申请/专利权人：浙江大学

申请日：2022-12-14

公开（公告）日：2023-03-31

公开（公告）号：CN115873903A

主分类号：C12N15/85

分类号：C12N15/85;C12N5/10;C12N15/57;C12N15/62;G01N33/68;G01N33/573

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2023.04.18#实质审查的生效;2023.03.31#公开

摘要：本发明涉及一种新型筛选靶向新冠病毒蛋白酶3CLpro活性系统的建立，属于分子生物学技术领域。本发明通过使用真核细胞表达载体VR1012表达N端和C端带有不同标签的部分ORF1ab序列作为检测质粒。将检测质粒和3CLpro表达载体在细胞中共转染，使用检测质粒表达序列2端的标签抗体，通过检测3CLpro切割后2端片段和全长未剪切片段的比例，体现3CLpro蛋白水解酶活性。本发明建立的检测系统检测灵敏度高，可以针对2种3CLpro剪切位点Q↓S，Q↓A进行检测。相比与已投入使用的FRET系统，能更好的模拟3CLpro发挥功能时底物肽段的空间结构，呈现天然情况下3CLpro的工作状况，为筛选以3CLpro为靶点的抗新冠病毒药物提供了另一种检测方式。

主权项：1.一种新型筛选靶向新冠病毒蛋白酶3CLpro活性系统的建立，其特征在于，包括以下步骤：从NCBI网站下载新型冠状病毒的序列，序列号为MN908947.3，用snapgene软件打开。根据文献中所报道，标明新冠病毒中的两个蛋白水解酶—PLpro和3CLpro在pp1a和pp1ab多聚体蛋白上的剪切位点；根据预测的蛋白组合大小和被3CLpro靶向切割后的蛋白大小，选择包含3CLpro靶向切割位点Q↓A的NSP9和NSP10肽段组合，选择包含3CLpro靶向切割位点Q↓S的NSP14-NSP15肽段组合；包含Q↓S的NSP14-NSP15氨基酸序列和包含Q↓A的NSP9-NSP10氨基酸序列；分别在NSP14-QS-NSP15和NSP9-QA-NSP10的N端添加Flag标签，C端添加Myc标签，用VR1012构建相应的NSP-QAQS表达载体，命名为Flag-NSP14-QS-NSP15-Myc和Flag-NSP9-QA-NSP10-Myc；筛选的主要步骤：S1.在A549Calu-3VEROHEK293T细胞中共转染3CLpro以及NSP-QAQS表达载体，加入小分子库药物；S2.收细胞，用WesternBlot检测NSP-QAQS总蛋白条带和被切割条带，ECL显像后，通过ImageJ软件定量所示的条带强弱，定义药物对3CLpro切割的影响；S3.以不加药物的细胞样本作为对照，根据NSP-QAQS总蛋白条带强度增加，被切割条带强度减弱，筛选靶向新冠3CLpro蛋白酶的潜在抗新冠小分子药物；系统的建立包括：1质粒表达载体的制备；2以HEK293T细胞为例进行系统的建立；3细胞铺板及质粒转染；4细胞裂解及蛋白提取；5蛋白定量；6Westernblot。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 浙江大学 一种新型筛选靶向新冠病毒蛋白酶3CLpro活性系统的建立

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