多肽链或其功能片段，其包含根据SEQIDN0:39至86CDR序列，恒定和可变区和全长序列）中任一项的序列，并且进一步包含其他氨基酸序列，例如，编码免疫球蛋白或其部分的氨基酸序列，则本发明的蛋白质可以是融合蛋白。就此而言，本发明还提供了包含本文所述的至少一种本发明的多肽与至少一种其他多肽的融合蛋白。另一多肽可以作为融合蛋白的单独多肽存在，或者可以作为与本文所述的本发明多肽之一一起表达的多肽存在。其他多肽可包括任何肽或蛋白质分子或其部分，包括但不限于免疫球蛋白、〇03工04工08、10：分子、001分子（例如01、0113、CDlc、CDld等）。[0091]融合蛋白可以包含本发明多肽的一个或多个拷贝和或另一个多肽的一个或多个拷贝。例如，融合蛋白可包含本发明多肽和或另一多肽的1、2、3、4、5个或更多个拷贝。制备融合蛋白的合适方法是本领域已知的，并且包括例如重组方法。在本发明的一些实施方案中，本发明的TCR及其功能部分和功能变体）、多肽和蛋白质可以表达为单一蛋白，其包含连接α链和β链和连接γ链和δ链的连接肽。就此而言，本发明的TCR及其功能变体和功能部分）、多肽和蛋白质包含本发明TCR可变区的氨基酸序列，并且可能进一步包含接头肽。接头肽可以有利地促进宿主细胞中重组TCR包括其功能部分和功能变体）、多肽和或蛋白质的表达。接头肽可包含任何合适的氨基酸序列。单链TCR构建体的接头序列是本领域公知的。此类单链构建体可进一步包含一个或两个恒定结构域序列。在通过宿主细胞表达包括接头肽的构建体后，接头肽也可能被裂解，导致α和β链以及γ和S链分离。[0092]如上所述，本发明TCR的结合功能可能在抗体框架中提供。例如，本发明TCR的CDR序列，可能包括额外的3个、2个或1个N和或C末端框架残基，可以直接接枝到抗体可变重轻链序列中。本文中使用了各种语法形式的术语“抗体”，系指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有抗原结合位点或互补位的分子。此类分子也被称为免疫球蛋白分子的“抗原结合片段”。本发明还提供了与本文所述的抗原特异性结合的抗体或其抗原结合部分。抗体可以是本领域已知的任何类型的免疫球蛋白。例如，抗体可以是任何同种型免疫球蛋白，例如IgA、IgD、IgE、IgG、IgM等。抗体可以是单克隆或多克隆抗体。抗体可以是天然存在的抗体，例如从哺乳动物例如，小鼠、兔、山羊、马、鸡、仓鼠、人等）中分离和或纯化的抗体。或者，抗体可以是基因工程化抗体，例如人源化抗体或嵌合抗体。抗体可以是单体或聚合体形式。[0093]术语“抗体”包括但不限于基因工程化或其他修饰形式的免疫球蛋白，例如内抗体、嵌合抗体、完全人抗体、人源化抗体例如由“CDR移植”产生）、抗体片段和异源偶联抗体例如双特异性抗体、双价抗体、三价抗体、四价抗体等）。术语“抗体”包括cys双价抗体和微型抗体。因此，本文提供的关于“抗体”或“抗体样构建体”的每个实施方案也被视为双特异性抗体、双价抗体、scFv片段、嵌合抗体受体CAR构建体，双价抗体和或微型抗体，除非另有明确表示。如本文所公开的，术语“抗体”包括免疫球蛋白家族的多肽或包含免疫球蛋白片段的多肽，所述多肽能够非共价、可逆地并以特异性方式结合相应的抗原，优选为本发明的TAA。示例性抗体结构单元包括四聚体。在一些实施方案中，全长抗体可由两对相同的多肽链组成，每对具有一个“轻”和一个“重”链通过二硫键连接）。抗体结构和同种型是本领域技术人员所熟知的（例如，Janeway'sImmunobiology，9thedition，2016所述）。[0094]公认的哺乳动物免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε*μ恒定区基因，以及无数免疫球蛋白可变区基因（关于免疫球蛋白基因的更多信息，参见国际免疫基因学信息系统®LefrancΜ-Ρetal.NucleicAcidsRes.2015Jan;43Databaseissue:D413_22:和http:www.imgt.org。对于全长链，轻链被分为κ或λ类。对于全长链，重链分为γ、μ、α、δ或ε类，其又分别限定免疫球蛋白类别，IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。每个链的N末端限定了主要负责抗原识别的约100至110个或更多个氨基酸的可变区。术语可变轻链VL和可变重链VH分别指轻链和重链的这些区域。用于本发明时，“抗体”包括抗体及其片段的所有变体。因此，在该概念的范围内，为具有相同、基本上相同或相似结合特异性的全长抗体、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体scFv、Fab、Fat和这些片段的多聚体形式例如，Fab〇2。在一些实施方案中，抗体与本发明的肽TAA特异性结合。根据本发明的优选抗原识别构建体包括抗体重链，优选为其可变结构域，或其抗原结合片段和或抗体轻链，优选为其可变结构域，或其抗原结合片段。类似地，二硫键稳定的可变区片段dsFv可以通过重组DNA技术制备，但本发明的抗体片段不限于这些示例性类型的抗体片段。此外，抗体或其抗原结合部分可以被修饰为包括可检测的标记，例如放射性同位素、荧光团（例如，异硫氰酸荧光素FITC，藻红蛋白（PE、酶例如，碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶和元素颗粒例如，金颗粒）。在某些情况下，与SEQID如:3、9、15、21、27和33中提供的^1«序列相比，1'0?^1«序列可以略加修饰，但优选不超过3个氨基酸残基，优选为仅两个，最优选为仅一个氨基酸位置。优选地，抗体包含该CDR3，优选为该组合中所有的⑶Rl至⑶R3区，如表1中本发明的TCR所示，在每种情况下与这些序列相比，独立地可选地具有不多于三个或两个、优选为一个氨基酸取代、插入和或缺失基。[0095]制备抗体的合适方法是本领域已知的。例如，标准杂交瘤方法描述于例如，KohlerandMilstein,Eur.J.Immunol,5,511-5191976,HarlowandLaneeds.,Antibodies：ALaboratoryManual,CSHPress1988，andC.A.Janewayetal.eds.,Immunobiology，8Ed.，GarlandPublishing，NewYork，NY201I—文中。或者，其他方法，例如HW杂交瘤方法HaskardandArcher，J.Immunol.Methods，742，361_671984，和Roderetal,MethodsEnzymol，121，140-671986和·菌体载体表达系统（参见例如，Huseetal.,Science，246,1275-811989都是本领域已知的。此外，在非人动物中产生抗体的方法描述于例如美国专利5，545，806、5，569，825和5，714，352以及美国专利申请公开号20020197266中。[0096]本发明的一些实施方案也涉及作为可溶性TCR的TCR或其功能片段和多肽。用于本文时，术语“可溶性T细胞受体”指天然TCR的异二聚体截短变体，其包含TCRa链和β链的细胞外部分，例如，通过二硫键连接，但是其缺乏天然蛋白质的跨膜和胞质结构域。术语“可溶性T细胞受体a链和可溶性T细胞受体β链序列”系指缺乏跨膜和胞质结构域的TCRa链和β链序列。可溶性TCRa链和β链的序列（氨基酸或核酸可以与天然TCR中的相应序列相同，或者与相应的天然TCR序列相比，可以包含变体可溶性TCRa链和β链序列。本文所用的术语“可溶性T细胞受体”包括具有变体或非变体可溶性TCRa链和β链序列的可溶性TCR。这些变异可以在可溶性TCRa链和β链序列的可变区或恒定区中，并且可以包括但不限于氨基酸缺失、插入、取代突变以及不改变氨基酸序列的核酸序列改变。在任何情况下本发明的可溶性TCR都保留其母体分子的结合功能。[0097][0098]除非另有说明，否则本文使用的所有术语定义如下。[0099]术语“Τ细胞受体”（缩写TCR是指一种异二聚体分子，其包含一个a多肽链a链和一个β多肽链Φ链），其中所述异二聚体受体能够结合由HLA分子提呈的肽抗原。[0100]术语“Τ细胞反应”是指由一种肽在体外或体内诱导的效应子功能的特异性扩散和启动。对于MHCI类限制性细胞毒性T细胞，效应子功能可能为溶解肽脉冲的、肽前体脉冲的或天然肽提呈的靶细胞、分泌细胞因子，优选为肽诱导的干扰素-γ，TNF-a或IL-2,分泌效应分子，优选为肽诱导的颗粒酶或穿孔素，或脱颗粒。[0101]本文所用“肽”这一术语，系指一系列氨基酸残基，通常通过相邻氨基酸的a-氨基和羰基之间的肽键来连接。这些肽的长度优选为9个氨基酸，但至短可为8个氨基酸长度，至长可为10、11或12个氨基酸长度或更长，如果为MHC-II类肽时本说明书肽的较长变体），至长可为14、15、16、17、18、19或20个氨基酸长度或更长。[0102]因此，“肽”这一术语应包括一系列氨基酸残基的盐，通常通过相邻氨基酸的a-氨基和羰基之间的肽键来连接。优选的情况是，盐为肽的药用盐，例如:氯化物或乙酸三氟乙酸盐。必须注意的是，本说明书中肽的盐与其体内状态的肽基本上不同，因为该不是体内的盐。[0103]术语“肽”应也包括“寡肽”。本文使用的术语“寡肽”是指一系列氨基酸残基，通常通过相邻氨基酸的a-氨基和羰基之间的肽键来连接。寡肽的长度对于本说明书来说并不十分关键，只要在寡肽中保持正确的表位即可。通常，寡肽长度约小于30个氨基酸残基，约长于15个氨基酸。[0104]“多肽”这一术语是指一系列氨基酸残基，通常通过相邻氨基酸的a-氨基和羰基之间的肽键来连接。多肽的长度对于本说明书来说并不十分关键，只要保持正确的表位即可。与术语肽或寡肽相对，多肽这一术语是指包含多于约30个氨基酸残基的分子。[0105]—种肽、寡肽、蛋白质或编码该分子的核苷酸如果能诱导免疫反应，则具有“免疫原性”（因此是本说明书中的一种“免疫原”）。在本说明书的情况下，免疫原性的更具体定义是诱导T细胞反应的能力。因此，“免疫原”是一种能够诱导免疫反应的分子，并且在本说明书的情况下，是一种能诱导T细胞反应的分子。在另一方面，所述免疫原可以是肽，肽与MHC的复合体、和或用于提高特异性抗体或TCR抗性的蛋白。[0106]I类T细胞“表位”要求的是一种结合至MHCI类受体上的短肽，从而形成一种三元复合体MHCI类α链，β-2-微球蛋白和肽），其可以通过T细胞负载匹配T细胞受体与具有适当亲和力的MHC肽复合体结合来识别。结合至MHCI类分子的肽的典型长度为8-14个氨基酸，最典型为9个氨基酸长度。[0107]编码特定肽、寡肽或多肽的核苷酸序列可为天然核苷酸序列，也可为合成核苷酸序列。一般来说，编码肽、多肽以及本说明书蛋白的DNA片段由cDNA片段和短寡核苷酸衔接物，或一系列寡核苷酸组成，以提供一种合成基因，该基因能够在包含源自微生物或病毒操纵子的调节元素的重组转录单元中被表达。[0108]如本文所用的术语“肽的核苷酸编码”系指对肽进行核苷酸序列编码，其中该肽包括与将由用于产生TCR的树突细胞或另一细胞系统所表达该序列的生物系统兼容的人工人造启动和停止密码子。[0109]如本文所用的术语“TCR的核苷酸编码”系指对TCR进行一个或多个核苷酸序列编码，其中该TCR包括与将由用于产生TCR的T细胞或另一细胞系统所表达该序列的生物系统兼容的人工人造启动和停止密码子。[0110]本文提到的核酸序列既包括单链核酸也包括双链核酸。因此，除非本文另有所指，否则，例如对于DNA，具体的序列是该序列的单链DNA、该序列与其互补序列的双工（双链DNA以及该序列的互补序列。[0111]术语“编码区”系指在基因的天然基因组环境中天然或正常编码该基因的表达产物的那部分基因，即，体内编码该基因的天然表达产物的区域。[0112]编码区可来自非突变（“正常”）基因、突变基因或异常基因，甚至还可以来自DNA序列，完全可在实验室中使用本领域熟知的DNA合成方法合成。[0113]术语“表达产物”系指多肽或蛋白，它是基因和遗传码退化并因而编码同样的氨基酸所造成的任何核酸序列编码同等物的翻译产物。[01M]术语“片断”当指的是一种编码序列时，表示包含非完整编码区的DNA的一部分，其表达产物与完整编码区表达产物基本上具有相同的生物学功能或活性。[0115]术语“DNA片段”系指一种DNA聚合物，以单独的片段形式或一种较大DNA结构的组分形式存在，它们从至少分离过一次的DNA中以基本纯净的形式获得，即不含污染性内源性材料，并且获得的数量或浓度能够使用标准生化方法，例如使用克隆载体，进行识别、操纵和回收该片段及其组分核苷酸序列。此类片段以开放阅读框架未被内部未翻译序列打断）或内含子通常提呈于真核基因中）的形式存在。未翻译DNA序列可能存在于开放阅读框架的下游，在那里其不会干预编码区的操纵或表达。[0116]术语“引物”表示一种短核酸序列，其可与一个DNA链配对，并在DNA聚合酶开始合成脱氧核糖核酸链之处提供一个游离的3-0H末端。[0117]术语“启动子”表示参与RNA聚合酶的结合从而启动转录的DNA区域。[0118]术语“分离”表示一种物质从其原来的环境例如，如果是天然发生的则是天然环境）中被移走。例如，活体动物中的天然核苷酸或多肽不是分离的，但是，从天然系统中一些或所有共存物质中分离出来的核苷酸或多肽是分离的。另一方面，此类多核苷酸是载体的一部分和或此类多核苷酸和多肽是一种组合物的一部分，并且由于该载体或组合物不是其天然环境的一部分，因此它仍然是分离的。[0119]本说明书中披露的多核苷酸和重组或免疫原性多肽也可能以“纯化”的形式存在。术语“纯化”并非要求绝对的纯度;它只是一个相对的定义，可以包括高度纯化或部分纯化的制剂，相关领域技术人员能理解这些术语。例如，各个从已用传统方法纯化为具有电泳同构型的cDNA库中分离出的各种克隆物。明确考虑到将起始材料或天然物质纯化至少一个数量级，优选为两或三个数量级，更优选为四或五个数量级。此外，明确涵盖所述多肽的纯度优选为99.999%，或至少为99.99%或99.9%;甚而适宜为以重量计99%或更高。[0120]根据本说明书公开的核酸和多肽表达产物，以及包含此类核酸和或多肽的表达载体可能以“浓缩的形式”存在。本文使用的术语“浓缩”是指材料的浓度至少是其自然浓度的大约2、5、10、100或1000倍，有优势的是，按重量计为0.01%，优选为至少0.1%。也明确考虑到，按重量计约为〇.5%、1%、5%、10%和20%的浓缩制剂。序列、构型、载体、克隆物以及包含本说明书的其他材料可有优势地以浓缩或分离的形式存在。术语“活性片段”系指产生免疫反应的片段（即具有免疫原性活性），通常是一种肽、多肽或核酸序列的片段，不论是单独或可选地与合适的佐剂一起或在载体中给予一种动物，比如哺乳动物，例如兔子或小鼠，也包括人;这种免疫反应采用的形式是在接受动物如:人体内刺激T细胞反应。或者，“活性片段”也可用于诱导体外T细胞反应。[0121]本文使用的“部分”（portion、“节段”（segment、“片段”（fragment这几个术语，当与多肽相关地使用时是指残基的连续序列，比如氨基酸残基，其序列形成一个较大序列的子集。例如，如果一个多肽以任一种肽链内切肽酶如胰蛋白酶或糜蛋白酶进行处理，则该处理获得的寡肽会代表起始多肽的部分、节段或片段。当与多核苷酸相关地使用时，这些术语系指用任何核酸内切酶处理所述多核苷酸产生的产物。[0122]根据本说明书，术语“等同度百分比”或“等同百分比”，如果指的是序列，则表示在待对比序列（“被对比序列”）与所述序列或权利要求的序列（“参考序列”）对准之后将被对比序列与所述序列或权利要求的序列进行比较。然后根据下列公式计算等同度百分比：[0123]等同度百分比=100[1_CR][0124]其中C是参考序列与被对比序列之间对准长度上参考序列与被对比序列之间的差异数量，其中[0125]i参考序列中每个碱基或氨基酸序列在被对比序列中没有对应的对准碱基或氨基酸；[0126]ii参考序列中每个空隙，以及[0127]iii参考序列中每个对准碱基或氨基酸与被比对比序列中对准碱基或氨基酸不同，即构成一个差异以及[0128]iv必须在对准序列的第1位置开始对准；[0129]并且R是参考序列与被对比序列对准长度上在参考序列中产生任何空隙也计算为一个碱基或氨基酸的参考序列中的碱基或氨基酸数目。[0130]如果“被对比序列”和“参考序列”之间存在的一个对准按上述计算的等同度百分比大致等于或大于指定的最低等同度百分比，则被对比序列与参考序列具有指定的最低等同度百分比，虽然可能存在按本文上述计算的等同度百分比低于指定等同度百分比的对准。[0131]在本说明书中，术语“同源性”系指两个氨基酸序列之间的同一度参见上文的等同度百分比，如肽或多肽序列。前文所述的“同源”是通过将理想条件下调整的两个序列与待比较序列进行比对后确定的。此类序列同源性可通过使用ClustalW等算法创建一个排列而进行计算。也可用使用一般序列分析软件，更具体地说，是VectorNTI、GENETYX或由公共数据库提供的其他工具。