申请/专利权人：上海市第十人民医院

申请日：2020-05-29

公开（公告）日：2023-03-31

公开（公告）号：CN111621500B

主分类号：C12N15/113

分类号：C12N15/113;C12N15/90;C12N15/89;A01K67/027

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2023.03.31#授权;2020.09.29#实质审查的生效;2020.09.04#公开

摘要：本发明提供了一种基于MYL4基因编辑的心房颤动心房心肌病大鼠模型及其构建方法，该方法包括如下步骤：设计靶向野生型MYL4进行基因编辑相关的序列；体外制备sgRNA；体外制备Cas9mRNA；体外制备显微注射混合物；显微注射和胚胎移植；基因鉴定和筛选。本发明提供的基于MYL4基因编辑的心房颤动心房心肌病大鼠模型未见明显发育缺陷和成长缺陷，表型非常稳定，重复性高，是非常好的心房特异性心房心肌病动物模型，对房颤及心房心肌病的病理研究和新型治疗方案的评估具有十分积极的意义。

主权项：1.一种基于MYL4基因编辑的心房颤动心房心肌病大鼠模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一，设计靶向野生型MYL4进行基因编辑相关的序列：在大鼠MYL4基因的第1号外显子设计靶向于与人类MYL4点突变同源位点的sgRNA、ssODN单链寡核苷酸、sgRNAScaffold序列的引物和前体sgRNA序列；步骤二，体外制备sgRNA：PCR反应得到sgRNAscaffold产物；将获得的所述sgRNAscaffold产物与所述前体sgRNA进行重叠PCR反应以获得sgRNA转录前体产物；然后将所述sgRNA转录前体产物进行体外转录，并纯化得到sgRNA产物；步骤三，体外制备Cas9mRNA：使用限制性内切酶NotⅠ线性化SP6-Cas9质粒；纯化线性化的SP6-Cas9产物，并对其进行转录得到所述Cas9mRNA；步骤四，体外制备显微注射混合物：冰上将所述sgRNA、Cas9mRNA和ssODN混匀，制成显微注射混合物；步骤五，显微注射和胚胎移植：将所述显微注射混合物注入受精卵，培养后，将注射后的受精卵移植到假孕母鼠的输卵管中；步骤六，基因鉴定和筛选：将所述假孕母鼠饲养一段时间后，待其子代出生，采用PCR反应进行基因鉴定并筛选结果为基因型为阳性的子代；所述基因型为阳性的子代与野生型大鼠交配，待其子代出生后，进行基因鉴定并筛选，获得心房颤动心房心肌病大鼠模型；所述sgRNA序列包括方向为5’-3’的SEQIDNO:1和SEQIDNO:2。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 上海市第十人民医院 一种基于MYL4基因编辑的心房颤动/心房心肌病大鼠模型及其构建方法

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