申请/专利权人：广东唯泰生物科技有限公司

申请日：2019-10-12

公开（公告）日：2023-04-07

公开（公告）号：CN110564678B

主分类号：C12N5/077

分类号：C12N5/077

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2023.04.07#授权;2020.01.07#实质审查的生效;2019.12.13#公开

摘要：本发明提供一种脐带华通氏胶间充质干细胞成骨定向分化的方法，涉及干细胞与再生医学领域。该方法，包括组织消化、初代培养、传代培养和诱导培养等步骤；组织消化步骤中采用组织消化液进行组织消化，所述组织消化液中包括胶原酶I、DNA酶和Tryple；诱导培养步骤中采用成骨细胞分化诱导培养基进行诱导培养，成骨细胞分化诱导培养基包括α‑MEM基底液、血清替代物、地塞米松、β‑磷酸甘油、抗生素、细胞因子IL‑β、抗坏血酸和异黄酮。本发明的方法可以显著提高脐带间充质干细胞成骨细胞诱导分化效率。

主权项：1.一种脐带华通氏胶间充质干细胞成骨定向分化的方法，其特征在于，包括以下步骤：组织消化：将获取的脐带剪成2~3cm，用酒精浸泡1~3min，用组织保护液进行清洗，剥离脐带的静脉和动脉，分离出脐带华通氏胶组织；将脐带华通氏胶组织剪至1mm3以下的碎块，加入组织消化液消化28~32min，消化后在温度4±1℃、转速900~1100rpm下离心4~6min，去除上清液，保留沉淀，重悬，获得脐带间充质干细胞悬液；所述组织保护液由生理盐水、硫酸庆大霉素、两性霉素B和红细胞裂解液配制而成，其中硫酸庆大霉素的浓度为25μgmL，两性霉素B的浓度为5μgmL，红细胞裂解液的体积百分数为5%；所述组织消化液以Tryple为基底液，胶原酶I的浓度为0.2gmL，DNA酶的浓度为0.025mgmL；初代培养：向脐带间充质干细胞悬液中加入含有双抗的完全培养基，培养P0代细胞；所述培养P0代细胞时，温度为37±0.5℃，饱和湿度，CO2浓度为5±1%，培养时间为14~16天，培养期间每隔4~5天更换一次培养基；传代培养：初代培养后，去除培养液，清洗细胞，加入包括胰蛋白酶和EDTA的消化液进行消化，加入完全培养液终止消化，进行传代培养；所述消化液中胰蛋白酶的质量百分数为0.04%~0.06%，EDTA的质量百分数为0.003%~0.005%；所述传代培养过程中，当细胞融合度达到60%~70%时传代一次，传至P3代；诱导培养：取传代细胞，消化，终止消化，离心，去掉上清液，保留沉淀，向沉淀中加入完全培养基重悬，接种细胞悬液，培养至预定时间，更换为成骨细胞分化诱导培养基；细胞悬液的浓度为2×104个mL；所述成骨细胞分化诱导培养基中，血清替代物的质量百分数为10%，地塞米松的浓度为10nM，β-磷酸甘油的浓度10MmL，抗生素的质量百分数为1%，细胞因子IL-β的浓度为25ngmL，抗坏血酸的浓度为105mMmL，异黄酮的浓度为10μgmL；每隔2~4天更换一次成骨细胞分化诱导培养基。

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