[0132]本领域技术人员能评估特定肽变体诱导的T细胞是否可与该肽本身发生交叉反应Appayetal2006；Colombettietal2006；Fongetal.,2001；Zarembaetal.,1997〇[0133]发明人用给定氨基酸序列的“变体”表示，一个或两个氨基酸残基等的侧链，例如，通过被另一个天然氨基酸残基的侧链或其他侧链取代而发生改变，这样，这种肽仍然能够以含有给定氨基酸序列选自SEQIDNO:1至SEQIDNO:24组成的组）的肽大致同样的方式与HLA分子结合。例如，一种肽可能被修饰以便至少维持如没有提高其能与HLA-A*02S-DR等合适MHC分子的结合槽相互作用和结合，以及至少维持如没有提高其与启动T淋巴细胞的TCR结合的能力。类似地，TCR可被修饰以便至少维持（如果不提升的话其能与HLA-A或-DR等合适MHC分子KVLEHVVRVSEQIDNO:1复合体相互作用和结合，以及至少维持如果不提升的话启动T细胞的能力。[0134]随后，这些T细胞可与细胞和杀伤细胞发生交叉反应，这些细胞表达多肽，其中包含本说明书中定义的同源肽的天然氨基酸序列，如，KVLEHVVRVSEQIDN0:1。正如科学文献和数据库Rammenseeetal.，1999;Godkinetal·，1997中所述，HLA-A结合肽的某些位点通常为锚定残基，可形成一种与HLA结合槽的结合模序相称的核心序列，其定义由构成结合槽的多肽链的极性、电物理、疏水性和空间特性确定。一方面，本领域技术人员将有能力根据本说明书的教导通过保持已知的锚残基来修饰TCR的氨基酸序列，并且能够确定此类TCR变体是否保持与MHCI类或II类分子KVLEHVVRVSEQIDNO:1复合体结合的能力。描述的TCR变体重新结合MHCI类或II类分子KVLEHVVRVSEQIDNO:1复合体的能力。随后，表达该说明书TCR变体的T细胞可杀伤细胞，这些细胞表达含有同源肽例如KVLEHVVRVSEQIDNO:1天然氨基酸序列的多肽。[0135]—方面，如果无另有说明，那么本文公开的肽或TCR可以通过在肽链内的不同（可能为选择性位点上取代一个或多个残基而被修饰。优选情况是，这些取代位于所述肽氨基酸链的末端。对于TCR，优选情况是，这些取代位于TCRa链和TCRf3链的可变结构域。此取代可能是保守性的，例如，其中一个氨基酸被具有类似结构和特点的另一个氨基酸所取代，比如其中一个疏水性氨基酸被另一个疏水性氨基酸取代。更保守的取代是具有相同或类似的大小和化学性质的氨基酸间的取代，例如，亮氨酸被异亮氨酸取代。在天然同源蛋白质家族序列变异的研究中，某些氨基酸的取代往往比其他氨基酸更具有耐受性，这些氨基酸往往表现出与原氨基酸的大小、电荷、极性和疏水性之间的相似性相关，这是确定“保守取代”的基础。[0136]在本文中，保守取代定义为在以下五种基团之一的内部进行交换:基团1-小脂肪族、非极性或略具极性的残基Ala，Ser，Thr，Pro，Gly;基团2-极性、带负电荷的残基及其酰胺Asp，Asn，Glu，Gln;基团3-极性、带正电荷的残基His，Arg，Lys;基团4-大脂肪族非极性残基Met，Leu，Ile，Val，Cys以及基团5-大芳香残基Phe，Tyr，Trp。[0137]较不保守的取代可能涉及一个氨基酸被另一个具有类似特点但在大小上有所不同的氨基酸所取代，如:丙氨酸被异亮氨酸残基取代。高度不保守的取代可能涉及一个酸性氨基酸被另一个具有极性或甚至具有碱性性质的氨基酸所取代。然而，这种“激进”取代不能认为是无效的而不予考虑，因为化学作用是不完全可预测的，激进的取代可能会带来其简单化学原理中无法预见的偶然效果。[0138]一方面，此类取代可能涉及普通L-氨基酸之外的其他结构。因此，D-氨基酸可能被本说明书的抗原肽中常见的L-氨基酸取代，也仍在本公开的范围之内。此外，非标准氨基酸即，除了常见的天然蛋白原氨基酸也可以用于取代之目的，以生产根据本说明书的免疫原和免疫原性多肽。[0139]如果在一个以上位置上的取代发现导致肽的抗原活性基本上等于或大于以下定义值，则对这些取代的组合进行测试，以确定组合的取代是否产生对肽抗原性的迭加或协同效应。肽内被同时取代的位置最多不能超过4个。[0140]本文所用的术语“鼠”或“人”在提及抗原识别构建体或TCR时，或本文所述的TCR的任何组分例如，互补性决定区（CDR、可变区、恒定区，α链和或β链是指分别源自小鼠或人未经排列的TCR基因座的TCR或其组分）。[0141]T细胞受体TCR[0142]在一项优选的实施方案中，该说明书涉及包含表2所示的TCRa链及其变体、以及表2所示的TCRP链及其变体的TCR。在一方面，本文所述的TCR具有与主要组织兼容性复合体MHCI或II类分子KVLEHVVRVSEQIDN0:1复合体或II类KVLEHVVRVSEQIDN0:1复合体结合或特异性结合的能力。[0143]表2:根据本说明书的代表性TCR[0144]I[0145][0146][0147][0148][0149]aPTCR的α和β链以及γSTCR的γ和δ链通常被认为具有两个“结构域”，即可变和恒定结构域。可变结构域由可变区⑺和连接区（J的组合。可变结构域还可能包括一个前导区（L和δ链还可能包括一个多样区（D3和β恒定结构域还可能包括锚定a和β链至细胞膜的C末端跨膜TM结构域。[0150]因此，在本说明书中，术语“TCRa可变结构域”系指无前导区（L的TCRaVTRAV区和TCRaJTRAJ区的组合;术语“TCRa恒定结构域”系指细胞外TRAC区域或C末端截短TRAC序列，以及任选的a跨膜结构域VIGFRILLLKVAGFNLLMTLSEQIDN0:87。[0151]同样地，术语“TCRf3可变结构域”系指无前导区（L的TCRf3VTRBV区和TCRf3DJTRBDTRBJ区的组合；术语“TCRi3恒定结构域”系指细胞外TRBC区域或C末端截短TRBC序列，以及任选的β跨膜结构域TILYEILLGKATLYAVLVSALVLSEQIDN0:88。[0152]相对于γδΤΟ?，如本文所用的术语“TCRγ可变结构域”系指无前导区（L的TCRγVTRGV区与TCRγJTRGJ区的组合，术语TCRγ恒定结构域系指细胞外TRGC区域或C末端截短TRGC序列。同样地，术语“ΤΟ?δ可变结构域”系指无前导区（L的TCRSVTRDV区与TCRSDJTRDDTRDJ区的组合，术语TCRS恒定结构域系指细胞外TRDC区域或C末端截短TRDC序列。[0153]在一项实施方案中，本说明书的TCR包含与表2中所述的TCRa链为至少75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%、优选为90%、95%、96%、97%、98%或99%同一的TCRa链或由其组成。表2中所述的TCRa链包含前导（L段、V链、三个互补决定区CDRUCDR2和CDR3、接合区域⑴和恒定区域，如表2所定义。[0154]在一项实施方案中，本说明书的TCR包含与表2中所述的TCRa可变结构域至少为75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%、优选为90%、95%、96%、97%、98%或99%同一的TCRa可变结构域或由其组成。[0155]在一项实施方案中，本说明书的TCR包含与表2中所述的TCRa恒定结构域至少为75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%、优选为75%同一的TCRa恒定结构域或由其组成。[0156]在一项实施方案中，本说明书的TCR包含TCRa可变结构域或由其组成，TCRa可变结构域包含至少一个选自表2中所示的a链⑶Rl、CDR2和⑶R3的a链互补决定区（CDR。在一项优选实施方案中，TCRa可变结构域包含表2所示的a链CDR3。在另一项优选实施方案中，TCRa可变结构域包含表2所示的α链⑶Rl、⑶R2和⑶R3。[0157]在一项特别优选的实施方案中，本说明书的TCR包含与表2的TCRa可变结构域具有至少90%序列同一性的TCRa可变结构域，或由其组成，并且包含表2中相同a可变结构域的CDRUCDR2和CDR3。[0158]在一项实施方案中，本说明书的TCR包含与表2中所述的TCRf3链至少为75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%、优选为90%、95%、96%、97%、98%或99%同一的TCRf3链或由其组成。表2中所述的TCRf3链包含前导（L段、V链、三个互补决定区CDRUCDR2和CDR3、接合区域⑴和恒定区域，如表2所定义。[0159]在一项实施方案中，本说明书的TCR包含与表2中所述的TCRP可变结构域至少为75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%、优选为90%、95%、96%、97%、98%或99%同一的TCRP可变结构域或由其组成。[0160]在一项实施方案中，本说明书的TCR包含与表2中所述的TCRP恒定结构域至少为75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%、优选为75%同一的TCRf3恒定结构域或由其组成。[0161]在一项实施方案中，本说明书的TCR包含TCRf3可变结构域或由其组成，TCRf3可变结构域包含至少一个选自表2中所示的β链⑶Rl、CDR2和⑶R3的β链互补决定区（CDR。在一项优选实施方案中，TCRa可变结构域包含表2所示的β链CDR3。在另一项优选实施方案中，TCRP可变结构域包含表2所示的β链⑶Rl、⑶R2和⑶R3。[0162]在一项特别优选的实施方案中，本说明书的TCR包含与表2的TCRP可变结构域具有至少90%或95%序列同一性的TCRf3可变结构域，或由其组成，并且包含表2中相同TCRf3可变结构域的CDRl、CDR2和CDR3。[0163]a链可变结构域可包含一个或多个aCDR结构域，其相对于表2所示的相应CDR序列具有一个、两个、三个或四个氨基酸取代。同样地，β链可变结构域可包含一个或多个KDR结构域，其相对于表2所示的相应PCDR序列具有一个、两个、三个或四个氨基酸取代。[0164]TCRa链和TCRP链可以融合形成单链TCR。另一方面，TCRa和β链可以表达为可以组装成异二聚体的分离蛋白。[0165]在一项实施方案中，表2的任何TCRa链与表2的任何TCRP链配对以产生特异性结合MAG-003肽HLA分子复合体的TCR。[0166]TCRR20P1H7[0167]在一项实施方案中，本说明书的TCR分别包含对应于SEQIDN0:39和47的TCRR20PlH7a链和或β链或由其组成。[0168]TCRR20P1H7的TCRa可变结构域包含SEQIDΝ0:39的氨基酸22至133,或者由其组成；TCRR20P1H7的TCRa恒定结构域包含SEQIDΝ0:39的氨基酸134-275,或者由其组成；TCRR20P1H7的TCRP可变结构域包含SEQIDΝ0:47的氨基酸20至135,或者由其组成；TCRP恒定结构域包含SEQIDΝ0:47的氨基酸136至315,或者由其组成。[0169]在一项特别的实施方案中，本说明书的TCR包含与SEQIDΝ0:39的TCRa链至少为75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%、优选为90%、95%、96%、97%、98%或99%同一的TCRa链。[0170]在另一项实施方案中，本说明书的TCR包含与SEQIDNO:39的TCRa可变结构域至少为75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%、优选为90%、0.95%、96%、97%、98%或99%同一的TCRa可变结构域。[0171]在一项实施方案中，本说明书的TCR包含与SEQIDNO:39的TCRa恒定结构域至少为75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%、优选为75%同一的TCRa恒定结构域。[0172]在一项实施方案中，本说明书的TCR包含TCRa可变结构域，TCRa可变结构域包含至少一个选自SEQIDNO:39的a链⑶Rl、CDR2和⑶R3的a链互补决定区（CDR。在一项优选实施方案中，TCRa可变结构域包含SEQIDNO:39的a链⑶R3。在另一项优选实施方案中，TCRa可变结构域包含SEQID从:39的〇链〇1?1、〇1?2和01?3。[0173]在一项特别优选的实施方案中，本说明书的TCR包含与SEQIDN0:39的TCRa可变结构域具有至少90%或95%序列同一性的TCRa可变结构域，并且包含SEQIDNO:39的CDRUCDR2和CDR3。[0174]在另一项特别的实施方案中，本说明书的TCR包含与SEQIDN0:47的TCRP链至少为75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%、优选为90%、95%、96%、97%、98%或99%同一的TCRP链。[0175]在一项实施方案中，本说明书的TCR包含与SEQIDN0:47的TCRf3可变结构域至少为75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%、优选为90%、95%、96%、97%、98%或99%同一的TCRP可变结构域。[0176]在一项实施方案中，本说明书的TCR包含与SEQIDN0:47的TCRf3恒定结构域至少为75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%、优选为75%同一的TCRP恒定结构域。[0177]在一项实施方案中，本说明书的TCR包含TCRf3可变结构域，TCRf3可变结构域包含至少一个选自SEQIDNO:47的β链⑶Rl、CDR2和⑶R3的β链互补决定区（CDR。在一项优选实施方案中，TCRf3可变结构域包含SEQID勵:36的的连^1«。在另一项优选实施方案中，1'0^可变结构域包含SEQID从:47的齡连01?1、01?2和01?3。[0178]在一项特别优选的实施方案中，本说明书的TCR包含与SEQIDN0:47的TCRP可变结构域具有至少90%或95%序列同一性的TCRP可变结构域，并且包含SEQIDN0:47的CDRUCDR2和CDR3。[0179]a链可变结构域可包含一个或多个aCDR结构域，其相对于SEQIDNO:39的相应⑶R序列具有一个、两个、三个或四个氨基酸取代。同样地，β链可变结构域可包含一个或多个βCDR结构域，其相对于SEQIDΝ0:47的相应KDR序列具有一个、两个、三个或四个氨基酸取代。[0180]TCRR7P1D5[0181]在一项实施方案中，本说明书的TCR分别包含对应于SEQIDΝ0:55和63的TCRR7PlD5a链和或β链或由其组成。[0182]TCRR7P1D5的TCRa可变结构域包含SEQIDΝ0:55的氨基酸22至131，或者由其组成；TCRR7P1D5的TCRa恒定结构域包含SEQIDΝ0:55的氨基酸132至272,或者由其组成；TCRR7P1D5的TCRP可变结构域包含SEQIDΝ0:63的氨基酸20至131，或者由其组成；TCRP恒定结构域包含SEQIDΝ0:63的氨基酸132至310,或者由其组成。[0183]在一项特别的实施方案中，本说明书的TCR包含与SEQIDN0:55的TCRa链至少为75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%、优选为90%、95%、96%、97%、98%或99%同一的TCRa链。[0184]在另一项实施方案中，本说明书的TCR包含与SEQIDNO:55的TCRa可变结构域至少为75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%、优选为90%、95%、96%、97%、98%或99%同一的TCRa可变结构域。[0185]在一项实施方案中，本说明书的TCR包含与SEQIDNO:55的TCRa恒定结构域至少为75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%、优选为75%同一的TCRa恒定结构域。[0186]在一项实施方案中，本说明书的TCR包含TCRa可变结构域，TCRa可变结构包含至少一个选自SEQIDNO:55的a链⑶Rl、CDR2和⑶R3的a链互补决定区（CDR。在一项优选实施方案中，TCRa可变结构域包含SEQIDNO:55的a链⑶R3。在另一项优选实施方案中，TCRa可变结构域包含SEQID从:55的〇链〇1?1、〇1?2和01?3。[0187]在一项特别优选的实施方案中，本说明书的TCR包含与SEQIDN0:55的TCRa可变结构域具有至少90%或95%序列同一性的TCRa可变结构域，并且包含SEQIDN0:55的CDRUCDR2和CDR3。[0188]在另一项特别的实施方案中，本说明书的TCR包含与SEQIDN0:63的TCRP链至少为75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%、优选为90%或95%同一的TCRP链。[0189]在一项实施方案中，本说明书的TCR包含与SEQIDN0:63的TCRf3可变结构域至少为75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%、优选为90%、95%、96%、97%、98%或99%同一的TCRP可变结构域。[0190]在一项实施方案中，本说明书的TCR包含与SEQIDN0:63的TCRf3恒定结构域至少为75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%、优选为75%同一的TCRP恒定结构域。[0191]在一项实施方案中，本说明书的TCR包含TCRf3可变结构域，TCRf3可变结构域包含至少一个选自SEQIDNO:63的β链⑶Rl、CDR2和⑶R3的β链互补决定区（CDR。在一项优选实施方案中，TCRf3可变结构域包含SEQIDΝ0:63的β链⑶R3。在另一项优选实施方案中，TCRf3可变结构域包含SEQID从:63的齡连01?1、01?2和01?3。[0192]在一项特别优选的实施方案中，本说明书的TCR包含与SEQIDN0:63的TCRP可变结构域具有至少90%或95%序列同一性的TCRP可变结构域，并且包含SEQIDN0:63的CDRUCDR2和CDR3。[0193]a链可变结构域可包含一个或多个aCDR结构域，其相对于SEQIDNO:55的相应⑶R序列具有一个、两个、三个或四个氨基酸取代。同样地，β链可变结构域可包含一个或多个βCDR结构域，其相对于SEQIDΝ0:63的相应KDR序列具有一个、两个、三个或四个氨基酸取代。[0194]TCRR10P2G12[0195]在一项实施方案中，本说明书的TCR分别包含分别对应于SEQIDNO:71和79的TCRR10P2G12a链和或β链或由其组成。[0196]TCRR10P2G12的TCRa可变结构域包含SEQIDN0:71的氨基酸21至136,或者由其组成;TCRR10P2G12的TCRa恒定结构域包含SEQIDN0:71的氨基酸137至277,或者由其组成；TCRR10P2G12的TCRP可变结构域包含SEQIDN0:79的氨基酸20至134,或者由其组成；TCRf3恒定结构域包含SEQIDNO:79的氨基酸135至313,或者由其组成。[0197]在一项特别的实施方案中，本说明书的TCR包含与SEQIDN0:71的TCRa链至少为75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%、优选为90%、95%、96%、97%、98%或99%同一的TCRa链。[0198]在另一项实施方案中，本说明书的TCR包含与SEQIDN0:71的TCRa可变结构域至少为75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%、优选为90%、95%、96%、97%、98%或99%同一的TCRa可变结构域。[0199]在一项实施方案中，本说明书的TCR包含与SEQIDN0:71的TCRa恒定结构域至少为75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%、优选为75%同一的TCRa恒定结构域。[0200]在一项实施方案中，本说明书的TCR包含TCRa可变结构域，TCRa可变结构包含至少一个选自SEQIDNO:71的a链⑶Rl、CDR2和⑶R3的a链互补决定区（CDR。在一项优选实施方案中，TCRa可变结构域包含SEQIDNO:60的a链⑶R3。在另一项优选实施方案中，TCRa可变结构域包含SEQID从:71的〇链〇1?1、〇1?2和01?3。[0201]在一项特别优选的实施方案中，本说明书的TCR包含与SEQIDN0:71的TCRa可变结构域具有至少90%或95%序列同一性的TCRa可变结构域，并且包含SEQIDN0:71的CDRUCDR2和CDR3。[0202]在另一项特别的实施方案中，本说明书的TCR包含与SEQIDN0:79的TCRP链至少为75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%、优选为90%、95%、96%、97%、98%或99%同一的TCRP链。[0203]在一项实施方案中，本说明书的TCR包含与SEQIDN0:79的TCRf3可变结构域至少为75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%、优选为90%、95%、96%、97%、98%或99%同一的TCRP可变结构域。[0204]在一项实施方案中，本说明书的TCR包含与SEQIDN0:79的TCRf3恒定结构域至少为75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%、优选为75%同一的TCRP恒定结构域。[0205]在一项实施方案中，本说明书的TCR包含TCRf3可变结构域，TCRf3可变结构域包含至少一个选自SEQIDNO:68的β链⑶Rl、CDR2和⑶R3的β链互补决定区（CDR。在一项优选实施方案中，TCRf3可变结构域包含SEQIDΝ0:68的β链⑶R3。在另一项优选实施方案中，TCRf3可变结构域包含SEQID从:79的齡连01?1、01?2和01?3。[0206]在一项特别优选的实施方案中，本说明书的TCR包含与SEQIDN0:79的TCRP可变结构域具有至少90%或95%序列同一性的TCRP可变结构域，并且包含SEQIDNO:79的CDRUCDR2和CDR3。[0207]a链可变结构域可包含一个或多个aCDR结构域，其相对于SEQIDN0:71的相应⑶R序列具有一个、两个、三个或四个氨基酸取代。同样地，β链可变结构域可包含一个或多个βCDR结构域，其相对于SEQIDΝ0:79的相应KDR序列具有一个、两个、三个或四个氨基酸取代。[0208]在一项进一步优选的实施方案中，本说明书的TCR特异性结合MAG-003肽-HLA分子复合体，其中MAG-003肽选自KVLEHVVRVSEQIDN0:1及其变体，例如在SEQIDN0:2至SEQIDNO:24中所示的那些。在一项实施方案中，HLA分子是选自HLA-A、HLA-B和HLA-C分子的I类MHC分子。在一项实施方案中，HLA分子是HLA-A*02。在另一项实施方案中，HLA分子是选自由HLA-DP和HLA-DR分子组成的组的II类MHC分子。[0209]本说明书的TCR优选结合至MAG-003肽HLA分子复合体，其具有约ΙΟΟμΜ或更小、约50μΜ或更小、约25μΜ或更小或约ΙΟμΜ或更小的结合亲和力Kd。更为优选的情况是具有约1μΜ或更小、约IOONm或更小、约50ηΜ或更小或约25ηΜ或更小结合亲和力的高亲和力TCR。本说明书的TCR优选结合亲和力范围的非限制性示例包括约InM至约IOnM;约IOnM至约20ηΜ;约20ηΜ至约30ηΜ;约30ηΜ至约40ηΜ;约40ηΜ至约50ηΜ;约50ηΜ至约60ηΜ;约60ηΜ至约70ηΜ;约70ηΜ至约80ηΜ;约80ηΜ至约90ηΜ;以及约90ηΜ至约ΙΟΟηΜ。[0210]与本说明书TCR相关，本文使用的“特异性结合”及其语法变体用于指对MAG-003肽-HLA分子复合体有ΙΟΟμΜ或更小的结合亲和力KD的TCR。[0211]本说明书的αβ异二聚体TCR可以具有其恒定结构域之间的引入二硫键。这种类型的优选TCR包括具有TRAC恒定域序列和TRBCl或TRBC2恒定域序列的TCR，除TRAC的那苏氨酸48和TRBCl或TRBC2的丝氨酸57由半胱氨酸残基取代外，所述半胱氨酸形成TRAC恒定域序列和TCR的TRBCl或TRBC2恒定区序列之间的二硫键。[0212]不论具有或不具有上述的引入链间键，本说明书的αβ杂二聚体TCR可以具有TRAC恒定域序列和TRBCl或TRBC2恒定结构域序列，并且TRAC恒定结构域序列和TCR的TRBCl或TRBC2恒定结构域序列可以通过TRAC外显子2的Cys4和TRBCl或TRBC2外显子2的Cys4之间的天然二硫键相连。[0213]本说明书的TCR可以包括选自放射性核素、荧光团和生物素的可检测标记。本说明书的TCR可以结合至治疗活性剂，如放射性核素、化学治疗剂或毒素。[0214]在一项实施方案中，在α链中具有至少一个突变和或在β链中具有至少一个突变的TCR与未突变的TCR相比，具有修饰的糖基化。[0215]在一项实施方案中，在TCRa链和或TCRP链中包括至少一个突变的TCR对MAG-003肽HLA分子复合体有结合亲和力和或结合半衰期，其是包含未突变TCRa链和或未突变TCRβ链的TCR的结合亲和力的至少两倍。肿瘤特异性TCR亲和力增强及其开发依赖于存在最佳TCR亲和力的窗口。这样窗口的存在是根据观察结果:HLA-A2限制性病原体特异性TCR与HLA-A2限制性肿瘤相关自身抗原特异性TCR相比，KD值通常大约低10倍（Aleksicetal.2012;Kunertetal.2013。现已知，尽管肿瘤抗原可能具有免疫原性，但是因为肿瘤来自个体自身的细胞，因此仅突变蛋白质或翻译加工改变的蛋白将将被免疫系统视为外来物质。上调或过度表达所谓的自体抗原）的抗原不一定诱导针对肿瘤的功能免疫应答:表达对这些抗原具有高度反应性的TCR的T细胞会在一种称为中枢耐受的程序中在胸腺内被不利选择Xingetal.2012;Ruellaetal.2014;Sharpeetal.2015，也就是说只有对自身抗原具有低亲和力TCR的细胞才仍然存在。因此，本说明书的TCR或变体对MAG-003的亲和力可通过本领域熟知的方法来增强，如下文所述。[0216]MAG-003肽[0217]本说明书提出了一种肽，其包括选自SEQIDNO:1至SEQIDN0:24的序列、或与SEQIDNO:1至SEQIDNO:24具有88%同源性的其变体、或诱导T细胞与本文所述的肽发生交叉反应的变体的序列。一方面，本说明书的肽具有与主要组织兼容性复合体MHCI类分子结合或以本文肽的延长版本与Π类分子结合的能力。一方面，本文所述的TCR能够与本文所述的肽结合或特异性结合。[0218]在人类中，有三种编码MHCI类分子的不同基因位点（人MHC分子也是指定的人白细胞抗原HLA:HLA-A、HLA-B和HLA-C13HLA-A^l、HLA-A*02和HLA-B*07是可从这些基因位点表达的不同MHCI类等位基因的实例。[0219]表3:HLA-A*02和HLA-A*24和最常见HLA-DR血清类型的表达频率F。频率根据Mori等人Morietal·，1997使用的Hardy-Weinberg公式F=I-I-Gf2改编，从美国人群范围内的单体型频率中推导出。由于连锁不平衡，某些HLA-DR等位基因内的A*02或A*24组合与其预期单一频率相比，可能是浓缩的或频率较低。有关详细信息，请参阅Chanock等人的文献（Chanocketal·，2004。[0220]表3[0221][0222][0223][0224]MAGEA4基因[0225]本基因是MAGEA基因家族的一员。该家族的成员将具有50至80%序列同一性的蛋白质进行相互编码。MAGEA基因的启动子和第一个外显子显示出相当大的变异性，表明该基因家族的存在能够在不同的转录控制下表达相同的功能。MAGEA基因聚簇于染色体位置Xq28。他们牵涉某些遗传性疾病，如先天性角化不全。对于该基因已经发现了至少四种编码相同蛋白质的变体。（由RefSeq提供，2008年7月）。[0226]MAGEA4位置被描述为在细胞质内（Kimetal.，2015。但是，在细胞核中也检测到了MAGEA4染色，在分化良好与分化较差的癌症中细胞核和细胞质之间具有差异性分布Sarcevicetal·，2003。[0227]MAGEA4用作一种雄性生殖细胞标志物。它在细胞中不表达，但在精原细胞和成熟生殖细胞中表达Mitchelletal·，2014。[0228]表4:一般癌症靶点[0229][0230][0231]1TGF=转化生长因子;PI3K=磷脂酰肌醇3激酶;p53=细胞肿瘤抗原p53;EGFR=上皮生长因子受体;FGF2=成纤维细胞生长因子2;Wnt=Wnti3-连环蛋白通路胚胎发生）；Ras=大鼠肉瘤原癌基因；NF-kB=核因子κB真核转录因子2CY=细胞质;3TU=肿瘤细胞[0232]pMHC作为靶点[0233]一项I期临床试验研究了食管癌患者中TCR工程化自体CTL的过继转移对与HLA-A*24:02结合的MAGEA4143-151的反应。给予患者TCR转导淋巴细胞一次，无需预处理，随后在2和4周后用MAGEA4肽进行皮下免疫。未观察到目标肿瘤消退，可能是由于缺乏淋巴细胞凋亡方案和给予了IL2Kageyamaetal.，2015。在小鼠中的临床前研究已证明，转移的T细胞抑制了在小鼠中接种的MAGEA4表达肿瘤细胞系的生长，额外的肽疫苗接种增强了这种抗肿瘤活性Shirakuraetal·，2012。[0234]提出了以过继CTL转移靶向作用于MAGEA4作为EBV阴性霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤的治疗方案。靶向作用于EBV衍生肽的输注CTL被描述为可在EBV+淋巴瘤患者中诱导完全缓解。因此，靶向作用于淋巴瘤包括MAGEA4表达的其他抗原正在进行探索，作为一种可能的治疗方案（Cruzetal.，2011;Gerdemannetal.，2011〇[0235]几项研究已证明，在与重迭肽库进行脉冲的自体抗原呈递细胞孵育后，健康供体和癌症患者可产生MAGEA4特异性CD4+T细胞（Cessonetal·，2011;Gerdemannetal·，201I;Ohkurietal.，2009。[0236]MAG-003肽，BPKVLEHWRVSEQIDNO:1是MAGEA4氨基酸286-294的一种HLA-A*0201限制性细胞毒性T淋巴细胞CTL表位。（Jiaetal.2010;Wuetal.2011中的内容通过引用整体并入本文。一方面，MAG-003在体外从HLA-A*0201阳性PBMC和在HLA-A*0201Kb转基因小鼠中引发特异性CTL。另一方面，诱导的CTL以HLA-A*0201限制性方式裂解靶细胞，证明MAG-003是HLA-A*0201限制性CTL表位并充当治疗性抗肿瘤疫苗接种的靶标Jiaetal.2010，该文中的内容通过引用整体并入本文。[0237]图1显示了健康组织和癌症中MAG-003肽提呈。结果总结在表5中。具体而言，在分别来自卵巢癌OC和非小细胞肺癌NSCLC的肿瘤组织中，估计每个细胞约有4,000和2，OOO拷贝的MAG-003。[0238]表5:健康组织和癌症中MAG-003的提呈。[0239][0240]编码本说明书肽的基因表达谱[0241]与健康细胞相比在肿瘤细胞上TAA过度提呈或特定提呈足够其在免疫治疗中有效使用，一些肽为肿瘤特异性的，尽管存在其源蛋白也存在于健康组织中。但是，mRNA表达谱增加了免疫治疗目标肽选择中其他级别的安全性。特别是对于具有高安全性风险的治疗选择，诸如亲和力成熟的TCR，理想的目标肽将来源于对该肿瘤独一无二且不出现于健康组织中的蛋白。[0242]RNA来源与制备[0243]手术切除组织标本按如上所述在获得每名患者的书面知情同意后提供。手术后立即速冻肿瘤组织标本，之后在液态氮中用杵臼匀浆。使用TRI试剂Ambion公司，达姆施塔特，德国）之后用RNeasyQIAGEN公司，希尔登，德国）清理从这些样本中制备总RNA;这两种方法都根据制造商的方案进行。[0244]RNAseq实验[0245]通过新一代测序技术RNAseq由CeGaT蒂宾根，德国）对肿瘤和健康组织的RNA样本进行基因表达分析。根据供货商的方案（IlluminaInc.，SanDiego,加州，美国），其中包括RNA碎片化、cDNA转化和测序适配器的加入，利用IlluminaHiSeqv4试剂盒准备测序文库。从多个样本获得的文库根据制造商的说明等摩尔混合并在IlluminaHiSeq2500序列发生器上测序，产生50bp的单端读数。处理的读数使用STAR软件映像至人类基因组GRCh38。根据ENSEMBL序列数据库的说明（Ensembl77，表达资料在转录水平设置为RPKM每百万映射读数每千碱基读数，由Cufflinks软件生成并在外显子水平上设置总读数，由Bedtools软件生成）。外显子读数被归为外显子长度和校准尺寸，以获得RPKM值。[0246]如图2-4所示，与高风险和中等风险的健康组织相比，MAG-003在癌组织和低风险健康组织如睾丸）中高度表达。[0247]表6-8显示了各种癌症中MAG-003表达的RNASeq资料表达得分）[0248]表6:RNASeq分数1[0249][0255]—方面，基本上由本文所指氨基酸序列组成的一种肽可以有一个或两个非锚定氨[0250][0251][0252][0253][0254]基酸见下面锚基序相关内容被交换，而不存在这种情况，即相比于未修饰的肽，与人类主要组织兼容性复合体MHC-I或II类分子的能力基本上被改变或受到不利影响。在另一实施方案中，在基本上由本文所述氨基酸序列组成的肽中，一个或两个氨基酸可与其保守交换伙伴交换见下文），而不存在这种情况，即相比于未修饰的肽，与人类主要组织兼容性复合体MHC-I或II类分子的能力基本上被改变或受到不利影响。[0256]基本不与TCR体互动的氨基酸残基可通过取代其他几乎不影响T细胞反应并不妨碍与相关MHC结合的氨基酸而得到修饰。因此，除了特定限制性条件外，本说明书中的肽可能为任何包括给定氨基酸序列或段或变体的肽发明人所用的这个术语包括寡肽或多肽）。[0257]表9:肽的变体和基序[0258][0260]较长延长）的肽也可能适合。MHCI类表位尽管通常为实际表位是在加工过程中几乎不影响暴露实际表位所需蛋白裂解的残基。[0261]本说明书的肽可被拉长多达四个氨基酸，S卩1、2、3或4个氨基酸可以以8至11个氨基酸长度的任意组合加至任一端，并通过从包含实际表位的较长肽或蛋白的肽加工而生成。优选侧翼的残基在4:0至0:44的范围内。本说明书的延长组合见表10。[0262]表10:本说明书肽的拉长组合[0263][0264][0265]延伸延长的氨基酸可以是所述蛋白或任何其他氨基酸的原序列肽。延长可用于增强所述肽的稳定性或溶解性。[0266]因此，本发明所述的表位可能与天然肿瘤相关表位或肿瘤特异性表位相同，也可能包括来自参考肽的不超过四个残基的不同肽，只要它们有基本相同的抗原活性即可。[0267]在一项替代实施方案中，肽的一边或双边被延长4个以上的氨基酸，优选最多30个氨基酸的总长度。这可形成MHC-II类结合肽。结合至MHCII类肽可通过本领域中已知的方法进彳丁测试。[0268]因此，本发明提出了MHCI类表位的肽和变体，其中所述肽或抗体的总长度为8至100个、优选为8至30个、最优选为8至14个氨基酸长度S卩10、11、12、13、14个氨基酸，如果为延长II类结合肽时，长度也可为15、16、17、18、19、20、21或22个氨基酸）。[0269]当然，本发明的肽或变体能与人主要组织兼容性复合体MHCI或II类分子结合。肽或变体与MHC复合物的结合可用本领域内的已知方法进行测试。[0270]优选情况是，当本发明的肽特异性T细胞相比于取代肽受到检测时，如果取代肽在相对于背景肽溶解度增加达到最大值的一半，则该肽浓度不超过约ImM，优选为不超过约1μM，更优选为不超过约InM，再优选为不超过约ΙΟΟρΜ，最优选为不超过约ΙΟρΜ。也优选为，取代肽被一个以上的T细胞识别，最少为2个，更优选为3个。[0271]本文所用的术语“复合体”系指与（如抗原性决定因子特异性结合的分子。在一项实施方案中，复合体是能够引导其所连接的实体例如，（第二抗原结合部分至目标靶点，例如，至特定类型的肿瘤细胞或承载抗原决定簇的肿瘤基质如根据目前申请中肽和MHC的复合体）。在另一项实施例中，复合体能够通过其靶抗原（例如T细胞受体复合体抗原）启动信号通路。复合体包括但不限于抗体及其片段，抗体的抗原结合区，其包含抗体重链可变区和抗体轻链可变区，结合的蛋白包括至少一个锚蛋白重复序列基元和单域抗原结合SDAB分子、适体、（可溶TCR和经修饰的）细胞，例如同种异体或自体T细胞。为了评估某个分子是否是结合至靶点的复合体，可进行结合测定。[0272]“特定”结合系指，与其他天然肽-MHC复合体相比，该复合体如，TCR与相关的肽-MHC复合体更好地结合，结合程度为，拥有能够杀死承载特定靶点细胞的活性分子的复合体不能够杀死无特定靶点但提呈一个或多个其他肽-MHC复合体的另一细胞。如果交叉反应性肽-MHC的肽并不是天然的，S卩，并非来自人HLA-多肽组，则结合至其他肽-MHC复合体是无关紧要的。评估靶细胞杀伤的测试在本领域中是公知的。它们应该含有未改变的肽-MHC提呈的靶细胞原发细胞或细胞系或载有肽的细胞进行，以便达到天然肽-MHC的水平。[0273]各复合体可包括一个标记，其通过确定是否存在或不存在卷标所提供的信号可检测到结合复合体。例如，该复合体可用荧光染料或任何其他适用的细胞标记分子进行标记。此类标记分子是本领域中公知的。例如，通过荧光染料进行的荧光标记可通过荧光或激光扫描显微术或流式细胞术提供结合适体的可视化。[0274]各复合体可与第二个活性分子例如IL-21、抗⑶3、抗⑶28结合。[0275]关于多肽复合体的更多信息可见例如WO2014071978A1的背景部分，其通过引用整体并入。[0276]“药物组合物”是指适合在医疗机构用于人体的组合物。优选地，药物组合物为无菌状态，并根据GMP指南生产。[0277]本说明书的药物组合物还包括至少一种TCR、可溶性TCR、核酸和或在一种药学上可接受的载体中表达本说明书中TCR的宿主细胞。[0278]本说明书的药物组合物还可以包括药学上可接受的辅料和或稳定剂。[0279]此组合药物为非肠道注射使用，如皮下、皮内、肌肉注射，也可口服。为此，肽和其他选择性分子在药学上可接受的载体中分解或悬浮，优选为水载体。此外，组合物可包含辅料，如:缓冲剂、结合剂、冲击剂、稀释剂、香料、润滑剂等。这些肽也可与免疫刺激物质合用，如：细胞因子。可用于此类组合物的更多赋形剂可在从A.Kibbe所著的HandbookofPharmaceuticalExcipientsKibbe，2000等书中获知。此组合药物可用于阻止、预防和或治疗腺瘤或癌性疾病。示例性制剂可见EP2112253,其通过引用整体并入本文。[0280]另一方面，本发明提出了一种编码本发明中肽或肽变体、TCR蛋白和TCR变体的核酸（如多聚核苷酸）。多聚核苷酸可以为，例如，DNA、cDNA、PNA、RNA或其组合物，它们可为单链和或双链、或多聚核苷酸的原生或稳定形式如:具有硫代磷酸骨架的多聚核苷酸），并且只要它编码肽，就可能包含也可能不包含内含子。当然，多聚核苷酸只能编码加入天然肽键并含有天然氨基酸残基的肽。另一个方面，本发明提出了一种可根据本发明表达多肽的表达载体。[0281]对于连接多核苷酸，已经开发出多种方法，尤其是针对DNA，可通过向载体补充可连接性末端等方法进行连接。例如，可向DNA片段加入补充性均聚物轨道，之后DNA片段被插入到载体DNA。然后，通过补充性均聚物尾巴的氢键结合，将载体和DNA片段结合，从而形成重组DNA分子。[0282]含有一个或多个酶切位点的合成接头为DNA片段与载体连接提供了另一种方法。含各种限制性核酸内切酶的合成接头可通过多种管道购得，其中包括从国际生物技术公司InternationalBiotechnologiesInc，NewHaven，康涅狄格州，美国）购得。[0283]编码本发明多肽的DNA理想修饰方法是使用Saiki等人Saikietal.，1988所采用的聚合酶链反应方法。此方法可用于将DNA引入合适的载体例如，通过设计合适的酶切位点），也可用于本领域已知的其他有用方法修饰DNA。如果使用病毒载体，痘病毒载体或腺病毒载体为优选。[0284]—方面，为了获得表达本说明书TCR的T细胞，编码本说明书TCR-α和或TCR-β链的核酸被克隆入表达载体，诸如γ逆转录病毒或慢病毒。重组病毒产生，然后测试功能，如抗原专一性和功能性亲合力。然后，最终产品的等分试样被用于转导靶T细胞群体一般纯化自患者的PBMC，在输入患者前展开。[0285]另一方面，为了获得表达本说明书TCR的T细胞，TCRRNA通过本领域中已知的技术例如，体外转录系统合成。然后，体外合成的TCRRNA通过电穿孔来重新表达肿瘤特异性TCR-a和或TCR-β链被引入获得自健康供体的原代⑶8+T细胞。[0286]引入外周T细胞的TCR链可能与内源性TCR链竞争，与TCR表面表达所需的⑶3复合体结合。由于高水平的TCR表面表达对通过表达肿瘤靶抗原的细胞触发赋予适当的灵敏度是必要的（Cooperetal.，2000;Labrecqueetal.，2001，因此增强TCR-a和TCR-β基因表达水平的策略是TCR基因治疗中的重要考虑因素。[0287]为了增加表达，编码本说明书TCR的核酸在操作上可连接到强启动子，例如逆转录病毒长末端重复序列（LTR、巨细胞病毒CMV、鼠干细胞病毒MSCVU3、磷酸甘油酸激酶PGK、β-肌动蛋白、泛素蛋白和猿猴病毒40SV40CD43复合启动子（Cooperetal·，2004;Jonesetal.，2009、拉长因子EF-IaTsujietal.，2005和脾脏病灶形成病毒SFFV启动子Josephetal.，2008。在一优选实施方案中，启动子与被表达的核酸异源。[0288]除了强启动子外，本说明书的TCR表达盒可能含有附加的元素，可提高转基因表达，包括中枢多聚嘌呤区（CPPT，其促进了慢病毒构建体的核易位Follenzietal.，2000，和土拨鼠肝炎病毒转录后调控元素WPRE，其通过提高RNA稳定性增加转基因表达水平（Zuffereyetal·，1999。[0289]本发明TCR的α和β链可由位于分开的载体核酸进行编码，或者可通过位于同一载体的多核苷酸编码。[0290]实现高水平的TCR表面表达需要引入TCR的TCR-α和TCR-β链高水平转录。为了实现它，本说明书的TCR-a和TCR-β链可在单一的载体中被克隆入双顺反子构建体，其已被证明能够克服这一障碍。使用TCR-a和TCR-β链在之间的病毒核糖体间进入位点（IRES导致两链的协同表达，因为TCR-a和TCR-β链均由在翻译过程中分成两个蛋白质的单一转录物产生，从而确保了产生TCR-a和TCR-β链的相等摩尔比。（Schmittetal.2009。[0291]编码本说明书TCR的核酸可以是被优化以从宿主细胞增加表达的密码子。遗传密码冗余让一些氨基酸被一个以上的密码子编码，但某些密码子没有其他密码子“理想”，因为匹配tRNA以及其他因子的相对可用性Gustafssonetal.，2004。修改TCR-α和TCR-PS因序列使得每个氨基酸被用于哺乳动物基因表达的最佳密码子编码，以及消除mRNA不稳定性基序或隐蔽剪接位点，已显示可显著提高TCR-a和TCR-β基因表达（Scholtenetal.，2006〇[0292]此外，引入的和内源性TCR链之间的错配可能会导致获得特异性，这些特异性对自身免疫构成显著风险。例如，混合TCR二聚体的形成可能会减少可用以形成正确配对TCR复合体的CD3分子数目，因此，可以显著降低表达所引入TCR的细胞的功能性亲合力（Kuballetal·，2007〇[0293]为了减少错配，本说明书引入的TCR链的C-末端结构域可以进行修改以促进链间亲和力，而降低引入链与内源TCR配对的能力。这些策略可能包括用鼠配对物取代人类TCR-α和TCR-K端结构域（鼠化C端结构域）；通过引入第二半胱氨酸残基到引入TCR的TCR-α和TCR-β链产生C末端结构域的第二间二硫键半胱氨酸修饰）；交换TCR-a和TCR-β链C端结构域的相互作用残基（“杵臼结构；直接熔合TCR-a和TCR-β链可变结构域至CD3GCD3G融合）。（Schmittetal.2009。[0294]之后，DNA或在逆转录病毒载体情况下，RNA可能表达于合适的宿主，从而制成含本说明书肽或变体的多肽。因此，可根据已知技术使用编码本说明书肽或变体的DNA，用本文所述方法适当修饰后，构建表达载体，然后表达载体用于转化合适宿主细胞，从而表达和产生本说明书中的多肽。此类技术包括那些公开于，例如，美国专利4,440,859、4,530,901、4,582,800、4,677,063、4,678,751、4,704,362、4,710,463、4,757,006、4,766,075和4,810，648的技术，其通过引用整体并入本文。[0295]编码含本说明书化合物多肽的DNA或在逆转录病毒载体情况下，RNA可能被加入到其他多种DNA序列，从而引入到合适的宿主中。同伴DNA将取决于宿主的性质、DNA引入宿主的方式、以及是否需要保持为游离体还是要相互结合。[0296]一般来说，DNA可以适当的方向和正确的表达阅读框架附着到一种表达载体如质粒）中。如有必要，该DNA可能与所需宿主所识别的相应转录和翻译调节控制核苷酸序列连接，尽管表达载体中一般存在此类控制功能。然后，该载体通过标准方法被引入宿主。一般来说，并不是所有的宿主都会被载体转化。因此，有必要选择转化过的宿主细胞。选择方法包括用任何必要的控制元素向表达载体插入一个DNA序列，该序列对转化细胞中的可选择性属性如抗生素耐药性进行编码。[0297]另外，有这种选择属性的基因可在另外一个载体上，该载体用来协同转化所需的宿主细胞。[0298]然后，本说明书中的重组DNA所转化的宿主细胞在本文中所述本领域技术人员熟悉的合适条件下培养足够长的时间，从而表达之后可回收的肽。[0299]有许多已知的表达系统，包括细菌（如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌）、酵母（如酵母菌）、丝状真菌（如曲霉菌）、植物细胞、动物细胞及昆虫细胞。该系统可优选为哺乳动物细胞，如来自ATCC细胞生物学库CellBiologyCollection中的CHO细胞。[0300]在一实施方案中，宿主细胞被改变结构以表达本说明书的TCR。在一优选实施方案中，宿主细胞为人T细胞或T细胞祖细胞。在一些实施方案中，T细胞或T细胞祖细胞从癌症患者中获得。在另一些实施方案中，T细胞或T细胞祖细胞从健康供体中获得。本说明书的宿主细胞相对于待治疗的患者可以为同种异体或自体的。在一实施方案中，宿主是被转化以表达aPTCR的γδτ细胞。[0301]典型的哺乳动物细胞组成型表达载体质粒包括CMV或含一个合适的多聚A尾巴的SV40启动子以及抗性标志物（如新霉素）。一个实例为从Pharmacia公司（Piscataway，新泽西州，美国）获得的PSVL。一种可诱导型哺乳动物表达载体的例子是pMSG，也可以从Pharmacia公司获得。有用的酵母质粒载体是pRS403-406和pRS413-416,一般可从StratageneCloningSystems公司（LaJolla，加州92037,美国）获得。质粒pRS403、pRS404、pRS405和pRS406是酵母整合型质粒YIp，并插入了酵母可选择性标记物HIS3、TRPl、LEU2和111^3^1^413-416质粒为酵母着丝粒质粒Ycp。基于CMV启动子的载体如，来自于Sigma-Aldrich公司）提供了瞬时或稳定的表达、胞楽表达或分泌，以及FLAG、3xFLAG、c-myc或MATN不同组合物中的N-端或C-端标记。这些融合蛋白可用于检测、纯化及分析重组蛋白。双标融合为检测提供了灵活性。[0302]强劲的人巨细胞病毒CMV启动子调控区使得COS细胞中的组成蛋白表达水平高达lmgL。对于较弱的细胞株，蛋白水平一般低于O.lmgLSV^复制原点的出现将导致DNA在SV40复制容纳性COS细胞中高水平复制。例如，CMV载体可包含细菌细胞中的pMBlpBR322的衍生物复制原点、细菌中进行氨苄青霉素抗性选育的钙-内酰胺酶基因、hGHpolyA和Π的原点。含前胰岛素原引导PPT序列的载体可使用抗FLAG抗体、树脂和板引导FLAG融合蛋白分泌到进行纯化的培养基中。其他与各种宿主细胞一起应用的载体和表达系统是本领域熟知众所周知的。[0303]在另一项实施方案中，对本说明书的两个或更多的肽或肽变体进行编码，因此，以一个连续顺序类似于“一串珠子”的构建体表达。在达到目标，所述肽或肽变体可能通过连接符氨基酸的延伸处例如LLLLLL连接或融合一起，也可能他们之间没有任何附加的肽而被连接。这些构建体也可用于癌症治疗，可诱导涉及MHCI和MHCII类分子的免疫应答。[0304]本说明书还涉及一种宿主细胞，其以本说明书的多核苷酸载体构建转化而来。宿主细胞可为原核细胞，也可为真核细胞。在有些情况下，细菌细胞为优选原核宿主细胞，典型为大肠杆菌株，例如，大肠杆菌菌株DH5从BethesdaResearchLaboratories公司Bethesda，马里兰州，美国）获得和RRl从美国菌种保藏中心ATCC，RockviIIe，马里兰州，美国），ATCC编号31343获得）。优选的真核宿主细胞包括酵母、昆虫和哺乳动物细胞，优选为脊椎动物细胞，如:小鼠、大鼠、猴子或人成纤维细胞和结肠癌细胞株中的细胞。酵母宿主细胞包括YPH499、YPH500和YPH501，一般可从StratageneCloningSystems公司（LaJolla，加州92037,美国）获得。优选哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢CHO细胞为ATCC中的CCL61细胞、NIH瑞士小鼠胚胎细胞NIH3T3为ATCC中的CRL1658细胞、猴肾源性C0S-1细胞为ATCC中的CRL1650细胞以及人胚胎肾细胞的293号细胞。优选昆虫细胞为Sf9细胞，可用杆状病毒表达载体转染。有关针对表达选择合适宿主细胞的概要，可从教科书PaulinaBaibasandArgeliaLorence〈〈MethodsinMolecularBiologyRecombinantGeneExpression,ReviewsandProtocols》PartOne,SecondEdition，ISBN978-1-58829-262-9和本领域技术人员知道的其他文献中查到。[0305]含本说明书DNA结构的适当宿主细胞的转化可使用大家熟知的方法完成，通常取决于使用载体的类型。关于原核宿主细胞的转化，请参见，例如，Cohen等人的文献Cohenetal·，1972和（GreenandSambrook，2012。酵母细胞的转化在Sherman等人的文章Shermanetal·，1986中进行了描述。BeggsBeggs，1978中所述的方法也很有用。对于脊椎动物细胞，转染这些细胞的试剂等，例如，磷酸钙和DEAE-葡聚糖或脂质体配方，可从StratageneCloningSystems公司或LifeTechnologies公司（Gaithersburg，马里兰州20877,美国）获得。电穿孔也可用于转化和或转染细胞，是本领域用于转化酵母细胞、细菌细胞、昆虫细胞和脊椎动物细胞大家熟知的方法。[0306]被成功转化的细胞（即含本说明书DNA结构的细胞可用大家熟知的方法如PCR进行识别。另外，上清液存在的蛋白可使用抗体进行检测。[0307]应了解，本说明书中的某些宿主细胞用于制备本说明书中的肽，例如细菌细胞、酵母细胞和昆虫细胞。但是，其他宿主细胞可能对某些治疗方法有用。例如，抗原提呈细胞如树突状细胞可用于表达本说明书中的肽，使他们可以加加载相应的MHC分子中。因此，本说明书提出了含本说明书中核酸或表达载体的一种宿主细胞。[0308]在一项优选实施方案中，宿主细胞为抗原提呈细胞，尤其是树突状细胞或抗原提呈细胞。2010年4月29日，美国食品和药物管理局FDA批准载有含前列腺酸性磷酸酶PAP的重组融合蛋白可用于治疗无症状或症状轻微的转移性HRPCRinietal.，2006;Smalletal·，2006〇[0309]另一方面，本说明书提出了一种配制一种肽及其变体的方法，该方法包括培养宿主细胞和从宿主细胞或其培养基中分离肽。[0310]在另一项实施方案中，本说明书中的TCR、核酸或表达载体用于药物中。例如，肽或其变体可制备为静脉i.v.注射剂、皮下（s.c.注射剂、皮内（i.d.注射剂、腹膜内（i.p.注射剂、肌肉（i.m.注射剂。肽注射的优选方法包括s.c.、i.d.、i.p.、i.m.和i.v.注射。DNA注射的优选方法为丨.1.、;[.111.、8.0.、;[.卩.和;[.¥.注射。例如，给予5^〖至1.511^，优选为1254g至500yg的肽或DNA，这取决于具体的肽或DNA。上述剂量范围在以前的试验中成功使用Walteretal·，2012。[0311]用于主动免疫接种的多聚核苷酸可为基本纯化形式，也可包被于载体或输送系统。核酸可能为DNA、cDNA、PNA、RNA，也可能为其组合物。这种核酸的设计和引入方法为本领域所熟知。例如，Teufel等人的文献中有其概述Teufeletal.，2005。多核苷酸疫苗很容易制备，但这些载体诱导免疫反应的作用模式尚未完全了解。合适的载体和输送系统包括病毒DNA和或RNA，如基于腺病毒、牛痘病毒、逆转录病毒、疱瘆病毒、腺相关病毒或含一种以上病毒元素的混合病毒的系统。非病毒输送系统包括阳离子脂质体和阳离子聚合物，是DNA输送所属领域内熟知的系统。也可使用物理输送系统，如通过“基因枪”。肽或核酸编码的肽可以是一种融合蛋白，例如，含刺激T细胞进行上述CDR的表位。[0312]本说明书还涉及适体。适体例如，参见WO2014191359及其中引用的文献，其内容通过引用整体并入本文是短的单链核酸分子，其可以折迭为所定义的三维结构并识别特定的靶标结构。它们似乎是开发靶向治疗的合适替代方法。适体已显示可选择性与具有高亲和力和特异性的复合体靶标相结合。[0313]识别细胞表面分子的适体在过去十年内已经确定，并为开发诊断和治疗方法提供了手段。由于适体已显示几乎无毒性和免疫原性，因此，它们是生物医学应用中有前景的候选物质。事实上适体，例如前列腺特异性膜抗原识别适体，已被成功地用于靶向治疗并在体内模型的异种移植物中显示出功能。此外，认识到特定肿瘤细胞系的适体也已确定。[0314]可选择DNA适体来揭示各种癌细胞的广谱标识属性，特别是那些来自于实体瘤的细胞，而非致瘤和主要健康细胞不被识别。如果所识别的适体不仅识别肿瘤特异性子类型，而且与一系列肿瘤相互作用，这使适体适用于作为所谓的广谱诊断和治疗手段。[0315]此外，用流式细胞仪对细胞结合行为的研究显示，适体在纳摩尔范围内显示出很好的亲和力。[0316]适体用于诊断和治疗目的。一方面，至少一种或多种适体被肿瘤细胞吸取，因而可作为抗癌剂祀向递送的分子赋形剂，例如siRNA进入肿瘤细胞。[0317]可针对复合体靶标选择适体，复合体靶标如细胞和组织以及包含、优选包括根据任何SEQIDNO25至SEQIDNO26的序列、根据本说明书的肽复合体或TCR与MHC分子，使用细胞SELEX通过指数富集的配体系统进化技术。[0318]在一项实施方案中，该说明书提供了如本文中所描述的产生TCR的方法，该方法包括在适于促进TCR表达的条件下培养能够表达TCR的宿主细胞。[0319]本说明书还涉及一种识别和分离本发明TCR的一种方法，所述方法包括：用A2MAG-003单体从HLA-A*02阴性健康供体孵育PBMC，用四聚体-藻红蛋白（PE孵育PBMC并通过荧光启动细胞分选FACS方法-Calibur分析分离高亲和力T细胞。[0320]本说明书还涉及一种识别和分离本发明TCR的一种方法，所述方法包括：用A2P286-1Y2L单体从HLA-A*02阴性健康供体孵育PBMC，用四聚体-藻红蛋白（PE孵育PBMC并通过荧光启动细胞分选FACS方法-Calibur分析分离高亲和力T细胞。[0321]本说明书还涉及一种识别和分离本发明TCR的一种方法，所述方法包括：用A2P286-1Y2L9L单体从HLA-A*02阴性健康供体孵育PBMC，用四聚体-藻红蛋白（PE孵育PBMC并通过荧光启动细胞分选FACS方法-Calibur分析分离高亲和力T细胞。[0322]本说明书还涉及一种识别和分离本发明TCR的一种方法，所述方法包括:获得含整个人体TCRaP基因位点（I.1和0.7Mb的转基因小鼠（其T细胞表达多样化人类TCR，用于补偿小鼠TCR缺乏），用MAG-003对小鼠进行免疫处理，用四聚体-藻红蛋白（PE孵育从转基因小鼠中获得的PBMC，并通过荧光启动细胞分选FACS方法-Calibur分析分离高亲和力T细胞。[0323]本说明书还涉及一种识别和分离本发明TCR的一种方法，所述方法包括:获得含整个人体TCRaP基因位点（I.1和0.7Mb的转基因小鼠（其T细胞表达多样化人类TCR，用于补偿小鼠TCR缺乏），用P286-1Y2L对小鼠进行免疫处理，用四聚体-藻红蛋白（PE孵育从转基因小鼠中获得的PBMC，并通过荧光启动细胞分选FACS方法-Calibur分析分离高亲和力T细胞。[0324]本说明书还涉及一种识别和分离本发明TCR的一种方法，所述方法包括:获得含整个人体TCRaP基因位点（I.1和0.7Mb的转基因小鼠（其T细胞表达多样化人类TCR，用于补偿小鼠TCR缺乏），用P286-1Y2L9L对小鼠进行免疫处理，用四聚体-藻红蛋白（PE孵育从转基因小鼠中获得的PBMC，并通过荧光启动细胞分选FACS方法-Calibur分析分离高亲和力T细胞。[0325]本说明书还涉及根据说明书的方法，其中所述T细胞包含能够表达本发明TCR的表达载体。[0326]本发明还涉及一种在靶细胞异常表达MAG-003的患者中杀伤靶细胞的方法，所述方法包括向患者施用有效量的根据本说明书的TCR、可溶性TCR和或T细胞。[0327]本说明书进一步涉及本文任何所述的TCR、本说明书的核酸、本说明书的表达载体、本说明书的细胞、本说明书中激活的细胞毒性T淋巴细胞作为药剂或在制造药剂的中的用途。本说明书进一步涉及一种根据本说明书的用途，其中药剂可有效抗癌。[0328]本说明书进一步涉及本说明书中的用途，其中所述癌细胞为小细胞肺癌或其他实体或血液肿瘤细胞，如非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肾细胞癌、脑癌、胃癌、结直肠癌、肝细胞癌、胰腺癌、前列腺癌、白血病、乳腺癌、梅克尔细胞癌、黑色素瘤、卵巢癌、膀胱癌、子宫癌、胆囊和胆管癌和食管癌。[0329]本说明书进一步涉及一种杀死癌细胞的方法，其包括使癌细胞与本说明书所述的宿主细胞接触。在一实施方案中，宿主细胞表达本说明书的TCR。在一项实施方案中，宿主细胞为T细胞或T细胞祖细胞。在一项优选实施方案中，癌细胞选自小细胞肺癌或其他实体或血液肿瘤细胞，如非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肾细胞癌、脑癌、胃癌、结直肠癌、肝细胞癌、胰腺癌、前列腺癌、白血病、乳腺癌、梅克尔细胞癌、黑色素瘤、卵巢癌、膀胱癌、子宫癌、胆囊和胆管癌和食管癌。在一些实施方案中，TCR与治疗活性剂结合。在某些实施方案中，治疗活性剂选自放射性核素、化学治疗剂和毒素。[0330]本发明还涉及一种治疗癌症的方法，包括向有需要的受试者施用本发明的宿主细胞。在一实施方案中，宿主细胞表达本说明书的TCR。在一项实施方案中，宿主细胞为T细胞或T细胞祖细胞。在一实施方案中，宿主细胞是待治疗受试者的自体细胞。在另一项实施方案中，宿主细胞是待治疗受试者的同种异体细胞。在一项优选实施方案中，癌细胞选自小细胞肺癌或其他实体或血液肿瘤细胞，如非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肾细胞癌、脑癌、胃癌、结直肠癌、肝细胞癌、胰腺癌、前列腺癌、白血病、乳腺癌、梅克尔细胞癌、黑色素瘤、卵巢癌、膀胱癌、子宫癌、胆囊和胆管癌和食管癌。[0331]在一些实施方案中，TCR与治疗活性剂结合。本文所用的术语“治疗活性剂”指用于治疗或预防疾病或不良医疗状况的化合物。在一项实施方案中，治疗活性剂用于治疗或预防癌症。在某些实施方案中，治疗活性剂选自放射性核素、化学治疗剂和毒素。[0332]本说明书中的TCR、核酸和宿主细胞及其药物组合物可以通过本领域已知的途径施用于有需要的受试者，并且可以根据待治疗癌症的类型而变化。给药途径包括例如，局部给药例如肿瘤内）和肠胃外给药如皮下、腹膜内、肌内、静脉内、门静脉内和肝内）。在一项优选实施方案中，本说明书的TCR、核酸或宿主细胞或其药用组合物通过局部输注例如使用输注栗和或导管系统施用于受试者的治疗部位，如实体肿瘤。在一项实施方案中，将本说明书的组合物输注入实体肿瘤，供应实体肿瘤的血管和或实体肿瘤周围区域。[0333]在优选实施方案中，使用至少两次给药、每次相隔至少24小时的给药方案将本说明书的组合物施用于受试者。适用于本说明书组合物的给药方案包括例如每天一次、每两天一次和每三天一次。更优选的给药方案包括每周一次、每周两次、隔周一次、每月一次、每月两次。在特定的实施方案中，使用剂量递增方案，其中在数天、数周或数月内向受试者施用一系列的递增剂量。[0334]表达本发明TCR的宿主细胞的有效剂量包括例如，每剂至少约104、至少约105、至少约106、至少约107、至少约108、至少约IO9和至少101个宿主细胞。在一项实施方案中，本说明书的宿主细胞以每剂量约IO4至约IO1t3个细胞的剂量施用，优选为以每剂量约IO5至约IO9个细胞的剂量施用。在优选实施方案中，在至少两次或更多次给药周期的疗程中以给药方案施用剂量。[0335]本发明还涉及一种治疗癌症的方法，其包括与至少一种化学治疗剂和或放射治疗组合施用本说明书的TCR、核酸或宿主细胞。[0336]还提出了一种在有需要的受试者中治疗癌症的方法，包括：[0337]a从所述受试者中分离细胞；[0338]b用编码本说明书TCR的至少一个载体转化细胞以产生转化的细胞；[0339]c扩增转化细胞以产生多个转化细胞;和[0340]d将所述多个转化细胞施用于所述受试者。[0341]还提出了一种在有需要的受试者中治疗癌症的方法，包括：[0342]a从健康供体中分离细胞；[0343]b用编码本说明书TCR的一个载体转化细胞以产生转化的细胞；[0344]c扩增转化细胞以产生多个转化细胞;和[0345]d将所述多个转化细胞施用于所述受试者。[0346]还提出了一种检测生物样本中癌症的方法，包括：[0347]a使生物样本与本说明书的TCR接触；[0348]b检测TCR与生物样本的结合情况。[0349]在一些实施方案中，检测癌症的方法在体外、体内或原位进行。[0350]本说明书进一步涉及一种基于本说明书肽的特定标志物蛋白和生物标志物，在此成称为“靶标”，其可用于诊断和或判断非小细胞肺癌的预后。本说明书还涉及这些新靶点在癌症治疗中的用途。[0351]本说明书的另一方面提出了制备识别特异性肽-MHC复合体的可溶性T细胞受体sTCR的一种方法。这种可溶性T细胞受体可从特异性T细胞克隆中产生，并且它们的亲和力可以通过互补决定区靶向诱变而增加。为了T细胞受体选择之目的，可以使用噬菌体展示美国20100113300,（Liddyetal.，2012。为了在噬菌体展示期间以及实际使用为药物时稳定T细胞受体之目的，可通过非天然二硫键、其他共价键单链T细胞受体或通过二聚化结构域连接^^叩链Boulteretal.，2003;Cardetal.，2004;Willcoxetal.，1999〇T细胞受体可以连接到毒素、药物、细胞因子参见US20130115191、招募效应细胞的结构域，如抗⑶3结构域等，以便对靶细胞执行特定的功能。另一方面，它表达于用于过继转移的T细胞中。参见例如TO2004033685Al、TO2004074322A1和TO2013057586A1，其内容通过引用整体并入。[0352]此外，可用本说明书的肽和或TCR或抗体或其他结合分子在活检样本的基础上验证病理师对癌症的诊断。[0353]该抗体或TCR也可用于体内诊断实验。一般来说，抗体或TCR用放射性核素标记如:111111、991'3、14：、1311、3!1、32?或355，从而可免疫闪烁扫描法使肿瘤局限化。在一实施方案中，其中的抗体或片段与两个或两个以上选自包括上述蛋白的组的蛋白质靶目标细胞外域结合，并且亲和力值Kd低于ΙχΙΟμΜ。[0354]诊断用抗体或TCR可通过各种影像学方法使用适合检测的探针进行标记。探针检测方法包括但不限于，荧光、光、共聚焦和电镜方法;磁共振成像和光谱学技术;透视、计算机断层扫描和正电子发射断层扫描。合适的探针包括但不限于，荧光素、罗丹明、曙红及其它荧光团、放射性同位素、黄金、钆和其他稀土、顺磁铁、氟-18和其他正电子发射放射性核素。此外，探针可能是双功能或多功能的，并且用一种以上的上述方法可进行检测。这些抗体和或TCR可用所述的探针直接或间接进行标记。抗体和或TCR探针的连接，包括探针的共价连接、将探针融合入抗体或TCR、以及螯合化合物的共价连接从而结合探针、以及其他本行业熟知的方法。对于免疫组织化学方法，疾病组织样本可能是新鲜或冷冻或可能包埋于石蜡中以及用福尔马林等防腐剂固定。固定或包埋的切片包括与标记一抗和二抗接触的样本，其中该抗体用于检测原位蛋白的表达。[0355]本发明还涉及以下项目：[0356]第1项、一种包含α链和β链的TCR，其中所述α链包含与SEQIDN0:39、SEQIDNO:55和SEQIDNO:71中任一项所述的氨基酸序列至少90%相同的TCRa可变结构域;β链包含与SEQIDN0:47、SEQIDΝ0:63和SEQIDΝ0:79中任一项至少90%相同的TCRP可变结构域，其中TCR与MAG-003肽-MHC分子复合体特异性结合。[0357]第2项、第1项所述的TCR，进一步包含一个TCRa恒定结构域和一个TCRf3恒定结构域，其中所述TCRa恒定结构域与SEQIDN0:39、SEQIDN0:55和SEQIDN0:71中任一项所述的TCRa恒定结构域至少70%相同；TCRP恒定结构域与SEQIDN0:47、SEQIDN0:63和SEQIDNO:79中任一项所述的TCRP恒定结构域至少70%相同。[0358]第3项、第1或第2任一项中所述的TCR，其中所述α恒定结构域包含α跨膜结构域VIGFRILLLKVAGFNLLMTLSEQIDΝ0:97，β恒定结构域包含β跨膜结构域TILYEILLGKATLYAVLVSALVLSEQIDΝ0:88。[0359]第4项、第1至第3任一项中所述的TCR，其中所述TCRa可变结构域由SEQIDΝ0:39的氨基酸序列组成;TCRP可变结构域由SEQIDΝ0:47的氨基酸序列组成。[0360]第5项、第1至第3任一项中所述的TCR，其中所述TCRa可变结构域由SEQIDΝ0:55的氨基酸序列组成;TCRP可变结构域由SEQIDΝ0:63的氨基酸序列组成。[0361]第6项、第1至第3任一项中所述的TCR，其中所述TCRa可变结构域由SEQIDΝ0:71的氨基酸序列组成;TCRP可变结构域由SEQIDΝ0:79的氨基酸序列组成。[0362]第7项、第1至第6任一项中所述的TCR，其中所述TCRa恒定结构域由SEQIDΝ0:39的TCRa恒定结构域组成，TCRf3恒定结构域由SEQIDNO:47的TCRf3恒定结构域组成。[0363]第8项、第1至第6任一项中所述的TCR，其中所述TCRa恒定结构域由SEQIDN0:55的TCRa恒定结构域组成，TCRf3恒定结构域由SEQIDNO:63的TCRf3恒定结构域组成。[0364]第9项、第1至第6任一项中所述的TCR，其中所述TCRa恒定结构域由SEQIDN0:71的TCRa恒定结构域组成，TCRf3恒定结构域由SEQIDNO:79的TCRf3恒定结构域组成。[0365]第10项、第1至第9任一项中所述的TCR，其包含由SEQIDNO:39组成的α链和由SEQIDNO:47组成的β链。[0366]第11项、第1至第9任一项中所述的TCR，其包含由SEQIDNO:55组成的α链和由SEQIDNO:63组成的β链。[0367]第12项、第1至第9任一项中所述的TCR，其包含由SEQIDNO:71组成的α链和由SEQIDNO:79组成的β链。[0368]第13项、第1至第12任一项中所述的TCR，其中所述TCRa链包含至少一个选自SEQIDN0:39、SEQIDN0:55和SEQIDN0:71的a链CDR1、CDR2和CDR3的a链互补决定区（CDR;和或所述TCRP链包含至少一个选自SEQIDNO:47、SEQIDNO:63和SEQIDNO:79的β链⑶R1、⑶R2和⑶R3中的β链互补决定区（CDR。[0369]第14项、第1至第13任一项中所述的TCR，其中所述TCRa链包含SEQIDNO:39、SEQIDNO:55或SEQIDNO:71的全部三个CDR。[0370]第15项、第1至第13任一项中所述的TCR，其中所述TCRP链包含SEQIDN0:47、SEQIDNO:63或SEQIDNO:79的全部三个CDR。[0371]第16项、第1至第15任一项中所述的TCR，其中所述a链和β链融合形成单链TCR。[0372]第17项、第1至第16任一项中所述的TCR，其中所述a链和或β链包含可检测标记。[0373]第18项、第17项中所述的TCR，其中可检测标记选自放射性核素、荧光团和生物素。[0374]第19项、第1至第18任一项中所述的TCR，其中所述a链和或β链与治疗活性剂结合。[0375]第20项、第17项中所述的TCR，其中治疗活性剂选自放射性核素、化学治疗剂和毒素。[0376]第21项、一种包含γ链和δ链的TCR，其中所述γ链包含至少一个选自SEQIDNO:39、SEQIDN0:55和SEQIDN0:71的a链CDR1、CDR2和CDR3中的互补决定区（CDR;和或所述TCRS链包含至少一个选自SEQIDN0:47、SEQIDN0:63和SEQIDN0:79的β链CDRUCDR2和⑶R3中的互补决定区CDR，并且其中所述TCR与MAG-003肽-MHC分子复合体特异性结合。[0377]第22项、第1至第21任一项中所述的TCR，其中所述TCR特异性结合MAG-003肽-MHC分子复合体，其中所述MAG-003肽选自SEQIDNO:1-24,且MHC分子是HLAI类或HLAII类分子。[0378]第23项、一种核酸，其编码第1至20任一项中TCR的a链和或β链或第21项中TCR的γ链和或s链。[0379]第24项、一种表达载体，其包含与至少一个启动子序列可操作地连接的第23项中的核酸。[0380]第25项、用第24项中的表达载体转化的一种宿主细胞。[0381]第26项、第25项中的宿主细胞，其为T细胞或T细胞祖细胞。[0382]第27项、第26项中的宿主细胞，其中T细胞或T细胞祖细胞获得自癌症患者。[0383]第28项、第26项中的宿主细胞，其中T细胞或T细胞祖细胞获得自健康供体。[0384]第29项、一种药物组合物，其包含第1至22中任一项所述的TCR;第23项中的核酸、第24项中的表达载体和或第25至28中任一项所述的宿主细胞；以及药学上可接受的载体，以及任选地药用赋形剂和或稳定剂。[0385]第30项、一种当由MHC分子提呈时特异性结合于SEQIDNO:1的肽的TCR的制备方法，所述方法包括在适于促进TCR表达的条件下培养第25至28中任一项所述的宿主细胞。[0386]第31项、一种治疗癌症的方法，包括向有需要的受试者施用第1至22任一项中的TCR、第23项中的核酸、第24项中的表达载体、第25至28任一项中的宿主细胞和或第29项中的药物组合物。[0387]第32项、第31项中的方法，其中所述TCR在宿主细胞的表面上表达。[0388]第33项、第31项中的方法，其中所述宿主细胞选自T细胞或T细胞祖细胞。[0389]第34项、第33项中的方法，其中T细胞或T细胞祖细胞是自体细胞。[0390]第35项、第33项中的方法，其中T细胞或T细胞祖细胞是同种异体细胞。[0391]第36项、第31项中的方法，其中TCR与治疗活性剂结合。[0392]第37项、第36项中的方法，其中治疗活性剂选自放射性核素、化学治疗剂和毒素。[0393]第38项、第1至22任一项中所述的方法，其中所述癌症为非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肾细胞癌、脑癌、胃癌、结直肠癌、肝细胞癌、胰腺癌、前列腺癌、白血病、乳腺癌、梅克尔细胞癌、黑色素瘤、卵巢癌、膀胱癌、子宫癌、胆囊癌、胆管癌和食管癌，或其组合。[0394]第39项、第31至38任一项中所述的方法，进一步包括对所述受试者施用至少一种化学治疗剂。[0395]第40项、第31至39任一项中所述的方法，进一步包括对所述受试者施用放射治疗。[0396]第41项、一种在有需要的受试者中治疗癌症的方法，包括：[0397]a从所述受试者中分离细胞；[0398]b用编码第1至22任一项中所述的TCR的一个载体转化细胞以产生转化细胞；[0399]c扩增转化细胞以产生多个转化细胞;和[0400]d将所述多个转化细胞施用于所述受试者。[0401]第42项、第41项中的方法，其中所述细胞选自T细胞或T细胞祖细胞。[0402]第43项、一种在有需要的受试者中治疗癌症的方法，包括：[0403]a从健康供体中分离细胞；[0404]b用编码第1至22任一项中所述的TCR的一个载体转化细胞以产生转化细胞；[0405]c扩增转化细胞以产生多个转化细胞;和[0406]d将所述多个转化细胞施用于所述受试者。[0407]第44项、第43项中的方法，其中所述细胞选自T细胞或T细胞祖细胞。[0408]第45项、一种检测生物样本中癌症的方法，包括：[0409]a使生物样本与第1至22任一项中所述的TCR接触，和[0410]b检测TCR与生物样本的结合情况。[0411]第46项、第45项中的方法，其中TCR包含可检测标记。[0412]第47项、第46项中所述的方法，其中可检测标记选自放射性核素、荧光团和生物素。[0413]第48项、第45至47任一项中所述的方法，其中所述检测在体外、体内或原位进行。[0414]第49项、第45至48任一项中所述的方法，其中所述癌症为非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肾细胞癌、脑癌、胃癌、结直肠癌、肝细胞癌、胰腺癌、前列腺癌、白血病、乳腺癌、梅克尔细胞癌、黑色素瘤、卵巢癌、膀胱癌、子宫癌、胆囊癌、胆管癌和食管癌，或其组合。[0415]第50项、第25至28任一项中所述的宿主细胞，其中所述T细胞为γδΤ细胞。[0416]第51项、一种在靶细胞异常表达MAG-003的患者中杀伤靶细胞的方法，所述方法包含患者施用有效量的表达第1至22任一项中的TCR的T细胞、第23项中的核酸、第24项中的表达载体、第25至28任一项中的宿主细胞和或第29项中的药物组合物。[0417]第52项、第1至22任一项中的TCR，其为可溶性TCR。[0418]第53项、第1至22任一项中的TCR，其中所述α链包含与SEQIDN0:39、SEQIDNO:55和SEQIDNO:71中任一项所述的氨基酸序列至少95%相同的TCRa可变结构域;β链包含与SEQIDN0:47、SEQIDΝ0:63和SEQIDΝ0:79中任一项至少95%相同的TCRP可变结构域，其中TCR与MAG-003肽-MHC分子复合体特异性结合。[0419]第54项、第1至22任一项中的TCR，其相对于SEQIDN0:39、SEQIDN0:55或SEQIDN0:71在a链中有至少一个突变和或相对于SEQIDN0:47、SEQIDN0:63和SEQIDN0:79在β链中有至少一个突变，并且其中TCR对MAG-003肽HLA分子复合体的结合亲和力和或结合半衰期是未突变TCR对相同肽的结合亲和力和或结合半衰期的至少两倍。[0420]第55项、第1至22任一项中的TCR，其相对于SEQIDN0:39、SEQIDN0:55或SEQIDN0:71在a链中有至少一个突变和或相对于SEQIDN0:47、SEQIDN0:63和SEQIDN0:79在β链中有至少一个突变，并且其中与未突变的TCR相比，TCR已经修饰了糖基化。[0421]第56项、第31至44或51中任一项所述的方法，其中施用第1至22任一项中的TCR、第23项中的核酸、第24项中的表达载体、第25至28任一项中的宿主细胞或第29项中的药物组合物，施用两次，间隔至少24小时。[0422]第57项、第56项所述的方法，其中在数天、数周或数月的期限内向受试者施用第1至22任一项中的TCR、第23项中的核酸、第24项中的表达载体、第25至28任一项中的宿主细胞或第29项中的药物组合物。[0423]第58项、第56或57项所述的方法，其中通过局部输注施用第1至22任一项中的TCR、第23项中的核酸、第24项中的表达载体、第25至28任一项中的宿主细胞或第29项中的药物组合物。[0424]第59项、第58项中的方法，其中局部输注由输注栗和或导管系统施用。[0425]第60项、第58或59项所述的方法，其中所述局部输注为注入实体肿瘤、供应实体肿瘤的血管和或实体肿瘤周围区域。[0426]第61项、第31至44、51或56至60中任一项所述的方法，其中施用第1至22任一项中的TCR、第23项中的核酸、第24项中的表达载体、第25至28任一项中的宿主细胞或第29项中的药物组合物，施用一剂量，每剂量约IO4至约1〇1个细胞。[0427]第62项、一种TCR，包含至少一个a链互补决定区（CDR，其选自SEQIDN0:39、SEQIDN0:55和SEQIDN0:71的a链⑶R1、⑶R2和⑶R3;和或至少一个β链互补决定区（CDR，其选自SEQIDNO:47、SEQIDNO:63和SEQIDNO:79的β链CDRl、CDR2和CDR3,并且其中所述TCR与MAG-003肽-MHC分子复合体特异性结合。[0428]实施例[0429]当与来自自体情况（即患者）的T细胞相比时，异体反应性环境可用于规避自身耐受性并产生具有更高亲合力的T细胞。这种情况的实例包括体外产生异体HLA反应性肽特异性T细胞（Sadovnikovaetal.1998;Savageetal.2004;Wildeetal.2012以及用人-MHC或人TCR对转基因小鼠进行免疫（Stanislawskietal.2001;Lietal.2010。[0430]实施例1:体外产生异体HLA反应性肽特异性T细胞Sadovnikovaetal.2004[0431]获得知情同意后，使用来自HLA-A*02阳性和HLA-A*02阴性健康供体的PBMC。从MBLI中获得含有MAG-003的重组生物素化HLA-A2I类单体和A2荧光四聚体。将PBMC使用磷酸盐缓冲盐水PBS稀释的抗⑶20SA室温下孵育1小时，洗涤，并使用生物素化的A2MAG-003单体室温下温育30分钟，洗涤并在具有10%人AB血清的RPMI中用24孔板以3XIO6个细胞孔进行铺板。第1天以10ngmL加入白细胞介素7IL-7;RDSystems，Minneapolis，MN，第4天以10UmL加入IL-2Chiron，Harefield，UnitedKingdom。在5周的期间，每周用新鲜的I3BMC对细胞进行再刺激，用1:1的比例与应答细胞混合，并在24孔板中以3XIO6孔进行铺板。[0432]为了获得高亲合力T细胞，将大约IO6个含有HLA-A2MAG-003四聚体-藻红蛋白PE获得自MBLI的PBMC37°C下孵育30分钟，随后用抗⑶8-异硫氰酸荧光素FITC别藻蓝蛋白（APC在4°C下孵育20分钟，然后进行荧光启动细胞分选FACS-Calibur分析。用FACS-VantageBectonDickinson，Cowley，Oxford，UnitedKingdom进行分选。分选的四聚体阳性细胞在24孔板中扩增，方法为每孔2xl05个分选细胞、2xl06个经照射的A2阴性PBMC作为进料、2xl04CD3CD28珠mLDynal，0sloNorway和IL-2lOOOUmL。然后使用如此获得的高亲合力T细胞，采用本领域已知的技术鉴定和分离TCR，例如单细胞5RACEfcDNA末端快速扩增）。然后使用本领域众所周知的方法分析非冗余TCRDNA进行氨基酸DNA序列测定并克隆到表达载体中。[0433]实施例2:用人-MHC或人TCR的转基因小鼠进行免疫[0434]MAG-003用于用完全的人TCRaP基因座（1.1和0.7Mb对转基因小鼠进行免疫，其T细胞表达补偿小鼠TCR缺陷的多种人TCR谱。（Lietal.2010。为了获得高亲合力T细胞，从转基因小鼠获得的PBMC与四聚体-藻红蛋白（PE—起孵育，然后按上所述进行细胞分选。然后使用如此获得的高亲合力T细胞鉴定和分离TCR进行氨基酸DNA序列测定，并使用本领域描述的方法将其克隆到表达载体中。[0435]一方面，MAG-003及其变体，S卩P286-1Y2L具有2个氨基酸取代，SEQIDNO:13和P286-1Y2L9L具有3个氨基酸取代，SEQIDN0:14，表现出强有力的结合亲和力和HLA-A*0201分子稳定性。特别地，P286-1Y2L9L显示可诱导特异性CTL，其一方面裂解来自健康供体PBMC和HLA-A2.1Kb转基因小鼠的靶向癌细胞。参见，例如，（Wuetal.2011，该文中的内容通过引用整体并入本文。[0436]为了获得针对MHCI或IIp286-lY2L或p286-lY2L9L复合体的高亲合力TCR，这些肽可用于实施例1和2中描述的方法。然后使用如此获得的高亲合力T细胞鉴定和分离TCR进行氨基酸DNA序列测定，并使用本领域描述的方法将其克隆到表达载体中。[0437]实施例3:TCR的克隆[0438]克隆TCR的方法是本领域已知的，例如，如美国专利8，519，100中所述，其全部内容通过引用并入本文用于所述方法。编码限制性位点NdeI用于在细菌中有效启动表达的被引入的甲硫氨酸）的α链可变区序列特异性寡核苷酸A1ggaattccatatgagtcaacaaggagaagaagatccSEQIDΝ0:26，和编码限制性位点Sail的α链恒定区序列特异性寡核苷酸A2ttgtcagtcgacttagagtctctcagctggtacacgSEQIDΝ0:27被用于扩增α链可变区。在β链的情况下，编码限制性位点NdeI用于在细菌中有效启动表达的被引入的甲硫氨酸）的β链可变区序列特异性寡核苷酸B1tctctcatatggatggtggaattactcaatccccaaSEQIDNO:28和编码限制性位点恒定区序列特异性寡核苷酸B2tagaaaccggtggccaggcacaccagtgtggcSEQIDN0:29被用于扩增β链可变区。[0439]将用NdeI和Sail切割的编码TCRa链的DNA序列连接到用NdeI和XhoI切割的pGMT7+Ca载体中。将用NdeI和AgeI切割的编码TCRP链的DNA序列连接到用NdeI和AgeI切割的单独PGMT7+C0载体中。将结合的质粒转化为感受态大肠杆菌菌株XLl-blue细胞中，并在含有100wgml氨苄青霉素的LB琼脂板上铺板。在37°C孵育过夜后，挑取单个菌落，并在含有IOOygml氨节青霉素的IOmlLB中摇荡培养过夜。使用Miniprep试剂盒Qiagen纯化克隆的质粒，并使用自动DNA测序仪LarkTechnologies对插入片段进行测序。[0440]从健康供体的T细胞中分离和扩增三种1'0?1?20?1!17、1?7?105和1?10?2612，参见表2，每种编码肿瘤特异性TCR-α和TCR-β链。根据Walter等人描述的方法体外刺激来自健康供体的细胞。靶标特异性细胞使用靶标特异性多复位位子进行单细胞分选，以进行随后的TCR分离。例如根据Green和Sambrook所著的分子克隆实验室手册第四版所述的标准方法通过5RACE分离TCR序列。所有的三种TCR均来源于HLA-A2阳性供体。对TCRR20P1H7、R7P1D5和R10P2G12的α和β可变区进行测序。[0441]发现R20PlH7TCRa可变结构域具有与SEQIDNO:39的残基22-133相对应的氨基酸序列。发现R20PlH7TCRi3可变结构域具有与SEQIDNO:47的残基20-135相对应的氨基酸序列。[0442]R7P1D5TCRa可变结构域具有与SEQIDNO:55的残基22-131相对应的氨基酸序列。R7P1D5TCRf3可变结构域具有与SEQIDNO:63的残基20-131相对应的氨基酸序列。[0443]R10P2G12TCRa可变结构域具有与SEQIDNO:71的残基21-136相对应的氨基酸序列。R10P2G12TCRβ可变结构域具有与SEQIDN0:79的残基20-134相对应的氨基酸序列。[0444]噬菌体展示技术可用于产生TCR变体库，以识别高亲和力突变。（Lietal，（2005NatureBiotech233:349-354—文中描述的TCR噬菌体展示技术和筛选方法可应用于选自表2所述TCR的参考TCR。[0445]例如，SEQIDN0:39、55和71的α链序列的所有三个CDR区以及SEQIDN0:47、55和79的β链序列的所有三个CDR区可以通过诱变进行靶向作用，并且每个CDR库单独进行筛选。[0446]因此，鉴定亲和力和或结合半衰期至少是参考TCR两倍的TCR暗示至少是天然TCR的两倍）。[0447]使用包括在恒定区中引入半胱氨酸的方法重新折迭TCR异二聚体，以提供人造链间二硫键。使用这种方式制备了TCR，其由以下组成：（a参考TCRP链以及突变的α链；⑹参考TCRa链以及突变的β链;和CP和α链的各种组合，包括突变可变结构域。[0448]可以使用BIAcore方法分析高亲和力可溶性二硫键连接的TCR和TCR变体以及天然肽KVLEHVVRVSEQIDN0:1HLA-A*02复合体之间的相互作用。[0449]高亲合力TCR变体也可以通过酵母或T细胞展示技术从CDR突变体库中选择Holleretal.2003;Chervinetal.2008。因此，候选TCR变体为设计TCRCDR突变提供了指导，以获得高亲和力TCR变体Robbinsetal.2008;Zoeteetal.2007。[0450]实施例4:自体T细胞工程技术[0451]T细胞可进行工程化处理以表达高亲合力TCR所谓的TCR疗法或蛋白融合衍生的嵌合抗原受体CAR，增强了对MHCIMAG-003复合体或MHCIIMAG-003复合体的抗原特异性。一方面，该方法克服了与中枢和外周耐受性相关的一些限制，并且生成在靶向作用于肿瘤更有效的T细胞，而不需要患者进行新的T细胞活化。[0452]一方面，为了获得表达本说明书TCR的T细胞，编码肿瘤特异性TCR-α和STCR-Ml的核酸按实施例1-3中所述进行鉴定和分离被克隆入表达载体，诸如γ逆转录病毒或慢病毒。重组病毒产生，然后测试功能，如抗原特异性和功能性亲合力。然后，最终产品的等分试样被用于转导靶T细胞群体一般纯化自患者的PBMC，在输入患者前扩增。[0453]另一方面，为了获得表达本说明书TCR的T细胞，TCRRNA通过本领域中所述的技术例如，体外转录系统合成。然后，体外合成的TCRRNA通过电穿孔来重新表达肿瘤特异性TCR-α和或TCR-β链被引入获得自健康供体的原代⑶8+T细胞。[0454]为了确定TCR的特异性和亲和力，将转化的CD8+T细胞与载有MAG-003的靶细胞或载有同源但不相关的肽RABGAP1L-001SEQIDN0:91、AXIN1-001SEQIDN0:92、AN05-001SEQIDN0:93、TPX2-001SEQIDN0:94、SYNE3-001SEQIDN0:95、MIA3-001SEQIDN0:、HERC4-001SEQIDN0:97、PSME2-001SEQIDN0:98、HEATR5A-001SEQIDN0:99或CN0T1-003SEQIDN0:100或对照肽NYES01-001SEQIDN0:101的靶细胞共孵育，然后进行IFN-γ释放测定。无负载的靶细胞和CD8+T细胞单独作为对照。CD8+T细胞分泌IFN-γ提示具有细胞毒活性的T细胞活化。[0455]表11[0456][0457]如图5-7所示，在与载有MAG-003的靶细胞共培养后，用本次公开数据中TCR转化的所有原代CD8+T细胞释放的IFN-γ水平不相关加载肽靶细胞和对照细胞刺激的水平高得多。靶向肽滴定分析显示EC50范围为约3ηΜ至约IOnM表11。这些结果表明，通过与MHCMAG-003复合体的特异性相互作用，本发明的TCR可启动细胞毒性T细胞活性，例如IFN-γ释放。[0458]使用四聚体染色技术进一步证实T细胞活化，以检测MHCMAG-003结合的活化细胞毒性T细胞。如图8和表11所示，采用阳性荧光标记的MHCMAG-003与采用MHCNYES01-001对照四聚体或模拟对照物相比，更高百分比的TCR表达⑶8+T细胞被染色。作为对照，已知与MHCNYES01-001复合体特异性结合的TCR例如1G4TCR所转化的原代⑶8+T细胞较容易被NYES01-001负载的靶细胞启动。TCR1G4的a和β链分别显示于SEQIDΝ0:89和90中：[0459]lG4a链（SEOIDΝ0:89:[0460][0463]为了确定MAG-003MHC复合体的TCR的结合基序，在MAG-003肽的9个氨基酸的每一个上均进行丙氨酸定位扫描分析。丙氨酸取代的MAG-003肽如表12所示。[0464]表12[0467]用相关RNA编码TCR电穿孔的CD8+T细胞与载有MAG-003、MAG-003-Al至MAG-003-[0465][0466]A9或不相关NYES01-001肽共同孵育，随后进行IFNγ释放测定，如上所述。[0468]丙氨酸定位扫描分析的结果所图9-11所示，并表13中进行总结。[0469]表13[0470][0471]具有相同基序的Α*02结合肽的全基因组筛选显示，针对TCRR20P1H7、R7P1D5和R10P2G12无潜在交叉反应性肽。这些结果表明，本文所述的TCR表现出非常特定的识别模式，降低了非靶向作用的风险。[0472]为了确定本文所述的表达TCR的T细胞的功效，用TCRR7P1D5、R20P1H7和R10P2G12的RNA电穿孔的原代CD8+T细胞与不同的人癌细胞系共同孵育，例如A-375人黑素瘤细胞系，HLA-A2和MAG-003表达呈阳性）、T98G人成胶质细胞瘤细胞系，HLA-A2阳性、MAG-003阴性和SK-BR-3人乳腺癌细胞系，HLA-A2阴性和MAG-003阴性），然后进行IFNγ释放测定。[0473]如图12A-C所示，在HLA-A2呈阳性、MAG-003呈阳性的Α-375细胞中观察到IFN-γ释放，但在T98G和SK-BR-3细胞中并非如此，其具有基础水平的IFN-γ释放，这与效应细胞具有可比性。另外，与人非小细胞癌细胞系Η1755共同孵育时，用TCRR7P1D5转化的CD8+T细胞（而不是对照物）也显示出IFNγ释放增加（数据未列出）。这些结果表明，表达TCRR7P1D5、R20P1H7和R10P2G12的T细胞可以HLA-A2MAG-003特异性的方式特异性地诱导靶向作用于癌细胞的细胞毒活性。[0474]本说明书提出了可用于治疗癌症肿瘤优选为过度提呈或只MAG-003的黑色素瘤和非小细胞肺癌）的TCR。[0475]实施例5:同种异体T细胞工程技术[0476]γδΤ细胞是涉及抗病原体第一道防线的非常规T淋巴细胞效应子，可以通过启动受体等、TCR-γ和TCR-8链以MHC无关的方式与肿瘤细胞相互作用并根除肿瘤细胞。这些γδT细胞显示出预活化的表型，其在启动后可快速产生细胞因子（IFN-γ、TNF_a和发生强细胞毒性反应。这些T细胞对许多癌症具有抗肿瘤活性，并表明γδΤ细胞介导的免疫治疗是可行的并且可诱导客观的肿瘤反应。®razaetal.2013。[0477]使用固定化抗原、激动单克隆抗体mAb，肿瘤衍生的人造抗原呈递细胞aAPC或活化mAb和aAPC的组合的最新进展已成功地用寡克隆或多克隆TCR扩增γδΤ细胞谱。例如，固定化的主要组织兼容性复合体I类链相关A是表达TCRSl同种型的γδΤ细胞的刺激物，且板结合活化抗体已经离体扩增了νδΐ和νδ2细胞。在aAPC上共培养后，产生了临床上足够量的τα?δ1、τα?δ2和TCRSlnegTCI^2neg，并且这些亚组在体外和体内显示出记忆表型和对肿瘤反应性的差异。（Denigeretal.2014。[0478]另外，通过引入TCR-α和TCR-β链可以证明γδΤ细胞适于遗传修饰。（Hiasaetal.2009。本说明书的另一方面涉及表达与MAG-003结合的TCR-α和TCR-β的γδΤ细胞的产生。为此，γδΤ细胞通过Denigeretal.2014所述的方法扩增，接着将表达与MAG-003结合如实施例3所述的TCR的重组病毒转导入扩增的γδΤ细胞。然后将病毒转导的γδΤ细胞输注入患者。[0479]实施例6:MAG-003特异性TCR的安全性[0480]从健康供体的T细胞中分离和扩增三种MAG-003特异性TCRR7P1D5、R10P2G12、R20P1H7,参见表2，每种编码肿瘤特异性TCR-α和TCR-β链。根据之前描述的方法Walteretal.，2003JImmunol.，Nov15;17110:4974-8体外刺激来自健康供体的细胞，靶标特异性细胞使用HLA-A*02多聚体进行单细胞分选，然后进行随后的TCR分离。例如根据Green和Sambrook所著的分子克隆实验室手册第四版所述的标准方法通过5RACE分离TCR序列。对TCRR7P1D5、R10P2G12和R20P1H7的α和β可变区进行测序并克隆以进行进一步的菜单征。TCRR7P1D5、R10P2G12和R20P1H7源自HLA-A*02阳性供体。[0481]表13:靶细胞类型[0482][0483][0484]相关TCR通过RNA电穿孔在人T细胞中表达，并且在与不同靶细胞例如载有不同肽的T2细胞以及肿瘤细胞系和来自健康组织的原代细胞共培养后评估T细胞的IFN-γ释放情况。T细胞活化资料以绝对IFN-γ□水平或标准化方式显示如下。[0485]通过使用不同肿瘤细胞系作为靶细胞的T细胞活化研究（IFN-γ释放）测定表达TCRR7P1D5、R10P2G12和R20P1H7的CD8+T细胞的疗效。在与来自健康组织的分离原代细胞类型和来自HLA-A*02阳性供体的诱导多能干细胞iPSC来源的细胞类型共同培养后，通过测定TCR表达T细胞的潜在活化，逐步获得相关TCR的安全性特征的表征表13。细胞类型选择的方式是涵盖大多数关键器官，例如，脑、心脏和肝脏以及作为上皮、内膜或平滑肌的不同细胞类型。肿瘤细胞系被逐侧分析为阳性和阴性对照。[0486]IFNγ释放的标准化方法：[0487]平均值11。:《!'^。:1;。。=[平均值0'^。:1;。。-平均值0'^。:1;繼酑]-[平均值麵;。。广平均值騰ewxa好][0488]计算各自的CVn_:[0489]CVnormTCRoi；co—[CVTCRoi;c。）+CVTCRoi!¢8¾¾1+CV騰以;c。）+CV騰][12][0490]TCRoi=表达相关TCR的相应细胞[0491]模拟=无外源TCR表达的效应细胞[0492]Co=与靶细胞共培养的效应细胞[0493]仅效应子=未共培养的效应细胞[0494]平均值norm=平均IFNγ释放标准化）[0495]CVη_=变异系数标准化）[0496]结果：[0497]对于表达TCRR7P1D5、R10P2G12或R20P1H7的CD8+T细胞，在与来自健康组织的HLA-A*02阳性细胞类型共培养后未观察到活化参见图13，而对表达HLA-A*02和MAGEA4作为MAG-003肽源基因的肿瘤细胞系A-375和NCI-H1755有活性。在表达NYES01特异性TCR1G4的CD8+T细胞中观察到相似的反应性模式，该细胞被发现对表达HLA-A*02阳性肿瘤细胞系的NYES01具有反应性，但对指定的健康组织细胞组没有反应性。[0498]与表达HLA-A*02和MAGEA4的细胞系共培养后的T细胞活化反映了通过TCRR7P1D5、R10P2G12和R20P1H7识别内源表达和加工的靶标pHLA。[0499]安全性分析表明TCRR7P1D5、R10P2G12和R20P1H7对健康组织原代细胞没有非预期的交叉反应性，也没有潜在的同种异体反应性。这是值得注意的，因为检测的原代细胞类型在HLA-A*02的背景下代表数千个正常的HLA配体，并且可能还表示额外的同种异体HLA等位基因，这根据不同的正常细胞类型而不同。[0500]实施例7:本发明TCR的慢病毒表达[0501]在小规模ACTengine制造过程后从分离自健康供体的大量总体外周血单核细胞PBMC开始产生T细胞产物。基于以前的研究和多个临床试验Porteretal.，2011;Kalosetal.，2011;等等），设计了表达本发明用于制造ACTengineT细胞的R7P1D5TCR的慢病毒载体骨架。简要来说，解冻和静止PBMC用CD3CD28抗体活化，并用浓缩病毒上清液转导，所述上清液制备使用各种慢病毒载体，其载有含不同方向的α和β链以及各种启动子和增强子序列组合的R7P1D5TCR构建体示为R71-R78。8种构建体中有两种R74、R75由于滴度低和或产出率差而被消除。用剩余的6种病毒上清液转导的细胞被扩增，并通过流式细胞术方法评估转基因表达。[0502]方向如下：a-p:R71、R72、75、76;0-a:R73、R74、R77、78、IG4。[0503]所有T细胞产物均显示出相当的活力、淋巴细胞百分比以及⑶3+T细胞。⑶4和⑶8T细胞的百分比根据供体而不同。在所有6种病毒上清液中，毒性方面没有观察到差异。根据检测，LV-R73通过四聚体结合在表面一致地显示较高的TCR表达。基于转基因表达，慢病毒构建体排序如下:1?731?781?771?711?761?72图14。[0504]为了证实LV-R73病毒的转导性，进行了2个新供体的额外实验。所有实验中的转导细胞均进行了细胞因子释放时功能评估测试和杀伤测定。在所有测试的供体中，与NTT细胞相比，源自全PBMC的R73转导T细胞在与表达MAGE-A4抗原的A375细胞共培养后显示明显更高的IFNγ产生量（图15A。IFNγ反应具有严格的抗原特异性，因为在缺乏MAGE-A4表达的MCF-7细胞存在下诱导低于背景水平。另外，在两个供体中，EC5q值为10.ΟηΜ，该值源自代表应对MAG-003肽浓度降低检测到的IFNy量的T2滴定曲线（图15B。[0505]除细胞因子释放外，在4小时Cr51释放杀伤试验中测试了R73转导的T细胞产物。评估了提呈内源性加工MAG003肽的MAGE-A4+A375肿瘤细胞的识别和裂解情况。在所有E:T比例下，LV-R73T细胞显示出对NT细胞的杀伤增加（图16A、BA73转导的细胞中观察到的细胞毒作用以抗原特异性方式介导，因为在MAGE-A4+靶标中观察到的裂解百分比显著高于在MAGE-A4-靶细胞中观察到的百分比（图16C。[0506]参考文献列表[0507]AdairSJ?HoganKT2009.Treatmentofovariancancercelllineswith5-aza~2^deoxycytidineupregulatestheexpressionofcancer-testisantigensandclassImajorhisto-compatibiIitycomplex-encodedmolecules.CancerImmunol.Immunother.58?589-601.[0508]AlvesPM?LevyN?BouzoureneH?ViatteS?BricardG?AyyoubM?VuilleumierH，GivelJC，HalkicN，SpeiserDE，RomeroP，LevyF2007.Molecularandimmunologicalevalua-tionoftheexpressionofcancertestisgeneproductsinhumancolorectalcancer.CancerIm-munol·Immunother·56,839-847·[0509]AndradeVC，VettoreAL，FelixRS，AlmeidaMS，CarvalhoF，01iveiraJS，ChauffailleML，AndrioloA，Caballero0L，ZagoMA，ColleoniGW2008.Prognosticimpactofcan-certestisantigenexpressioninadvancedstagemultiplemyelomapatients.CancerImmun.8,2.[0510]AubryF，SatieAP，Rioux_LeclercqN，Rajpert_DeME，SpagnoliGC，ChomezP，DeB0,JegouB，SamsonM2001.MAGE-A4,agermcellspecificmarker?isexpresseddiffer-entiallyintesticulartumors.Cancer92?2778-2785.[0511]BarrowC，BrowningJ，MacGregorD，DavisID，SturrockS，JungbluthAA，CebonJ2006.Tumorantigenexpressioninmelanomavariesaccordingtoantigenandstage.ClinCaneerRes12,764_771.[0512]BellatiF，NapoletanoC，TarquiniE，PalaiaI?LandiR?ManciN?SpagnoliG，RughettiA，PaniciPB，NutiM2007.CaneertestisantigenexpressioninprimaryandrecurrentvuI-varcancerassociationwithprognosticfactors.Eur.JCaneer43，2621-2627.[0513]BergeronA，PicardV，LaRueH?HareIF，HovingtonH，LacombeL，FradetY2009.HighfrequencyofMAGE_A4andMAGE-A9expressioninhigh-riskbladdercancer.Int.JCaneer125,1365-1371·[0514]BhanS，ChuangA，NegiSS，GlazerCA，CalifanoJA2012.MAGEA4inducesgrowthinnormaloralkeratinocytesbyinhibitinggrowtharrestandapoptosis·OncolRep·28，1498-1502·[0515]BodePK，ThielkenA，BrandtS，BarghornA，LoheB，KnuthA，MochH2014.Cancertestisantigenexpressionintesticulargermcelltumorigenesis.Mod.Pathol.27?899-905.[0516]CabezonT?GromovaI，GromovP，SerizawaR，TimmermansW，V，KromanN，CelisJE，MoreiraJM2013.Proteomicprofilingoftriple-negativebreastcareinomasincombina-tionwithathree-tierorthogonaltechnologyapproachidentifiesMage_A4aspotentialthera-peutictargetinestrogenreceptornegativebreastcancer.Mol.CellProteomics·12，381-394·CessonV，RivalsJP，EscherA，PiotetE，ThielemansK，PosevitzV?DojcinovicD，MonnierP?SpeiserD?BronL?RomeroP2011.MAGE-A3andMAGE-A4specificCD4+T-cellsinheadandneckcancerpatients：detectionofnaturallyacquiredresponsesandidenti-ficationofnewepitopes.CancerImmunol·Immunother·60,23-35·[0517]ChambostH，VanBN，BrasseurF，GodelaineD，XerriL，LandiSJ，TheateI，PlumasJ，SpagnoliGC，MichelG，CouliePG，01iveD2000.ExpressionofgeneMAGE-A4inReed-Sternbergcells.Blood95,3530_3533.[0518]ChitaleDA，JungbluthAA，MarshallDS，LeitaoMM，HedvatCV，KolbD，SpagnoliGC，IversenK，SoslowRA2005.Expressionofcancer-testisantigensinendometrialcarci-nomasusingatissuemicroarray.Mod.Pathol.18?119-126.[0519]CoralS，ParisiG，NicolayHJ，ColizziF，DanielliR，FrattaE，CovreA，TavernaP，SigalottiL，MaioM2013·ImmunomodulatoryactivityofSGI_110，a5-aza-2-deoxycytidine-containingdemethyIatingdinucleotide.CancerImmunol·Immunother.62,605-614.[0520]CruzCR，GerdemannU，LeenAM，ShaferJA，KuS，TzouB，HortonTM，SheehanA，CopelandA，YounesA，RooneyCM，HeslopHE，BollardCM2011.ImprovingT-celltherapyforrelapsedEBV-negativeHodgkinlymphomabytargetingupregulatedMAGE-A4.ClinCancerRes17,7058-7066.[0521]CuffelC，RivalsJP，ZauggY，SalviS，SeelentagW，SpeiserDE，LienardD，MonnierP?RomeroP?BronL，RimoldiD2011.Patternandclinicalsignificanceofcancer-testisgeneexpressioninheadandnecksquamouscellcarcinoma.Int.JCancer128,2625-2634.[0522]DaudiS，EngKH，Mhawech_FaucegliaP，MorrisonC，MiliottoA，BeckA，MatsuzakiJ，Tsu-jiT，GromanA，GnjaticS，SpagnoliG，LeleS，0dunsiK2014.ExpressionandimmuneresponsestoMAGEantigenspredictsurvivalinepithelialovariancancer.PLoS.ONE.9?el04099.[0523]DuffourMT，ChauxP，LurquinC，CornelisG，BoonT，vanderBruggenP1999.AMAGE~A4peptidepresentedbyHLA-A2isrecognizedbycytolyticTlymphocytes.Eur.JImmunol.29?3329-3337.[0524]ForghanifardMM，GholaminM，FarshchianM，Moaven0，MemarB，ForghaniMN，Dad-khahE，NasehH，MoghbeliM，RaeisossadatiR?AbbaszadeganMR2011.Cancer-testisgeneexpressionprofilinginesophagealsquamouscellcarcinoma：identificationofspecifictumormarkerandpotentialtargetsforimmunotherapy.CancerBiolTher·12,191-197.[0525]GerdemannU?KatariU，ChristinAS?CruzCR，TripicT?RousseauA，GottschalkSM，SavoldoB，VeraJF，HeslopHE，BrennerMK，BollardCM，RooneyCM，LeenAM2011.CytotoxicTlymphocytessimultaneouslytargetingmultipletumor-associatedan-tigenstotreatEBVnegativelymphoma.Mol.Ther.19?2258-2268.[0526]GundaV，CogdillAP，BernasconiMJ，WargoJA，ParangiS2013.Potentialroleof5-aza~2^deoxycytidineinducedMAGE-A4expressioninimmunotherapyforahaplasticthyroidcancer.Surgery154,1456-1462·[0527]GureA0?ChuaR?ffilliamsonB?GonenM?FerreraCA?GnjaticS?RitterG?SimpsonAJ?ChenYT?OldLJ?AltorkiNK2005.Cancer-testisgenesarecoordinatelyexpressedandaremarkersofpooroutcomeinnon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权利要求：1.一种抗原识别构建体，其包含至少一个与选自SEQIDNO44、52、60、68、76和84的氨基酸序列至少具有80%的序列同一性的互补决定区CDR3。2.根据权利要求1所述的抗原识别构建体，其中所述抗原识别构建体能够特异性地和或选择性地与本发明抗原肽的TAA结合。3.根据权利要求1或2所述的抗原识别构建体，其中所述抗原识别构建体为抗体或其衍生物或片段、或T细胞受体TCI?或其衍生物或片段。4.根据权利要求1至3中任一项所述的抗原识别构建体，其中所述抗原识别构建体与人白细胞抗原HLA提呈的TAA抗原肽结合，其中所述HLA任选地为A*02型。5.根据权利要求1至4中任一项所述的抗原识别构建体，其中所述构建体特异性地和或选择性地与具有选自SEQIDNO:1-25、优选为SEQIDNO:1的氨基酸序列的表位结合。6.根据权利要求1至5中任一项所述的抗原识别构建体，其中所述构建体为αβ-TCR，或其片段或衍生物，或所述构建体为γS-TCR，或其片段或衍生物。7.根据权利要求1至6中任一项所述的抗原识别构建体，其特征在于，所述构建体为人源并特异性地和或选择性地识别TAA抗原肽。8.根据权利要求1至7中任一项所述的抗原识别构建体，其中所述抗原识别构建体能够在受试者中诱导免疫应答，任选地其中所述免疫应答的特征在于干扰素（IFNγ水平的增加。9.根据权利要求1至8中任一项所述的抗原识别构建体，其包含TCRa或γ链，和或TCRP或S链，其中所述TCRa或γ链包含与选自SEQIDNo.44、60和76的氨基酸序列具有至少80%序列同一性的⑶R3,和或其中所述TCRf3或δ链包含与选自SEQIDNo.52、68和84的氨基酸序列具有至少80%序列同一性的⑶R3。10.根据权利要求9所述的抗原识别构建体，其中所述TCRa或γ链还包含与选自SEQIDNo.42、58和74的氨基酸序列具有至少80%序列同一性的⑶Rl，和或与选自SEQIDNo.43、59和75的氨基酸序列具有至少80%序列同一性的⑶R2。11.根据权利要求9或10所述的抗原识别构建体，其中所述TCRP或δ链还包含与选自SEQIDNo.50、66和82的氨基酸序列具有至少80%序列同一性的CDRl，和或与选自SEQIDNo.51、67和83的氨基酸序列具有至少80%序列同一性的⑶R2。12.根据权利要求1至11中任一项所述的抗原识别构建体，其包含与选自SEQIDNo.41、49、57、65、73和81的氨基酸序列具有至少80%序列同一性的TCR可变链区。13.根据权利要求1至12中任一项所述的抗原识别构建体，其中所述构建体经人源化、嵌合化和或鼠源化。14.根据权利要求1至13中任一项所述的抗原识别构建体，其包含TCR的结合片段，其中所述结合片段包含CDRl至CDR3，CDR1至CDR3任选地选自具有SEQIDNo.42、43、44,或50、51、52，或58、59、60，或66、67、68，或74、75、76，或82、83、84的氨基酸序列的〇«1至〇1?3序列。15.根据权利要求1至14中任一项所述的抗原识别构建体，其中所述构建体是由至少一个TCRa和一个TCRP链序列组成的TCR或其片段，其中所述TCRa链序列包含具有SEQIDNO:42至44的氨基酸序列的⑶Rl至⑶R3序列，且所述TCRf3链序列包含具有SEQIDNO:50至52的氨基酸序列的⑶Rl至⑶R3序列，或其中所述TCRa链序列包含具有SEQIDN0:58至60的氨基酸序列的⑶Rl至⑶R3序列，且所述TCRf3链序列包含具有SEQIDN0:66至68的氨基酸序列的⑶Rl至⑶R3序列，或其中所述TCRa链序列包含具有SEQIDN0:74至76的氨基酸序列的⑶Rl至⑶R3序列，且所述TCRf3链序列包含具有SEQIDN0:82至84的氨基酸序列的⑶Rl至⑶R3序列。16.根据权利要求1至15中任一项所述的抗原识别构建体，其中所述构建体是包含至少一个TCRa和一个TCRP链序列的TCR或其片段，其中所述TCRa链序列包含具有SEQIDNo.41的氨基酸序列的可变区序列，且其中所述TCRP链序列包含具有SEQIDN0:49的氨基酸序列的可变区序列，或其中所述TCRa链序列包含具有SEQIDNo.57的氨基酸序列的可变区序列，且其中所述TCRP链序列包含具有SEQIDNo.65的氨基酸序列的可变区序列，或其中所述TCRa链序列包含具有SEQIDNo.73的氨基酸序列的可变区序列，且其中所述TCRP链序列包含具有SEQIDNo.81的氨基酸序列的可变区序列。17.根据权利要求1至16中任一项所述的抗原识别构建体，其中所述构建体是TCR或其片段，还包含与选自SEQID化.46、54、62、70、78和86的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、80、90%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的TCR恒定区，优选地，其中所述TCR由至少一个TCRa和一个TCRP链序列组成，其中TCRa链序列包含与SEQIDNo.46、62和78的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的恒定区，并且其中所述TCRP链序列包含与选自SEQIDNo.54、70和86的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的恒定区。18.根据权利要求1至17中任一项所述的抗原识别构建体，其包含与SEQIDNo.39的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的第一TCR链，以及与SEQID吣.47的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的第二TCR链。19.根据权利要求1至17中任一项所述的抗原识别构建体，其包含与SEQIDNo.55的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的第一TCR链，以及与SEQID吣.63的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的第二TCR链。20.根据权利要求1至17中任一项所述的抗原识别构建体，其包含与SEQIDNo.71的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的第一TCR链，以及与SEQID吣.79的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的第二TCR链。21.—种核酸，其编码权利要求1至20中任一项所述的抗原识别构建体。22.—种载体，其包含权利要求21所述的核酸。23.—种宿主细胞，其包含权利要求1至20中任一项所述的抗原识别构建体、或权利要求21所述的核酸、或权利要求22所述的载体。24.根据权利要求23所述的宿主细胞，其中所述细胞为淋巴细胞，优选为T淋巴细胞或T淋巴细胞祖细胞，更优选为CD4或CD8阳性T细胞。25.—种药物组合物，其包含权利要求1至20中任一项所述的抗原识别构建体、或权利要求21所述的核酸、或权利要求22所述的载体、或权利要求23或24所述的宿主细胞，以及药学上可接受的载体、稳定剂和或赋形剂。26.权利要求1至20中任一项所述的抗原识别构建体、或权利要求21所述的核酸、或权利要求22所述的载体、或权利要求23或24所述的宿主细胞、或权利要求25的药物组合物在药物中的用途。27.根据权利要求26所述的抗原识别构建体或核酸或载体或宿主细胞或药物组合物的用途，用于诊断、预防和或治疗增殖性疾病，其中所述疾病包括恶性或良性肿瘤疾病。28.根据权利要求27所述的抗原识别构建体或核酸或载体或宿主细胞或药物组合物的用途，其中所述肿瘤疾病的特征在于肿瘤疾病肿瘤细胞中的TAA表达。29.根据权利要求26至28中任一项所述的抗原识别构建体或核酸或载体或宿主细胞或药物组合物的用途，所述在药物中的用途是在任选地包含过继细胞转移的免疫治疗中的用途，其中所述免疫治疗包括过继自体或异源T细胞疗法。30.—种制备表达TAA特异性抗原识别构建体的细胞系的方法，包括a.提供合适的宿主细胞，b.提供基因构建体，其包含编码权利要求1至20中任一项所述的抗原识别构建体的编码序列，c.将所述基因构建体引入所述合适的宿主细胞，d.由所述合适的宿主细胞表达所述基因构建体。31.根据权利要求30所述的方法，还包括所述抗原识别构建体的细胞表面提呈。32.根据权利要求30或31所述的方法，其中所述基因构建体是包含启动子序列与所述编码序列可操作地连接的表达构建体。33.根据权利要求30至32中任一项所述的方法，其中所述抗原识别构建体为哺乳动物来源，优选为人来源。34.根据权利要求30至33中任一项所述的方法，其中所述合适的宿主细胞为哺乳动物细胞，任选地选自人细胞或人T淋巴细胞。35.根据权利要求30至34中任一项所述的方法，其中所述抗原识别构建体为修饰的TCR，其中所述修饰包括添加包含标记的功能结构域或包含膜锚定结构域的其他结构域。36.根据权利要求35所述的方法，其中所述抗原识别构建体为αβΤΟ?、γSTCR或单链TCRscTCR〇37.根据权利要求30至36中任一项所述的方法，其中所述基因构建体通过逆转录病毒转染而导入所述合适的宿主细胞。38.根据权利要求30至37中任一项所述的方法，还包括从所述合适的宿主细胞中分离和纯化所述抗原识别构建体，以及任选地在T细胞中重构所述抗原识别构建体。

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